全 文 ：园 艺 学 报 2006, 33 (4) : 767～772
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2006 - 01 - 05; 修回日期 : 2006 - 06 - 24
基金项目 : 国家自然科学基金资助项目 (30400297, 30230250, 30235029) ; 浙江省自然科学基金资助项目 ( Y304366)3 通讯作者 Author for correspondence ( E2mail: jqyu@ zju. edu. cn )
黄瓜 cDNA芯片的构建及其在黄瓜缺镁胁迫下基因
差异表达研究中的应用
毛伟华 1, 2 龚亚明 3 宋兴舜 1 夏晓剑 1 师 恺 1 周艳虹 1 喻景权 13
(1 浙江大学园艺系 , 农业部园艺植物生长发育与生物技术重点开放实验室 , 浙江杭州 310029; 2 浙江大学分析测试中
心 , 浙江杭州 310029; 3 浙江省农业科学院蔬菜研究所 , 浙江杭州 310021)
摘 要 : 基因芯片技术在研究植物基因功能中发挥着越来越重要的作用 , 本试验通过 GenBank搜索已
发布的生物代谢途径中的关键酶基因序列 , 设计特异性引物 , 采用 RT2PCR法扩增这些酶的相应基因片段 ,
在完成 432个基因片段的克隆分离、测序和生物信息学分析工作的基础上研制出国内首张黄瓜 cDNA芯片。
该芯片含有 9个质控 cDNA片段和 423个 cDNA 探针 , 涉及光反应、卡尔文循环、碳水化合物代谢、水 -
水循环、信号传导、激素代谢、光呼吸、防御、蛋白与氨基酸代谢等多个代谢途径。利用该芯片对黄瓜缺
镁胁迫下基因表达谱进行了初步研究 , 并发现在缺镁胁迫下差异表达的 22个基因 , 其中 10个基因的表达
受缺镁处理抑制 , 12个基因的表达受缺镁处理诱导。该芯片的研制为进一步研究黄瓜功能基因的高通量时
空变化提供了有效的技术支撑。
关键词 : 黄瓜 ; cDNA芯片 ; 缺镁 ; 表达谱
中图分类号 : S 64212 文献标识码 : A 文章编号 : 05132353X (2006) 0420767206
Con struction of a Cucum ber cD NA M icroarray and Its Applica tion in the
Study of Respon se of Cucum ber Plan ts to M agnesium D ef ic iency Stress
Mao W eihua1, 2 , Gong Yam ing3 , Song Xingshun1 , Xia Xiaojian1 , Shi Kai1 , Zhou Yanhong1 , and
Yu J ingquan1, 3
(1D epartm ent of Horticu lture, Zhejiang U niversity, the M inistry of A gricultural Laboratory of Horticultural P lan t Grow th D evelop2
m ent and B iotechnology, Hangzhou, Zhejiang 310029, China; 2 Center of A na lysis and M easurem ent, Zhejiang U niversity, Hang2
zhou, Zhejiang 310029, Ch ina; 3 Institu te of Horticu lture, Zhejiang A cadem y of A gricu ltural Sciences, Hangzhou, Zhejiang
310021, Ch ina)
Abstract: M icroarray technology p lays increasing roles in the study of p lant gene function. By using
BLAST biosoftware and data from GenBank, the specific p rimers for key metabolism enzyme genes in cucum2
ber were designed, and the specific fragments amp lified by RT2PCR were cloned and sequenced. A total of
432 cDNA sequences corresponding to genes involved in photochewistry, carbon fixation, carbohydrate metab2
olism , water2water cycle, signal transduction , hormone metabolism, defense, photoresp iration and am ino acid
metabolism were obtained and categorized. A t last, a cDNA m icroarray with 423 cDNA fragments and 9 quali2
ty control cDNA fragments were built. The m icroarray was then used to study the changes of gene exp ression
p rofiles of cucumber p lants after exposure to magnesium starvation. The results showed that 10 genes were
down regulated, while 12 genes were up regulated in magnesium deficiency p lants. This m icroarray will p ro2
vide us a powerful tool for the study of gene function in response to a series of stresses.
