全 文 ：© 1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net
园 　艺 　学 　报 　2007, 34 (2) : 361 - 365
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2006 - 12 - 18; 修回日期 : 2007 - 02 - 28
基金项目 : 国家自然科学基金项目 (30370983, 30400060) ; 科研院所社会公益研究专项项目 ( 2004D IB4J153) ; 农业部蔬菜遗
传与生理重点开放实验室项目3 E2mail: shiyanxia813@1631com; 3 3 通讯作者 Author for correspondence ( E2mail: libj@mail1caas1net1cn)
瓜枝孢弱致病菌诱导黄瓜植保素的积累及抑菌活性
石延霞 13 , 关爱民 1, 2 , 李宝聚 13 3
(1 中国农业科学院蔬菜花卉研究所 , 北京 100081; 2 河南大学生命科学学院 , 河南开封 456001)
摘 　要 : 瓜枝孢 (C ladosporium cucum ern ium ) 弱致病菌株 222A2诱导黄瓜产生对黄瓜黑星病的抗病性反
应。对经 222A2诱导后黄瓜叶片中提取的物质进行生物活性试验、硅胶板薄层层析、高效液相色谱分析 ,
证明 222A2可以有效诱导黄瓜中类黄酮类植保素的积累。
关键词 : 黄瓜 ; 弱致病菌 ; 诱导抗性 ; 植保素
中图分类号 : S 64212　　文献标识码 : A　　文章编号 : 05132353X (2007) 0220361205
Accum ula tion and Activ ity of Phytoa lex in s in Cucum ber Induced by Pa thoge2
n ic ity2im par ired Stra in of C ladosporium cucum ern ium
SH I Yan2xia13 , GUAN A i2m in1, 2 , and L IBao2ju1 3 3
(1 Institu te of V egetables and Flow ers, Chinese A cadem y of A gricultural Sciences, B eijing 100081, China; 2D epartm en t of
B iology, Henan U niversity, Kaifeng, Henan 456001, Ch ina)
Abstract: Effect of resistance of cucumber against C ladosporium cucum ern ium was induced by pathoge2
nicity2impaired strains ( P IS) 222A2. The toxicity of extracted compounds to C1cucum ern ium was carried out
successively by bioassay, thin2layer chromatogram s ( TLC ) and high performance liquid chromatography
(HPLC). The results showed that the effective ingredients were flavonoid phytoalexins and they could be in2
duced by P IS 222A2 in cucumber leaves.
Key words: Cucumber; Pathogenicity2impaired strain; Induced resistance; Phytoalexins
植物保卫素 (phytoalexin, 简称植保素 ) 是植物受到生物或非生物因子侵袭时在体内合成并迅速
积累的抗微生物活性的小分子化合物 , 在植物抗病过程中起着重要的作用 ( Sm ith, 1996)。对茄科和
禾本科植物中植保素的研究已很深入 ( Kokubun & Harborne, 1995 )。黄瓜植保素则是 Frawe等
(1998) 在研究硅诱导黄瓜抗白粉病的试验中首次发现的 , 葫芦科植物中也存在黄酮类植保素 ———鼠
李黄素。这一结果为在葫芦科植物中研究诱导抗病机理开辟了新的领域。
瓜枝孢 (C ladosporium cucum ern ium ) 导致黄瓜黑星病的发生 , 严重影响黄瓜的产量和质量。安全
有效防治方法的研究成为控制病害的重要发展方向 , 让黄瓜在病害发生期前获得免疫及抗病性 , 是实
现这一目标的重要手段。关爱民等 (2005) 筛选到的瓜枝孢弱致病菌株可以诱导黄瓜对黑星病的稳
定抗病性。研究瓜枝孢弱致病菌的诱导抗病性机理 , 可为开发真菌疫苗提供参考。
1　材料与方法
111　材料
供试黄瓜品种为 ‘山东密刺 ’。供试菌株为瓜枝孢强致病菌株 222和由其诱变筛选到的弱致病菌
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株 222A2 , 均由中国农业科学院蔬菜花卉研究所蔬菜病害综合防治组保存。
