全 文 ：园 　艺 　学 　报 　2007, 34 (1) : 81 - 86
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2006 - 07 - 12; 修回日期 : 2006 - 12 - 11
基金项目 : 广东省自然科学基金资助项目 (031995, 5300966) ; 广东省科技计划项目 ( 2005B20901017) ; 广东省农科院博士启
动项目 (2005008)3 通讯作者 Author for correspondence ( E2mail: weid18@1631com)
Picloram, ABA和 TDZ对香蕉体细胞胚胎发生的影响
魏岳荣 1, 2 , 杨　护 1 , 黄秉智 1 , 黄　霞 2 , 黄学林 2 , 邱继水 1 , 许林兵 1
(1 广东省农业科学院果树研究所 , 广州 510640; 2 中山大学生命科学学院教育部基因工程重点实验室 , 广州 510275)
摘 　要 : 研究 Picloram、ABA和 TDZ对贡蕉未成熟花序来源的胚性细胞悬浮系体细胞胚胎发生的影响。
结果表明 , 8128μmol/L Picloram替代 2, 42D可获得 15156%的胚性愈伤组织诱导率 ; 在体细胞胚诱导初期
加入 ABA则抑制体细胞胚的发生 , 并造成其萌发时严重愈伤化 ; TDZ可有效地改善体胚萌发率和植株转换
率 , 其中 012μmol/L TDZ处理的体胚萌发率和植株转换率分别从对照的 17128%、16149%提高到 72177%
和 67105%。
关键词 : 香蕉 ; 体细胞胚胎 ; Picloram; ABA; TDZ
中图分类号 : S 66811　　文献标识码 : A　　文章编号 : 05132353X (2007) 0120081206
Effects of P icloram, ABA and TD Z on Soma tic Em bryogenesis of Banana
W E I Yue2rong 1, 2 , YANG Hu1 , HUANG B ing2zhi1 , HUANG Xia2 , HUANG Xue2lin2 , Q IU J i2shui1 , and
XU L in2bing1
(1 Fru it R esearch Institu te, Guangdong A cadem y of A gricu ltura l Sciences, Guangzhou 510640, China; 2 The Key L aboratory of
Gene Engineering of M inistry of Education, School of L ife Sciences, Zhongshan U niversity, Guangzhou 510275, China)
Abstract: Establishment of a stable embryogenic cell suspension ( ECS) is a p rerequisite for biotechno2
logical breeding of banana. A lthough many important p rogress has been made, but app lication of embryogenic
cell suspension for genetic imp rovement ofM usa is lim ited because of low induction percentage of embryogeno2
ic callus, low conversion frequence of p lant regeneration from the somatic embryos. Therefore, an op timal p ro2
tocol for embryogenic cell suspensions is still required to establish. In this study the effects of Picloram, ABA
and TDZ on somatic embryogenesis of banana from young male flower ofM usa acum ina ta cv. Mas (AA) were
investigated. Results showed that the induction percentage of embryogenic calli reached 1516% when 2, 42D
in the callus induction medium was substituted by 8128μmol/L p icloram. However, the addition of ABA into
somatic embryo development medium inhibited somatic embryogenesis from embryogenic cell suspension and
resulted in callus formation from somatic embryos. Treatment with TDZ at concentration of 012μmol/L resul2
ted in increase of the percentage of germ ination of somatic embryos from 17128% to 72177% and the p lant
conversion ratio from 16149% to 67105% , respectively.
Key words: Banana; Somatic embryogenesis; Picloram; ABA; TDZ
近 20年来香蕉体细胞胚胎发生的研究已取得了一定成功 , 并建立了少数品种或品系的胚性细胞
悬浮系 ( Embryogenic cell suspensions, ECS) ( Cote et al. , 1996; Grap in et al. , 1996; Jalil et al. ,
