全 文 ：园 　艺 　学 　报 　2006, 33 (1) : 73～77
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2005 - 04 - 05; 修回日期 : 2005 - 06 - 17
基金项目 : 河北省自然科学基金资助项目 (C2005000222)3 通讯作者 Author for correspondence
大白菜与结球甘蓝杂交获得异源三倍体及其生殖特
性的研究
顾爱侠　申书兴 3 　陈雪平　张成合　李晓峰
(河北农业大学园艺学院 , 保定 071001)
摘 　要 : 为创制大白菜 —结球甘蓝异附加系、异代换系、易位系 , 利用四倍体大白菜 (AAAA, 2n =
4x = 40) 为母本与二倍体结球甘蓝 (CC, 2n = 2x = 18) 杂交 , 采用蕾期去雄授粉、子房培养结合胚珠培养
的方法 , 获得了异源三倍体 (2n = 3x = 29, AAC) 杂交后代。该杂交种总体形态偏近于大白菜 , 但生长势
极强 , 株高 (开花期 ) 2 m; 花粉整齐度、花粉生活力都明显低于二倍体大白菜 ; 减数分裂行为复杂 , 终
变期除二价体和单价体外 , 还有三价体等联会形式 ; 与二倍体大白菜回交的平均结籽率为 3119%。
关键词 : 大白菜 ; 结球甘蓝 ; 种间杂交 ; 离体培养 ; 生殖特性
中图分类号 : S 63411; S 63511　　文献标识码 : A　　文章编号 : 05132353X (2006) 0120073205
A llotr iplo id Hybr ids O bta ined from In terspec if ic Hybr id iza tion between
Ch inese Cabbage and Cabbage and the Prelim inary Research on Reproduc2
tive Characters
Gu A ixia, Shen Shuxing3 , Chen Xuep ing, Zhang Chenghe, and L i Xiaofeng
(College of Horticulture, Hebei A gricu ltural U niversity, B aod ing 071001, China)
Abstract: A llotrip loid hybrids (2n = 3x = 29, AAC) were p roduced by crossing tetrap loid Chinese cab2
bage (B rassica cam pestris L. ssp. pekinensis AAAA, 2n = 4x = 40) and dip loid cabbage (B. oleracea var.
capita ta L. CC, 2n = 2x = 18) using overy and ovule culture method, which will be used for constructing Chi2
nese cabbage2cabbage addition lines, substitution lines and translocation lines. The allotrip loid hybrids were
sim iliar in morphological characters to Chinese cabbage, however the growth vigor was strong and the stem
elongated quickly up to a height of about 2 m at flowering stage. And the pollen regularity and activity of hy2
brids were lower than that of dip loid Chinese cabbage. The occurrence of diverse chromosome associations at
diakinesis such as trivalent, bivalent and univalent suggested that the pollen2mother2cellpis meiotic chromosome
behavior of hybridswas comp licated. The mean seed set derived from backcrossing by hybrids and dip loid Chi2
nese cabbage was 3119%.
Key words: Chinese cabbage; Cabbage; Interspecific hybridization; In vitro culture; Rep roductive
character
异附加系、异代换系、易位系是利用外源基因进行基因组研究的重要遗传分析材料 , 也是利用外