112　瓜枝孢弱致病菌的诱导抗病性试验
将黄瓜种子于 28℃恒温箱中催芽 , 播种于蛭石 ∶草炭为 1∶1的营养钵中 , 待幼苗长至 2片真叶期
用于抗性表达研究。将弱致病菌株 222A2在 PDA培养基上培养 5 d, 用蒸馏水配制成浓度为 4 ×107个 /
mL的孢子悬浮液 , 以喷雾法接种在 5 d苗龄的 100株黄瓜苗上 , 48 h后挑战接种相对应有活力的强
致病菌孢子悬液 , 接种浓度为 4 ×105个 /mL孢子悬浮液。接种强致病菌的 100株黄瓜苗植株设为对
照。挑战接种后 4 d调查发病情况。
植保素活性研究 : 将弱致病菌株 222A2在 PDA培养基上培养 5 d, 用蒸馏水配制成浓度为 4 ×107
个 /mL的孢子悬浮液 , 按不同时间均匀喷雾接种到黄瓜苗叶面上。包括 4个处理 : 只接种弱致病菌株
(A) , 只接种强致病菌株 ( T) , 弱致病菌株诱导后接种强致病菌株 (A + T) , 清水对照。每处理 3次
重复 , 每重复 15株黄瓜苗。于黄瓜苗 2片真叶期 , 以喷雾方式用 222A2诱导接种 , 诱导接种后分别于
24、48、72 h挑战接种 222, 挑战接种后 48 h取样进行植保素提取分析。
病情调查 : 0级 , 无病斑 ; 1级 , 病斑面积占整个叶面积的 10%以下 ; 3级 , 病斑面积占整个叶
面积的 11% ～25% ; 5级 , 病斑面积占整个叶面积的 26% ～50% ; 7级 , 病斑面积占整个叶面积的
51% ～75% ; 9级 , 病斑面积占整个叶面积的 75%以上。病情指数 = [ ∑ (各级病叶数 ×相对级数
值 ) / (调查总叶数 ×9) ] ×100; 防治效果 ( % ) = [ (对照病指 -弱致病菌株病指 ) /对照病指 ]
×100。
113　植保素提取液生物活性的测定
植保素提取与纯化参照 Daayf等 ( 1997) 的方法并稍有改动。用 3 mL甲醇溶解样品 , 浓缩至
1 mL用于抑菌试验。本研究中以每 100 mL 80%酸化甲醇浸提样品后浓缩量为 1 mL的植保素为原液 ,
记为植保素浓度 1% , 以下试验均采用该浓度提取液。
植保素提取液的活性测定采用平板抑菌圈法。配制瓜枝孢 222菌株孢子悬浮液 , 与 PDA培养基
混合。打取直径为 0145 cm的滤纸片 , 蘸取各处理植保素提取液 , 置于含菌平板中 , 每个处理提取的
植保素活性测定均设 4次重复 , 每个重复两皿。23℃恒温培养箱中黑暗培养 , 4 d后观察。
114　植保素提取液薄层层析 ( TLC) 分析及其抑菌试验
硅胶板为 GF254, 规格为 50 mm ×100 mm , 用前活化。点样量 10μL, 流动相为二氯乙烷 ∶乙酸
乙酯 = 7∶3。各处理点样后预饱和 20 m in, 于层析缸中进行薄层层析。层析后在 254、365 nm紫外灯
下观察 , 拍照。每批样品均重复 3次 , 以 3次重复的结果相近为标准。配制瓜枝孢 222孢子悬浮液 ,
混合微温未凉、含有少量琼脂的 PDA培养基 , 然后将混合物喷雾于进行过供试样品层析的薄层层析
板上 , 无菌条件下 23℃恒温黑暗保湿培养 , 2 d后观察抑菌效果。同一批样品的抑菌试验重复 2次 ,
以结果一致为准。
115　植保素提取液高效液相色谱 ( HPLC) 分析
色谱条件为 : 仪器为 Agilent 1100, 色谱柱为 Agilent C18柱 , 样品进样量 10μL, 柱温 30℃, 流
速 018 mL /m in, 柱压 167～185 ×105 Pa, 空跑柱压为 12～18 ×105 Pa。
紫外检测器检测 , 检测波长 272 nm, 带宽 16 nm , 参比波长 360 nm。流动相为甲醇 ∶水 = 2∶3
(272 nm , 335 nm为类黄酮类物质检测的特异波长 )。
样品 HPLC测定前 , 首先进行植保素提取的回收率检测 , 回收率测定条件与样品的测定条件一
致 , 当回收率达到 85%以上时进行整批样品的色谱分析。
分析结果用波峰面积表示 , 单位以毫吸光度 (mAu) 表示 , A = - lg ( T) 是 360 nm吸光度 , 无
量纲 , 以 A乘 1 000作为信号单位 , 因此称为 mAu。
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　2期 石延霞等 : 瓜枝孢弱致病菌诱导黄瓜植保素的积累及抑菌活性 　
2　结果与分析
211　瓜枝孢弱致病菌的诱导抗病性
瓜枝孢弱致病菌致病性有不同程度的降低 , 对本项目组前期筛选到的弱致病菌进行诱导抗病性试
验 , 发现瓜枝孢弱致病菌株 222A2诱导黄瓜对黑星病的抗病性效果明显 , 病情指数 2519, 诱导抗病效
果达到 6215% , 而强致病菌株 222的病情指数为 6910。
212　植保素提取液的生物活性
图 1显示 222A2诱导处理 (A)、222A2诱导后挑战接种 (A + T)、只接种强致病菌株的处理 ( T) ,
均在诱导后 48 h抑菌活性物质的含量最高。从图 1, a中可以看出 , 处理 A植保素的积累在 24 h时极
