全 文 ：园 　艺 　学 　报 　2008, 35 (10) : 1517 - 1520
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2008 - 06 - 16; 修回日期 : 2008 - 09 - 08
基金项目 : 国家 ‘863’计划项目 (2003AA207120)3 通讯作者 Author for correspondence ( E2mail: shuning@ njau1edu1cn, Tel: 025284395332)
同源四倍体青花菜离体再生及其倍性鉴定
张丽丽 , 张蜀宁 3 , 张红梅 , 侯喜林
(南京农业大学 , 作物遗传与种质创新国家重点试验室 , 南京 210095)
摘 　要 : 以同源四倍体青花菜带柄子叶为外植体 , 研究其离体再生体系。结果表明 : 10 d苗龄外植体
在 MS + 0105 mg·L - 1NAA + 310 mg·L - 1 62BA + 018% 琼脂 + 3% 蔗糖培养基上不定芽的再生频率最高为
6313% ; 继代培养 (MS + 0104 mg·L - 1 NAA + 410 mg·L - 1 62BA + 018% 琼脂 + 3% 蔗糖 ) 增殖系数为 6,
诱导 (1 /2MS + 011 mg·L - 1 NAA + 017% 琼脂 + 3% 蔗糖 ) 生根率 100% , 移栽成活率为 90%。流式细胞
技术分析及染色体计数鉴定结果表明 , 再生植株的 DNA相对含量为二倍体的 2倍 , 染色体数为 2n = 4x =
36。
关键词 : 青花菜 ; 同源四倍体 ; 带柄子叶 ; 再生 ; 流式细胞仪
中图分类号 : S 635　　文献标识码 : A　　文章编号 : 05132353X (2008) 1021517204
Regenera tion of Autotetraplo id Broccoli in V itro Culture and Iden tif ica tion of
the Plo idy
ZHANG L i2li, ZHANG Shu2ning— , ZHANG Hong2mei , and HOU Xi2lin
(S tate Key Laboratory of C rop Genetics and Germ plasm Enhancem ent, N an jing A gricu lture U niversity, N an jing 210095, Ch ina)
Abstract: The frequency of shoot regeneration in autotetrap loid broccoli was studied. Cotyledons with
petiole as exp lants were cultured on MS medium with different combinations of growth regulator. The effects of
growth regulator combinations on induction of shoots were evaluated. The op timal medium for inducting shoots
were MS media containing 018% agar and 3% sucrose supp lemented with 310 mg·L - 1 62BA , 0105 mg·L - 1
NAA. The shoot induction percentage was 6313%. Then each shoot was transp lanted on the MS medium
containing 0104 mg·L - 1 NAA and 410 mg·L - 1 62BA p roliferating about 6 times. The use of 011 mg·L - 1
NAA in the rooting medium increased the number of healthy roots per rooted p lant ( root ratio was 100% ).
The high2efficient shoot regeneration system of autotetrap loid broccoli were established and analyzed the p loidy
stability of regenerates using flow cytometry. The result showed that the tetrap loid relative DNA content was
about two times of control. The identified result of flow cytometry according to the chromosome analysis imp lied
the regeneration p lantlets keep the original p loidy.