Key words: Cucumber; cDNA m icroarray; Magnesium deficiency; Gene exp ression p rofile
基因芯片技术具有微型化、集约化和标准化的优点 , 在植物功能基因研究上显示出极为广阔的应用
前景。但开发大规模芯片昂贵的价格以及杂交后海样数据的分析处理限制了基因芯片技术在除拟南芥和
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水稻等模式植物以外的其它植物中的应用 , 因此针对这些植物制作小规模含有特殊性状基因的专用芯片
具有重要的意义〔1～4〕。最近国际上相继在包括烟草和番茄等植物上构建了多个含数十到数千基因克隆的
cDNA芯片 , 并在研究这些植物对干旱、热激、抗病虫等胁迫的响应机制中发挥了威力〔4～10〕。
植物对逆境胁迫的响应是一个复杂的过程 , 涉及光合作用、糖代谢、激素代谢等多种代谢途径 ,
是由一系列直接或间接作用的功能相关基因参与表达、调节、控制的结果。 cDNA芯片技术作为一项
快速、稳定、高通量检测基因表达的有力工具为较系统全面研究基因的行为和功能提供技术保证〔6〕。
为了较系统全面地研究黄瓜 (Cucum is sa tivus L. ) 对生物与非生物胁迫的响应机制 , 我们自 2002
年开始进行了黄瓜 cDNA芯片技术平台的构建研究工作 , 并研制开发出国内首张黄瓜 cDNA芯片。该
芯片含有 9个质控 cDNA 和 423个 cDNA 探针。缺镁会导致黄瓜叶片的光合速率和光合关键酶的活性
下降〔11～13〕。在此 , 我们报道黄瓜 cDNA芯片的研制及利用该芯片在研究缺镁胁迫下基因表达谱的变
化 , 以期为进一步拓展芯片技术在园艺植物上的应用提供借鉴。
1 材料与方法
111 材料与试验处理
供试黄瓜 (Cucum is sa tivus L. ) 品种为 ‘津研 4号 ’。精选一定数量的种子播种于草炭中 , 两片
子叶充分展开时移入 Hoaglang和 A rnon配方营养液中 , 在正常的光周期下于温室中培养。温度为 18
～25℃。期间每隔 5 d更换 1次营养液 , 三叶一心期时进行缺镁处理。处理以 2 mmol·L - 1 Na2 SO4代
替 2 mmol·L - 1 MgSO4 ·7H2 O, 其余成分同对照。
分别在处理后第 2天用 L I26400便携式光合测定系统测定了生长条件下第 2片叶的净光合速率
( Pn) , 测定光强为 600μmol·m - 1 ·s- 1 , 温度为 25℃, CO2浓度为 350μL·L - 1 , 并取第 2片叶作为
芯片杂交试验材料。
112 方法
11211 探针设计和制备 探针指点在芯片上的基因片段。参照 GenBank上所登录的生物代谢途径中
的关键酶基因序列设计特异性引物 , 委托上海博亚公司合成。采用 RT2PCR法扩增这些酶的相应基因
片段后〔14〕, 筛选这些基因片段的阳性克隆并进行序列测定〔15〕 (MageBACE1000 DNA测序仪测序 )。
最后根据与 GenBank已登录序列的比对结果 , 以质粒为模板 , M13正反向引物为引物 , 扩增芯片探
针 , 扩增条件为 94 ℃预变性时间 3 m in, 94 ℃ 1 m in , 54℃ 45 s, 72 ℃ 1 m in , 共 30轮循环 , 最后
1轮 72 ℃延伸 10 m in。反应结束后采用 018%琼脂糖凝胶电泳检查扩增结果。
采用乙醇沉淀法进行纯化。纯化后的产物以 ddH2 O溶解 , 采用 NanoD rop分光光度计检测浓度和
纯度。然后转入冷冻干燥仪中干燥。干燥完毕 , 每个样品孔中加入相应体积的 50%二甲基亚砜
(DMSO) , 使溶解后的 PCR产物终浓度为 250 ng·μL - 1左右。
11212 芯片点样 溶解均匀的探针在湿度为 50% ～60%的环境中采用 Genemachine点样仪进行点样。
点样分为 12个亚区 (矩阵 ) , 每个亚区点样密度为 12列 ×10行。每个探针重复点样 3次。点样完毕后 ,
在 400 mJ能量下采用交联仪 CL - 1000 U ltraviolet Crosslinker进行交联。最后芯片保存于干燥暗室备用。
11213 荧光探针的制备和杂交 提取缺镁处理和对照样本总 RNA, 采用 CyScribe First2Strand cDNA