源基因进行品种改良的重要桥梁。曾有报道〔1〕芸薹属 A、C染色体组间具有同源性 , 通过染色体的易
位、重组和外源导入可获得新品种。但目前还没有关于大白菜 —结球甘蓝异附加系、异代换系、易位
系的研究报道 , 而该研究前提条件是获得大白菜和结球甘蓝的种间杂种。本研究利用四倍体大白菜和
二倍体结球甘蓝杂交 , 结合胚胎拯救 , 获得异源三倍体种间杂种 , 进一步将其与二倍体亲本回交获得
异附加系、异代换系、易位系 , 并对杂种后代生殖特性进行系统研究 , 分析两个染色体组的同源性。
园 　　艺 　　学 　　报 33卷
1　材料与方法
大白菜四倍体 (2n = 4x = 40) 品系 9402、9403、9405、9406, 二倍体 (2n = 2x = 20) 品系 01242
11 (白花 ) , 结球甘蓝二倍体 (2n = 2x = 18) 自交系 9501均由河北农业大学蔬菜育种研究室提供。
以大白菜四倍体 9402、9403、9405、9406为母本 , 开花前 1～2 d剥蕾去雄 , 授以二倍体结球甘
蓝 9501的花粉 , 套袋隔离。取授粉后 3、4、5、6、7、9、10 d的子房 , 表面消毒后 , 接种到 1号
(W hite培养基添加 IAA 115 mg/L、维生素 B1 0125 mg/L、生物素 0101 mg/L , 蔗糖 75 g/L、琼脂
018% , pH 518) 和 2号 (W hite培养基的大量、微量元素 , 添加 NLN培养基维生素 , pH 518, 抽滤
灭菌 ) 培养基上。置于温度 (22 ±2) ℃, 光强 1 500 lx, 光照 14 h的培养室中培养。培养 28 d后剥
出存活的胚珠接种到 1号、2号和 3号 (H idebrandt培养基的大量、微量元素 , MS培养基的维生素 ,
添加 62BA 112 mg/L, 2042D 01025 mg/L, pH 518) 培养基上培养。当幼苗长到 2～3片叶后 , 将其及
时转到壮苗培养基 (MS) 中培养 , 长到 4～5片叶时转到生根培养基 (1 /2MS + NAA 011 mg/L ) 上
培养 , 9月初移栽到阳畦 , 12月初定植于日光温室 , 常规管理。
染色体数的鉴定 : 去壁低渗 —火焰干燥法制片 , Gimesa (吉姆萨 ) 染色液染色 , 显微镜下观察
并照相。减数分裂的观察 : 常规压片 , P IHCH染色液 (丙酸铁 —水合三氯乙醛 —苏木精 ) 染色 , 显
微镜下观察并照相。花粉特性的观察 : 将新鲜花粉直接撒在载玻片上 , 显微镜下随机观察 , 记录畸形
花粉数和正常花粉数 , 统计花粉整齐度 ; TTC ( 2, 3, 5 - 氯化三苯基四氮唑 ) 染色法进行花粉生活
力测定〔2〕; 血细胞计数板计数 , 测定花药的花粉量。回交结籽能力的测定 : 以大白菜自交系 0124211
为父本与大白菜和结球甘蓝的杂交种进行杂交 , 记录授粉花数 , 成熟后统计种子数 , 计算结籽率
( % ) =平均种子数 /平均胎座 ×100。
2　结果与分析
211　不同培养基对杂种胚生长的影响
随子房培养时间的延长 , 角果逐渐黄化 , 培养 30 d左右绝大部分的果皮都已黄化 (图版 , 1)。
剥开果皮 , 绝大多数为早已夭折褐化的胚珠细胞 , 极少数胚珠还保持绿色但几乎看不到明显的膨大。
在 1号培养基上 , 培养不同时期子房的单角果平均胚珠成活率为 1411% , 而 2号培养基上的角果内
几乎没有绿色胚珠 , 极少数暗绿色胚珠在剥出后的数日培养中相继死亡。
212　不同取材时期对杂种胚生长的影响
不同发育时期的子房在 1号培养基上培养 28
d后 , 剥出的成活胚珠数有明显差别。
由表 1可知 , 取授粉后 5～7 d的子房进行离
体培养时 , 每个角果的平均成活胚珠数高 ; 授粉
后 3 d子房生长量小 , 无成活胚珠 , 这可能是由
于胚珠过小 , 依赖母体太强 , 而难以离体培养 ;
授粉后 10 d也难获得成活的杂种胚珠 , 这是由于
随着授粉后天数的延长 , 杂种胚已逐渐败育所致。
因此从取材时间上看 , 授粉后 5～7 d是子房培养
的适宜时期。
213　不同培养基对成活幼胚发育的影响 表 1　不同取材时期的子房在 1号培养基 3 上的成活胚珠数Table 1　Num ber of surv iva l ovules in d ifferen t develop ingpha ses on No. 1 m ed ium 3授粉后天数Days afterpollination ( d) 子房数Number ofoveries 成活胚珠数Number ofsurvival ovules 成活胚珠数 /角果Number of survivalovules/pod3 62 0 04 70 6 01095 68 18 01266 78 22 01287 65 16 01259 62 2 010310 50 0 0　　3 见表 2。See Table 2.