Key words: broccoli; autotetrap loid; cotyledonswith petiole; in vitro culture; flow cytometry machine
青花菜 (B rassica oleracea L. var. ita lica Planch) 再生的研究已有报道 ( Takahata & Keller, 1991;
秦耀国 等 , 2005; Ying et al. , 2007)。南京农业大学作物遗传与种质创新国家重点试验室通过秋水
仙素诱导获得了同源四倍体青花菜新种质 , 其主要品质指标高于二倍体对照 (张杰 等 , 2006)。但
人工诱变的青花菜四倍体早期世代育性低 , 阻碍了同源四倍体青花菜的研究和利用。离体再生是保存
和扩繁新种质的有效途径。研究四倍体青花菜再生体系 , 为其理论研究和生产应用提供参考。
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1　材料与方法
试验于 2006年 4月 —2007年 10月在本实验室进行。四倍体青花菜 04J23由南京农业大学园艺学
院诱变二倍体青花菜 04J221 (‘春绿 ’) 获得。用 70%酒精对种子消毒 30 s, 011% HgCl2处理 20 m in,
无菌水冲洗 5次 , 接入无激素的 MS培养基 , 25 ℃、16 h /8 h、1 500～2 000 lx光强下培养。取 10 d
的带柄子叶插植在含不同浓度 NAA和 62BA的 MS (琼脂 018% , 蔗糖 3% ) 培养基 , 每处理 6瓶 , 每
瓶 5个外植体 , 重复 2次。15 d后统计愈伤组织诱导率 , 30 d后统计不定芽再生率 , 采用 Stst软件进
行方差分析。将获得的不定芽丛切成单芽继代培养 (MS + 0104 mg·L - 1 NAA + 410 mg·L - 1 62BA
+ 018%琼脂 + 3%蔗糖 ) , 20～30 d继代一次。继代后诱导生根培养 (1 /2 MS + 011 mg·L - 1 NAA
+ 017%琼脂 + 3%蔗糖 ) , 形成根系后 , 开瓶炼苗 48～72 h, 移入蛭石 ∶泥炭土 ∶珍珠岩 = 1∶2∶1的
基质中培养两周 , 植株长到 4～5片叶后移栽到大田 , 至开花结果采收种子。
取组培苗叶片参照张振超等 (2007) 的方法用流式细胞仪 (美国 Beckman公司 ) 测定 DNA含量。
取组培苗 110～115 cm的根尖在 0102 mg·L - 1的 8 -羟基喹啉中预处理 215～310 h, 卡诺液固定 8～24
h, 1 mol·L - 1 HCl 60 ℃解离 12 m in, 改良卡宝品红染色制片 , Zeiss Axioskop 40显微镜观察并拍照。
2　结果与分析
211　NAA和 62BA配比对不定芽再生频率的影响
接种外植体 (图版 , 1) 1周后 , 子叶柄基部膨大分化形成愈伤组织 (图版 , 2) , 3周后愈伤分
化出不定芽 (图版 , 3)。
图版说明 : 1. 外植体 ; 2. 愈伤组织形成 ; 3. 不定芽形成 ; 4. 继代培养 ; 5. 诱导生根 ; 6. 四倍体根尖染色体 ; 7. 植株驯化移栽 ;
8. 四倍体再生植株结球 ; 9. 花器官。
Explana tion of pla tes: 1. Exp lants; 2. Callus formation; 3. Bud regeneration; 4. Multip lication; 5. Shoot induced into roots; 6. Chromosome
from the needle of tetrap loid root; 7. Domestication and transp lantation p lantlet of broccoli; 8. Flower head formation in tetrap loid; 9. Flower
organ.
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　10期 张丽丽等 : 同源四倍体青花菜离体再生及其倍性鉴定 　
四倍体青花菜形成愈伤组织的频率均接近 100% (表 1) , 出芽途径是先形成愈伤组织再形成不
定芽 , 二倍体外植体少数是直接出芽途径。当 NAA与 62BA配比为 0101 mg·L - 1 + 9 mg·L - 1和 0105
mg·L - 1 + 610 mg·L - 1时 , 四倍体不定芽再生频率最高为 6513%和 6313% , 但前者形成畸形不定芽
较多。四倍体最佳培养基配方是 MS + 0105 mg·L - 1 NAA + 310 mg·L - 1 62BA + 018%琼脂 + 3%蔗糖。
表 1　同源四倍体青花菜带柄子叶在不同生长调节剂配比下不定芽的分化率
Table 1　Shoots d ifferen tia tion ra te of cotyledon s w ith petiole in d ifferen t com b ina tion of
growth regula tors in autotetraplo id broccoli /%
NAA /
(mg·L - 1 )
62BA /
(mg·L - 1 )
04J221 (2x)
愈伤组织诱导频率
Rate of callus
不定芽再生频率
Shoot regeneration frequency
04J220 (4x)
愈伤组织诱导频率
Rate of callus
不定芽再生频率
Shoot regeneration frequency
0101 013 8010 3115 ghiGH 8617 dB 313 eB
115 8410 2119 iH 9813 abA 2117 cdeAB
310 9010 4212 fghFG 10010 aA 3813 abcdAB
610 10010 4410 fghFG 10010 aA 3813 abcdAB
910 10010 3019 hiGH 10010 aA 6513 aA
0105 013 5216 4518 fgFG 9117 cdAB 1617 deAB
115 10010 5313 efEF 10010 aA 2117 cdeAB
310 10010 6010 deDEF 10010 aA 6313 aA
610 10010 9314 aA 10010 aA 4010 abcdAB
910 10010 7210 cdBCDE 10010 aA 5517 abA
0110 013 7510 7010 cdCDE 9210 bcdAB 1810 deAB
115 10010 9110 abAB 9510 abcAB 3010 bcdeAB
310 10010 9012 abABC 10010 aA 5211 abcA
610 10010 7815 bcABCD 10010 aA 4919 abcdAB
910 10010 7310 cdABCDE 10010 aA 5313 abcA
　　注 : 不同大小写字母表示在 0101和 0105水平上差异显著。
Note: The data with different letters indicate significant difference at 0105 or 0101 level.