Labeling kit (Amersham) 标记总 RNA , 处理组使用 Cy5 dCTP (脱氧胞苷三磷酸 ) 进行荧光探针标记 ,
对照组使用 Cy3 dCTP进行荧光探针标记 , 经纯化后荧光探针混合溶解在 4μL ddH2 O中。将荧光探针
95℃变性 2 m in, 迅速置于冰上。冷却后加入 1μL 1 mg·mL - 1寡聚腺苷酸 (poly A ) , 75℃孵育 45
m in, 最后加入 5μL 4 ×杂交缓冲液和 10μL甲酰胺 , 将混合液置于芯片上 , 用盖玻片覆盖 , 于密闭
杂交盒中 42℃杂交 18 h。杂交结束后 , 分别用 1 ×柠檬酸盐缓冲液 ( SSC)、012 % 十二烷基硫酸钠
( SDS) , 011 ×SSC、012 % SDS, 011 ×SSC清洗 , 最后于室温下浸入去离子水中 , 洗涤 1 m in。迅速
转入 50 mL空离心管中 , 1 500 r·m in - 1离心 5 m in, 甩干芯片。
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4期 毛伟华等 : 黄瓜 cDNA 芯片的构建及其在黄瓜缺镁胁迫下基因差异表达研究中的应用
11214 扫描和数据分析 用 GenePix 4100A芯片扫描仪扫描芯片 , 并采用图像分析软件 Gene Pix Pro
510对扫描结果进行定量分析。具体方法是首先经软件自动和人工定位与排列 , 确定杂交点的范围 ,
过滤背景噪音 , 提取得到基因表达的荧光信号强度值 , 而后对芯片上全部的数据点进行标准化 (Nor2
malization) 处理。将标准化后的 Cy5与 Cy3两种荧光信号强度相比 , 得到荧光信号强度比值 (Ratio
值 ) , 分别将 Ratio值大于 2和小于 015设定作为该基因点有明显上调表达和明显下调表达的指标 ,
015 < Ratio值 < 2视为该基因表达无明显变化。
同时 , 对标准化后的数据作 M (荧光强度比值的对数值 ) - A (总荧光强度对数值 ) 散点图 , 从而评
估芯片杂交质量 , 判断二者之间的相关性〔16〕, 其中 M = log2 Cy5 / Cy3, A = 1 /2 log2 (Cy5 ×Cy3)。
2 结果与分析
211 黄瓜 cD NA芯片探针的制备结果
通过 GenBank搜索已发布的生物代谢途径中的关键酶基因序列 , 设计特异性的引物 , 采用 RT2
PCR法扩增 , 获得了 432个相应的基因片段 (绝大部分已向 GenBank提交剩余基因片段序列 , 并获
登录号 ) , 根据测序和 BLAST比对结果 , 对获得的基因片段按功能进行了分类 (表 1)。这些基因片
段涉及光反应 (集光色素 a /b -结合蛋白、ATP合成酶δ亚基 1等 25个基因 )、卡尔文循环 (Rubsico
大小亚基、Rubsico活化酶等 14个基因 )、碳水化合物代谢 (蔗糖磷酸酶、磷酸蔗糖合成酶等 70个基
因 )、水 -水循环 (单脱氢抗坏血酸还原酶、胞液抗坏血酸过氧化物酶等 6个基因 )、信号传导 (钙
调蛋白、14 - 3 - 3蛋白等 15个基因 )、激素代谢 (ACC氧化酶、赤霉素 3 - 氧化酶等 35个基因 )、
光呼吸 (乙醇酸氧化酶、丝氨酸羟甲基转移酶等 4个基因 )、蛋白和氨基酸代谢 (谷氨酸合成酶、硝
酸还原酶等 50个基因 )、叶绿素合成途径 (Mg原卟啉 IX螯合酶 Mg、亚铁螯合酶 II等 7个基因 )、
抗病及防御基因 (苯丙氨酸解氨酶、PR蛋白 1 - 1a等 30个基因 ) , 运输相关基因 (ABC运输蛋白、
质膜 H + - ATP酶等 10个基因 )、以及看家基因 (2 -肌动蛋白、泛素类似蛋白等 8个基因 )。阴性对
照为 pUCM - T载体上的一部分序列。
表 1 黄瓜 cD NA芯片探针的组成
Table 1 C la ssif ica tion of probes spotted on the m icroarray
分类
Class
探针数目
Probe number
分类
Class
探针数目
Probe number
光反应 L ight reactions 25 蛋白和氨基酸代谢 Protein nd am ino acid metabolism 50
卡尔文循环 Carbon fixation 14 叶绿素合成途径 Chlorophyll biosynthesis 7