　　将剥出的成活胚珠 (图版 , 2) 接种于 1号、2号和 3号培养基上 , 胚珠的生长发育情况如表 2。
1号培养基上的胚成活率较低 , 而且胚的生长速度十分缓慢 ; 2号培养基上的胚珠逐渐褐化死亡 ; 3
号培养基上的胚珠成活率高 , 而且胚的生长速度较快。在 1号培养基上胚直接成苗 (图版 , 3) , 而
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　1期 顾爱侠等 : 大白菜与结球甘蓝杂交获得异源三倍体及其生殖特性的研究 　
在 3号培养基上通过愈伤组织途径成苗 (图版 , 4) , 而且 1个胚能分化出 2～4个芽 , 形成 2～4株苗
(图版 , 5)。可见 , 3号培养基适合胚珠发育成苗。
表 2　不同培养基对剥出胚珠生长的影响
Table 2　Effect of d ifferen t m ed ia on ovule from cultured ovary
培养基
Medium
培养胚珠数
Number of
ovules
成活胚珠数
Number of
Survival ovules
成活率
Survival
rate ( % )
成苗途径
W ays of
form ing p lants
1. W hite + IAA 115 mg/L +维生素 B1 0125 mg/L +生物素 0101 mg/L +蔗糖
75 g/L +琼脂 018% , pH 518
W hite + IAA 115 mg/L +V itam in B1 0125 mg/L +B iotin 0101 mg/L + Sucrose
75 g/L +Agar 018% , pH 518 21　　　 3　　　 1413　　　 胚 Embryo　　　
2. W hite的大量、微量元素 +NLN的维生素 , pH 518
Maoroelements and m icroelements from W hite +V itam in from NLN, pH 518 23　 0　 0　
3. H idebrandt的大量、微量元素 +MS的维生素 + 62BA 112 mg/L + 2042D
01025 mg/L, pH 518
Macroelements and m icroelements from H idebrandt +V itam in from MS +
62BA 112 mg/L + 2042D 01025 mg/L, pH 518 20　　　 16　　　 8010　　　 愈伤组织Callus　　
214　杂种鉴定
21411　形态学鉴定 　该杂种总体形态偏近于大白菜 , 但叶片较肥厚 , 叶面有蜡质则接近于结球甘蓝。
植株营养生长旺盛 , 株形开展 , 不包心 , 植株基生叶的基部有纵向排列的 4～6对翅状小叶 (图版 ,
6) , 茎生叶没有翅状小叶。花茎粗 , 花大 , 色泽鲜黄 , 花药较为饱满 (图版 , 7)。生殖生长时期分
枝十分旺盛 , 植株高达 2 m。各不同杂交组合的后代花期不尽一致 , 其中 9406 ×9501花期最晚 , 该
杂交后代生长势比其它杂交组合的明显弱。
21412　细胞学鉴定 　制片的镜检结果表明 , 四倍体大白菜和二倍体结球甘蓝杂种的根尖染色体数为
29条 (图版 , 8) , 为异源三倍体。
215　生殖特性
21511　减数分裂过程中染色体行为 　前人的研究〔3〕表明芸薹属 A、C基因组染色体间具有较高的同
源性 , 本研究通过减数分裂的观察也证实了这一点。减数分裂终变期 (图版 , 9) 出现 1～6个三价
体 , 其中 3个三价体的频率最高 , 约占观察总数 (205个细胞 ) 的 4015% , 其次是 4个三价体 , 约占
3415%。减数分裂中期 Ⅰ大多数染色体排列于赤道板上 , 少数游离于赤道板外 (图版 , 10) ; 后期 Ⅰ
有多种分离方式 (图版 , 11、12) , 其中 13216、14215、1421214分别占 34148%、24114%、6189% ,
其他类型占 34149%。后期 Ⅱ的分离方式更加复杂 , 有 132221321422214 (图版 , 13)、122121221622216
(图版 , 14) 等许多种分离方式。这种染色体分离的高度不均衡性 , 将会导致形成配子的多样性 , 为
创制整套的异附加系提供了可能。
21512　花粉特性 　由表 3可知 , 不同杂交组合后
代的单个花蕾的花粉量都明显高于二倍体大白菜 ;
花粉整齐度最高为 66149% , 最低的为 15153% ,
但相对于普通二倍体大白菜的花粉整齐度都低得
多。不同杂交组合后代的花粉生活力间存在明显
差 异 , 最 高 的 达 到 62119% , 最 低 的 仅 为
22111% , 但都明显低于二倍体大白菜。经比较发
现花粉生活力越高 , 花粉整齐度也越高 , 反之越
低。这表明一般形态正常的花粉是有生活力的 ,
而畸形的花粉基本上没有生活力。
表 3　种间杂种的花粉特性
Table 3　Pollen characters of in terspec if ic hybr ids
试材
Materials
花粉数 /花蕾
Pollen number/
bud
花粉整齐度
Pollen
regularity( % )
花粉生活力
Pollen
activity( % )
9402 ×9501 ( F1 ) 2170 ×105 65180 62119
9403 ×9501 ( F1 ) 1172 ×105 66149 49179