少 , 但在 48 h时就达到了最大值 , 其抑菌圈直径比清水对照大 66167%。从图 1, b中看到 A + T在
诱导后 48 h和 72 h接种的处理抑菌物质含量均较高。从图 1, c中看到处理 T在诱导接种 48 h抑菌
活性仍然很高 , 但在 72 h抑菌圈直径变小 , 抑菌物质活性成分积累量明显下降。
图 1, a、b、c中的清水对照植株中也有少量的植保素积累 , 也出现细小抑菌圈 , 这可能是健康
植株在受到喷水等外界刺激时 , 植株组织产生了应激反应 , 表现出植保素少量积累的结果。
图 1　瓜枝孢挑战接种后 48 h的植保素抑菌效果
a: 瓜枝孢弱致病菌株 222A2 诱导 (A) 24、48、72 h的处理 ; b: 222A2 诱导 (A) 24、48、72 h后又挑战接种 ( T) 的处理 ;
c: 强致病菌株 222接种 ( T) 24、48、72 h的处理 ; CK为清水对照。
F ig. 1　Fung itox ic ity of the extracted com pounds from leaves of cucum ber to C. cucum erium after cha llenge inocula tion for 48 h
a: Induced by P IS 222A2 strain (A) for 24 h, 48 h, 72 h; b: Challenging inoculation ( T) after induction for
24 h, 48 h, 72 h by 222A2 strain (A) ; c: Inoculated for 24 h, 48 h, 72 h by 222 strain ( T) ; CK: Control.
213　植保素提取液的 TLC分析
图 2的 A和 B分别为紫外波长 254 nm和 365 nm两种条件下跑板后的层析照片 , 图 2, C为在薄
层层析后的层析板上的植保素抑菌活性测定的结果照片。
从图 2, A、B可以看到 , 植保素提取液在薄层层析板上层析出 4个主要带斑 , 其中以弱菌诱导
后 48 h ( b泳道的 Rf值 014处 ) 和挑战接种后 72 h ( f泳道的 Rf值 014处 )、仅接种强菌 24 h ( g泳
道的 Rf 014处 ) 的带斑最明显 , 此层析带斑就可能为得到的植保素提取液最主要的活性物质 , 进一
步的抑菌活性试验将对该结果进行验证。
214　植保素提取液在层析板上的抑菌活性
从图 2, C中看到 , 图中灰黑色是瓜枝孢菌在层析板上正常生长繁殖 , 未出现瓜枝孢菌受抑制生
长的现象 , 白色的带斑处为图 2, A、B中 Rf值 013～110处出现的带斑 , 此处瓜枝孢菌受层析出的
成分抑制而无法正常生长 , 因此仍显示出层析板的白色底色。清水对照在 Rf值为 013、014有微弱的
白色抑菌带斑 , 而弱菌诱导的植保素提取液具有较大的白色抑菌带斑 , 尤其是弱菌诱导 48 h、72 h,
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白色抑菌带斑明显大于其它处理 , 这一现象表明植保素提取液在 Rf值为 013、014处层析到的物质具
有明显的抑菌活性。该提取液在 Rf值为 019、110也出现较弱的抑菌带斑 , 其活性低于 Rf为 013和
014处层析出的组份 , 因此初步确定弱菌诱导黄瓜产生 4种植保素。其中以 222A2诱导后 48 h出现的
组份抑菌活性最高 , 此处抑菌带斑最明显 , 该结果说明 P IS 222A2诱导后 48 h植保素积累量最大 , 此
结论与前面生物活性测定结果一致。
图 2　植保素提取液薄层层析效果及抑菌结果
A: 紫外波长 254 nm层析观察 ; B: 紫外波长 365 nm层析观察 ; C: 层析板上抑菌结果。
a到 j依次为弱菌诱导 24、48、72 h,
挑战接种 24、48、72 h, 仅接强菌 24、48、72 h, 清水对照。图中箭头所示为各层析带斑。
F ig. 2　Th in2layer chroma togram s and b ioa ssay ana lysis for eva lua ting the fung itox ic ity of extracted phytoa lex in s
A: Wavelength 254 nm; B: Wavelength 365 nm; C: Fungitoxicity of extracted phytoalexins on thin2layer plate.
a, b, c: Induced for 24 h, 48 h, 72 h by PIS 222A2; d, e, f: Induced and challenging inoculated for 24 h, 48 h, 72 h by 222; g, h, i: Inoculated
for 24 h, 48 h, 72 h by 222; j: Control. Arrow indicated the bands of thin2layer chromatograms and bioassay for evaluation of the fungitoxicity.