碳水化合物代谢 Carbohydrate metabolism 70 防御相关基因 Defense2related gene 30
水 - 水循环 W ater - water cycle 6 运输相关基因 Transport2related gene 10
信号传导 Signal transduction 15 看家基因 Housekeep ing gene 8
激素代谢 Hormone metabolism 35 阴性对照 Negative control 1
光呼吸 Photoresp iration 4 其它 O thers 157
212 黄瓜 cD NA芯片点样结果
黄瓜 cDNA芯片点制完成后 , 经扫描仪扫描 , 检查点样情况。图 1为芯片上 12个亚矩阵中的 1
个亚矩阵的扫描图像 , 由图可见 , 芯片点样形状规则 , 荧光背景低 , 3个重复点 (每行从左至右相邻
3个点为 3个重复 ) 大小形状基本上一致。点样总体成功率大于 99%。
213 缺镁处理第 2天黄瓜叶片光合速率和 cD NA芯片表达谱
处理第 2天 , 缺镁植株叶片的光合速率 (CO2 ) 为 710μmol·m - 1 ·s- 1 , 而对照植株的光合速率
(CO2 ) 为 912μmol·m - 1 ·s- 1。然后分别从不同处理的黄瓜叶片提取总 RNA , 制成荧光探针进行杂
交。通过对芯片杂交结果的扫描分析 , 获得了黄瓜芯片杂交图 (图 2)。杂交结果表明 , 22个基因的
表达明显受缺镁处理的影响 , 其中 10个基因的表达受缺镁处理抑制 , 12个基因的表达受缺镁处理诱
导 , 对这 22个基因的序列分析表明 , 其中 12个基因在 GenBank数据库中具有相似性 , 而另外 10个
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图 1 芯片点样情况扫描图例
该图为芯片上 12个亚矩阵中的 1个亚矩阵的
扫描图像 , 亚矩阵密度为 12列 ×10行 , 每行
从左至右相邻 3个点为同 1个探针的 3次重复。
F ig. 1 The scann ing image of the m icroarray
before hybr id iza tion
The image was one block of twelve in m icroarray,
its density was 12 column ×10 row, each p robe
was repeated three times from left to right
in each row.
为未知功能的新基因。下调基因包括参与
光合作用的编码 ATP合成酶 CFO B亚基
和 Rubisco大亚基的两个基因 , 参与代谢
的 NAD - 依赖苹果酸脱氢酶基因以及一
个编码叶绿体基因组 DNA 的基因 (表
2)。上调基因包括与防御逆境相关的编
码苯丙氨酸解氨酶的基因和陪伴蛋白基
因 ; 参与糖代谢的β -淀粉酶和半乳糖苷
合成酶基因 , 参与氮代谢的精氨酸代琥珀
酸合成酶和转氨酶 2基因 , 参与信号传导
的磷酯酰肌醇转移酶基因 , 以及脱氢多萜
醇二磷酸合成酶基因 (表 2)。
图 2 黄瓜 cD NA芯片双色荧光叠加图
缺镁处理和对照探针分别以 Cy5和 Cy3 dCTP进行标记 , 红色的点显示
该基因在缺镁处理中上调表达 , 绿色的点显示该基因在缺镁处理中下调
表达 , 黄色的点显示该基因在缺镁处理和正常条件下的表达水平接近。
F ig. 2 The overlay map of the 2 fluorescen t signa ls
on cD NA m icroarray of cucum ber
cDNA of magnesium deficiency leaf and CK were synthesized and labeled
separately with Cy5 and Cy3 dCTP. Red spot indicates high exp ression level
of a geneian magnesium deficiency leaf, green spot indicates low exp ression
level of a gene in magnesium deficiency leaf, yellow spot indicates no
significant difference between the two p lant tissues.