9405 ×9501 ( F1 ) 3100 ×105 60125 45100
9406 ×9501 ( F1 ) 3157 ×105 15153 22111
二倍体大白菜
Dip loid Chinese cabbage
1101 ×105
　
92192
　
90117
　
21513　回交结籽率及回交一代遗传特性 　不同杂种与二倍体大白菜回交的平均结籽率为 3119% , 花
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粉活力为 22111%的杂种结籽率为 118% , 普通二倍体大白菜结籽率为 45191% , 可见花粉整齐度和花
粉活力越高结籽率也越高 , 反之越低。回交一代植株生长势较杂种一代减弱 , 花蕾发育正常 , 花药饱
满。营养生长期植株均不包心但开展度不一致 ; 叶面有光滑和褶皱之分 , 而且褶皱程度不同 ; 叶面蜡
质程度有差别 ; 叶色有深绿和浅绿之分。生殖生长期花期不一致 ; 花大小略有差别 ; 花色有深黄、浅
黄和黄白色 ; 结籽能力不同。
3　讨论
大白菜与结球甘蓝的种间杂交是高度不育的 , 组织化学上的研究表明 , 胚乳 DNA及珠心中多糖
畸形分布等是白菜与结球甘蓝的杂种胚败育的生理基础〔4〕。许多研究也表明 , 其种间不亲和性主要
原因是杂种胚乳的败育〔5～7〕, 因此需要通过离体培养改善营养条件 , 在一定程度上克服这种不亲和
性。大白菜与结球甘蓝杂交时 , 授粉 4 d以前由于胚太小 , 难以离体培养 ; 授粉 10 d后 , 由于授粉后
时间的延长 , 组织间的不协调性逐渐暴露并激化 , 胚珠的生活力降低 , 使离体培养的难度增大 ; 授粉
后 5～7 d是子房培养的适宜时期 , 其主要原因可能是该时期胚对外部环境的要求有所降低 , 而且胚
乳败育还未影响到该时期胚的生长。
关于白菜与甘蓝的杂交 , 前人多采用的是二倍体白菜与二倍体甘蓝杂交得到异源二倍体杂种 , 再
进行染色体加倍获得异源四倍体〔8〕。本研究采用四倍体大白菜与二倍体结球甘蓝杂交 , 直接获得异
源三倍体 (AAC) , 由于 C基因组染色体的随机分离和落后染色体的丢失使其形成 ACn ( n = 1～9)
型配子 , 为用异源三倍体与二倍体大白菜回交得到异附加系提供了可能。本研究省去了染色体加倍和
1次回交 , 因此有可能加快合成大白菜 —结球甘蓝异附加系、异代换系、易位系的进程。
对 F1 杂种的减数分裂研究表明 A、C基因组染色体间存在部分同源性 , 两组染色体共存于 1个细胞
内 , 具有部分同源性的染色体形成三价体 , 这种非同源染色体的联会可能产生易位 , 同源性强的染色体
间也可能发生代换 , 这就有易位系、异代换系合成的可能性。而在甘蓝型油菜花粉母细胞中 , A、C两
个染色体组在减数分裂的各个时期均保持独立 , 且在减数分裂的前期Ⅰ中存在分裂速度上的差异〔9〕, 这
也就说明甘蓝型油菜在长期的进化中 , A、C染色体组的染色体间发生了染色体结构的分化。
回交子代的遗传特性高度分离 , 主要是由于附加了不同数量和种类的染色体所致 , 但究竟附加了
哪些染色体 , 以及不同染色体对遗传特性的效应则有待进一步研究。
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13 (4) : 418～421 ( in Chinese)
图版说明 : 1. 子房培养 28 d; 2. 子房培养后剥出的存活胚珠 ; 3. 形成子叶形胚 ; 4. 愈伤组织形成不定芽 ; 5. 愈伤组织形成多个
芽丛 ; 6. 杂种幼苗期 ; 7. 杂交种 (右 ) 与二倍体白菜 (左 ) 花 ; 8. 杂交种根尖染色体 2n = 29; 9. 终变期形成 4个三价体 ; 10.
中期Ⅰ 2条染色体游离于赤道板外 ; 11. 后期Ⅰ有 1条染色体落后 , 呈 1221216分离 ; 12. 后期 Ⅰ呈 14215分离 ; 13. 后期 Ⅱ呈 13222
1321422214分离 ; 14. 后期Ⅱ呈 122121221622216分离。
Explana tion of pla tes: 1. 28 d after overy culture; 2. Survival ovule after overy culture; 3. Cotyledonnary embryoid was formed; 4. Adventi2
tious budswere formed from callus; 5. A callus formed several adventitious buds; 6. Seedling hybrid; 7. Flowers of hybrid ( right) and dip loid
Chinese cabbage ( left) ; 8. A llotrip loid hybrid 2n = 29; 9. Four trivalent at diakinesis; 10. Two chromosomes dissociated away from equatorial
p late at metaphase Ⅰ; 11. Anaphase Ⅰ: 1221216; 12. Anaphase Ⅰ: 14215; 13. Anaphase Ⅱ: 132221321422214; 14. Anaphase Ⅱ: 122
121221622216.
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