215　植保素提取液的高效液相色谱分析
　　根据黄瓜植株经诱导后合成的植保素主要为类
黄酮类物质的报道 ( Frawe et al. , 1998) , 以及高
效液相色谱对类黄酮类物质分析的特点可以知道 ,
液相色谱分析在流动相进行到 6～8 m in时 , 分离
到的成分应该为类黄酮类物质 , 如果该时间段出现
洗脱峰明显变化 , 说明植保素合成积累发生变化。
本试验中分别将瓜枝孢 222A2菌株诱导 24、
48、72 h以及再经挑战接种 222后的幼苗样品进
行高效液相色谱分析。结果发现 222A2诱导 24 h
后 , 处理 A出现一个小的洗脱峰 , 其他几个处理
间洗脱峰面积变化不明显 ; 在 222A2诱导 48 h后 ,
各处理间洗脱峰面积出现明显差异 , 以诱导后挑
战接种的处理 A + T在 61834 m in出现的洗脱峰面
积最大 ; 其次为仅 222A2诱导的处理 A 在 71719
m in出现洗脱峰面积较大 ; 处理 T在 61885 m in时
出现洗脱峰 ; 清水对照在 71728 m in出现洗脱峰 ,
其峰面积低于上述 3个处理 ; 在 222A2诱导 72 h
后 , 各处理均在 618～719 m in间出现洗脱峰 , 洗
脱峰面积间变化不明显 (图 3)。
图 3　上样 618～719 m in植保素高效液相色谱分析
CK: 清水对照 ; A: 瓜枝孢弱致病菌株处理 ;
T: 强致病菌株处理 ; A + T: 瓜枝孢弱致病菌株
诱导后挑战接种强致病菌。
F ig. 3　Peak area ana lysis of phytoa lex in s w ith HPLC a t
618 - 719 m in after sam ple load ing
CK: Control; A: Different time points of induction with PIS 222A2 ;
T: Inoculation with pathogenic strain 222; A + T: Challenged by
pathogenic strain 222 after induction with P IS 222A2.
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　2期 石延霞等 : 瓜枝孢弱致病菌诱导黄瓜植保素的积累及抑菌活性 　
　　此结果显示处理 A + T在色谱分析中出现洗脱峰的时间较早且洗脱峰变化明显 , 峰面积最大 , 因
此推断在诱导后 48 h再挑战接种的处理 (A + T) 中植保素的合成积累量最大 , 222A2诱导黄瓜植株
中植保素的积累 , 从而使黄瓜植株表现出诱导抗病性效果。
3　讨论
植物的次生代谢物起着重要的生理作用。植物受到病原菌的感染或外源物质的刺激后会启动相应
的防御反应系统。这种防卫绝大多数是利用体内已有的信号传导途径和代谢途径来传递防御反应信
号 , 植保素的合成多是已有代谢途径的延伸 , 在病原菌与寄主互作中 , 植保素的积累与植物抗病性密
切相关 ( Guo et al. , 1998; A rmero et al. , 2001; L iu & D ixon, 2001)。
在黄瓜的诱导抗病性中 , 植保素的积累是重要的抗病反应 ( Thomzik et al. , 1997; Tamogam i &
Kodama, 2000)。黄瓜植株受瓜枝孢弱致病菌株 ( P IS 222A2 ) 诱导后植保素积累情况的研究 , 初步明
确了瓜枝孢弱致病菌株在次生代谢物质方面存在的诱导抗病性。
根据 L iu和 D ixon (2001) 对葫芦科作物中存在类黄酮类植保素的研究结果 , 分析了瓜枝孢弱致
病菌株诱导黄瓜后产生的次生代谢物质 , 经平板抑菌圈法生物测定初步明确该物质具有明显的抑菌活
性。将该物质纯化后进行硅胶板薄层层析 , 结果在层析板上出现多个带斑 , 对该层析板上带斑进行杀
菌活性测定 , 发现在 Rf为 013、014、019和 110处各出现明显抑菌带 , 说明该提取物质可能存在至
少 4种抑菌活性成分。同时对该提取物质进行高效液相色谱分析 , 色谱图显示在 618～719 m in处出
现明显洗脱峰 , 波形面积成规律性变化 , 明确该物质为类黄酮类植保素。
本研究结果也从次生代谢方面初步明确了瓜枝孢弱致病菌株可以诱导黄瓜组织内植保素的合成积
累 , 对于增强寄主抗病性具有明显效果 , 为 P IS 222A2诱导抗病性积累的深入研究奠定了基础。
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