表 2 缺 M g胁迫下黄瓜上调和下调表达的基因
Table 2 D own2regula tion and up2regula tion of gene expression in cucum ber plan ts under magnesium def ic iency cond ition
登录号
GenBank accession number
比值
Average ratio
核酸 - 蛋白比对结果
Result of BLASTX
52851186 01351 NAD - 依赖苹果酸脱氢酶 NAD2dependent malate dehydrogenase
67511384 01383 ATP合成酶 CFO B亚基 ATP synthase CFO B chain
29337197 01413 Rubisco大亚基 R ibulose 1, 52bisphosphate carboxylase large subunit
67511388 01459 叶绿体基因组 DNA Chlorop last genome DNA
26451546 21066 磷酯酰肌醇转移酶 Phosphatidylinositol/phosphatidylcholine transfer p rotein
34014758 21075 转氨酶 2 Am inotransferase 2
215082058 21189 β -淀粉酶 Beta2amylase
129585 21212 苯丙氨酸解氨酶 Phenylalanine ammonia2lyase class Ⅱ
20259085 21288 精氨酸代琥珀酸合成酶 Putative argininosuccinate synthase
15240317 21309 陪伴蛋白 Chaperonin
15237748 31058 脱氢多萜醇二磷酸合成酶 Dehydrodolichyl diphosphate synthase
4106395 31102 半乳糖苷合成酶 Galactinol synthase
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4期 毛伟华等 : 黄瓜 cDNA 芯片的构建及其在黄瓜缺镁胁迫下基因差异表达研究中的应用
214 黄瓜 cD NA芯片杂交质量评估
M - A散点图是评估芯片杂交质量的一种方
式 , 它可以反应荧光信号强度比值是否随荧光信
号强度的变化而变化〔16〕。从图 3可见 , 信号点在
M = 0轴上下两侧分布较均匀 , 说明杂交比值是可
靠的 , 荧光信号比值不受荧光强度影响 , 出现假
阳性可能性低。
3 讨论
基因芯片技术主要包括芯片制备、样品的准
备、芯片杂交和检测分析等几个主要步骤〔17〕; 而
芯片制备则又包括探针的制备纯化和点样这 3个
步骤 , 其中探针的制备是最关键最基础的一
环〔18〕。所选探针是否具有代表性和特异性是决定
图 3 M - A散点图
M: 两种荧光强度比值的对数值 , A: 总荧光强度对数值 ,
其中 M = log2 Cy5 /Cy3, A = 1 /2 log2 (Cy5 ×Cy3)。
F ig. 3 M - A sca tter d iagram
M: log2 ratio of medians, A: log2 total intensity,
M = log2 Cy5 /Cy3, A = 1 /2 log2 (Cy5 ×Cy3).
芯片结果是否有意义的前提。RT2PCR法收集探针是一种快速简便制备基因芯片探针的有效方法〔18〕,
Tao等采用该方法成功地构建了一个包含 167个克隆的 cDNA芯片 , 并认为该法针对性强 , 可靠 , 成
本低 , 特别适宜于自制小规模 cDNA芯片〔2〕。本文采用 RT2PCR法收集探针 , 从测序和 B last结果分
析 , 收集的探针涉及了光合、糖代谢、抗氧化、抗病及防御等等数个代谢途径的关键酶 , 覆盖面较广
(表 1)。为了确保探针的特异性 , 我们通过 GenBank搜索已发布的生物代谢途径中的关键酶基因序
列 , 设计特异性的引物 , 采用 RT2PCR法扩增这些酶的相应基因片段 , 然后对这些基因片段进行克隆
分离 , 再运用 BLAST软件与 GenBank数据库核对测序结果 , 确认探针序列后才被采用 , 因而保证了
芯片上点样探针信息的可靠性。
利用自制芯片对黄瓜缺镁第 2天叶片基因表达谱进行了初步研究 , 以期研究短期缺镁处理对黄瓜
叶片基因表达的影响。芯片杂交结果表明 , 阴性对照和空白对照都无杂交信号出现 , 表明芯片具有很
好的特异性。从 M - A散点图分析 , 杂交荧光信号比值不受荧光强度影响 , 说明利用该芯片杂交具有
较高的可信度。通过标准化后的 Ratio值分析 , 芯片中有 22个基因的表达受缺镁处理影响 , 约占总数
的 5% , 其中 10个基因的表达受缺镁处理抑制 , 12个基因的表达受缺镁处理诱导。序列分析表明 ,
其中 12个基因在 GenBank数据库中具有相似性 , 而另外 10个为未知功能的新基因。在下调的基因
中 , 我们发现 2个与光合作用有关的基因 : ATP合成酶 CFO B亚基和 Rubisco大亚基 , ATP合成酶由
CFO和 CF1两部分组成 , 是光反应中光合磷酸化的关键酶 , 而 Rubisco是催化卡尔文循环的第一步反
应 , 是暗反应的限速酶和关键酶。缺镁导致光合作用中这两个基因在转录水平的下调 , 从而在光反应
和暗反应两个阶段抑制了黄瓜光合作用的进行 , 与实际所测的光合速率下降这一现象相符。此外 , 还
发现了其它与缺镁胁迫相关的基因 , 它们在缺镁胁迫后表达量变化明显 , 对它们的研究可能有助于进
一步了解黄瓜缺镁机理。
综上所述 , 作者已初步建立具有代表性较强、覆盖较全面、可信度高的黄瓜 cDNA芯片和适于该
芯片的杂交体系及信号检测体系 , 为较系统全面地研究黄瓜功能基因开辟了一个崭新的技术平台。
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