212　再生植株的生根和移栽
继代培养表明 , 随着继代次数的增多四倍体增殖系数不断增大 , 1次继代后增殖系数为 214, 2
次后增殖系数为 3, 3次后增殖系数为 6 (图版 , 4)。诱导生根 2～3周后 , 植株基部长出大量白色粗
壮的根 , 生根率达 100% (图版 , 5)。开瓶炼苗后于 9月下旬移栽到大田 (图版 , 7) , 获得再生植
株 , 植株成活率达 90%。次年 4月开花结果 (图版 , 8、9) , 采收种子。
213　D NA流式细胞仪倍性分析及染色体鉴定
流式细胞仪倍性分析结果 (图 1) 表明 , 二倍体 DNA相对含量在 200附近 , 而再生植株 DNA相
图 1　青花菜二倍体和四倍体组培苗叶片的 D NA相对含量
F ig. 1　Curves of D NA rela tive con ten t of leaves of d iplo id and traplo id broccoli in vitro plan t
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对含量在 400附近 , 二者的比值约为 2, 表明再生植株是四倍体。染色体鉴定结果 (图版 , 6) 表明 :
根尖分生组织有丝分裂中期染色体数为 2n = 4x = 36, 证明再生植株是四倍体 , 与流式细胞仪分析结
果一致。
3　讨论
在培养基 MS + 0105 mg·L - 1 NAA + 310 mg·L - 1 62BA + 017%琼脂 + 3%蔗糖上同源四倍体青花
菜不定芽的再生频率为 6313% , 而二倍体 04J221的再生频率为 6010% , 二倍体在 NAA 0105 mg·L - 1
+ 62BA 610 mg·L - 1不定芽再生率最高为 9314% , 而四倍体再生频率只有 4010%。可见 , 四倍体不
定芽再生对激素浓度要求较低 , 高浓度的外源激素可能会抑制四倍体不定芽再生。孙敏红和张蜀宁
(2006) 研究二倍体、四倍体白菜再生能力与内源激素的关系发现四倍体白菜内源激素 ZRS和 IAA含
量高于其相应二倍体白菜。关于青花菜二、四倍体再生能力与内源激素的关系有待于进一步研究。
自然多倍体是漫长自然进化中形成的 , 育性正常、结实率高 ; 而人工多倍体选育和驯化世代有
限 , 育性低、结籽率低 , 阻碍了人工多倍体在生产上的应用。通过组织培养的途径可以保存多倍体 ,
使其利用成为可能。范适等 (2005) 通过对茄子体细胞融合杂种异源四倍体叶片离体培养 , 保存了
具野生种优良性状的体细胞杂种。四倍体随着继代次数增多继代系数显著提高。这可能是由于继代培
养增加了无性繁殖世代、育壮了再生植株 , 使其生理生化反应逐步协调 , 从而改善植株的生长和繁殖
状态 , 为结实率的提高奠定了基础 , 其内部调控机理有待于进一步研究。
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