2003; 魏岳荣 等 , 2005a, 2005b, 2006)。但和双子叶植物以及其它具有种子的单子叶植物相比 , 香
蕉的胚性发生非常困难 : (1) 外植体的胚性反应低 (通常低于 5% ) , 且受基因型、季节、培养条件
等多因素的影响而具有不稳定性 ; (2) 诱导获得的胚性愈伤组织只有 20% ～50%能建立理想的具有
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再生能力的 ECS; (3) 建立 ECS所耗时间太长 (10～18个月 ) ; (4) 虽然可诱导获得大量的体细胞
胚 , 但萌发率和植株再生率低、胚性易丢失等问题制约了其应用 ( Strosse et al. , 2003; 魏岳荣 等 ,
2003)。因此 , 进一步改善外植体的胚性反应、提高体细胞胚的质量和植株转换率成为研究的重点。
大量研究表明 , Picloram (42am ino23, 5, 62trichlorop icolinic acid) 对小麦等多种植物的胚性发生
以及胚性愈伤组织的胚性和全能性的保持 ( Eapen & George, 1990; V ishnoi & Kothari, 1996; He &
Lazzeri 2001)、ABA对植物体细胞胚的发生和发育 ( Thorpe, 1995; 崔凯荣 等 , 2000)、TDZ ( Thidi2
azuron) 对植物组织培养芽的形成 ( Gairi & Rashid, 2004; L in et al. , 2004) 等方面具有重要的生理
作用 , 但在香蕉的体细胞胚胎发生上尚未见相关报道。本文初步探讨了 Picloram对香蕉胚性愈伤组织
诱导及其悬浮培养 , ABA和 TDZ对香蕉 ECS诱导体细胞胚及其萌发和植株再生的影响 , 以期为香蕉
ECS体系的改良提供参考。
1　材料与方法
111　材料及培养条件
供试香蕉为贡蕉 [M usa acum ina ta cv. Mas (AA) ] , 取自广东省农业科学院果树研究所 “国家果
树种质 —广州香蕉圃 ”。除悬浮培养基 (ML) 在灭菌前调整 pH为 513外 , 其余培养基 pH均为 518,
然后在 121℃下灭菌 15 m in。Picloram和 ABA以无菌水溶解后过滤灭菌 , TDZ以二甲基亚砜溶解 , 分
别待培养基灭菌、冷却至 40℃后加入并分装。愈伤组织诱导与增殖、悬浮培养、体细胞胚的诱导和
成熟在 (28 ±1) ℃黑暗下进行 , 体细胞胚的萌发和生根在 (28 ±1) ℃、30μmol/ (m2 ·s) 光强 (白
色荧光灯 )、16 h /8 h光周期下进行。胚性细胞悬浮培养保持在持续 110 r/m in的旋转摇床上进行。
112　P icloram诱导未成熟雄花胚性愈伤组织的试验
外植体未成熟雄花的选择与处理以及愈伤组织的诱导参照魏岳荣等 (2005b) 的方法。以愈伤组
织诱导培养基 (M I) 作对照 , 即 MS + 9μmol/L 2, 42D + 411μmol/L 生物素 (B IO ) + 517μmol/L
IAA + 514μmol/L NAA + 87 mmol/L蔗糖 + 7 g/L琼脂粉。以 Picloram 4114、8128和 16156μmol/L
替换 M I中的 2, 42D。各处理重复 3次 , 每重复接种 5个外植体 , 剥取花序 1～15号位置的小花梳 ,
共计 75个 , 即每处理共接种 225个未成熟小花梳。诱导培养 150 d时统计愈伤组织诱导率。
113　胚性细胞悬浮系的建立和培养
参照魏岳荣等 ( 2005b) 方法进行。取胚性愈伤组织约 2 g, 加入到装有 30 mL 液体培养基
(ML) 的 100 mL锥形瓶中。ML培养基组成为 : MS基本培养基 + 415μmol/L 2, 42D + 411μmol/L
B IO + 680μmol/L谷氨酰胺 + 100 mg/L麦芽提取物 (ME) + 130 mmol/L蔗糖。
114　ABA诱导体细胞胚发生和萌发的试验
参照魏岳荣等 (2005b) 方法进行。在体细胞胚诱导培养基 (MSD ) 中添加 1189、3179和 7158
μmol/L的 ABA。MSD组成为 : SH培养基 ( Schenk & H ildebrandt, 1972) 中的大量元素和微量元素
及其铁盐 +MS维生素 (Murashige & Skoog, 1962) + 415μmol/L B IO + 680μmol/L 谷氨酰胺 + 2
mmol /L脯氨酸 + 100 mg/L ME + 111μmol/L NAA + 012μmol/L ZT + 015μmol/L KT + 017μmol/L 22ip
+ 29 mmol/L乳糖 + 130 mmol/L 蔗糖 + 2 g /L Gelrite。定期观察 , 60 d后测定培养物的总质量。随机
称取其中一定质量的样品后 , 在解剖镜下统计体胚数。随后在相同培养基中继续促成培养 30 d。取成
熟培养 90 d后的体细胞胚置于 MG培养基 〔MS大量元素和微量元素及其铁盐 (Murashige & Skoog,
1962) +Morel and W etmore维生素 (Morel & W etmore, 1951) + 012μmol/L BAP + 111μmol/L IAA
+ 87 mmol/L蔗糖 + 2 g/L Gelrite〕中萌发 , 30 d后统计体细胞胚的萌发率。
115　TD Z诱导体细胞胚萌发和植株再生试验
取在 MSD培养基中培养 90 d的成熟体细胞胚用于萌发试验 , 以含 BAP的 MG培养基作对照。以
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　1期 魏岳荣等 : Picloram, ABA和 TDZ对香蕉体细胞胚胎发生的影响 　
TDZ替代 BAP的 MG培养基作为处理 , TDZ浓度为 011、012和 015μmol/L。各处理重复 3次 , 每个
重复接种 5个培养皿 , 每个培养皿分装 30 mL培养基 , 接种 18个成熟体细胞胚 , 30 d后统计体细胞
胚的萌发率。各处理随机挑选 60个萌发的体细胞胚转移到 MR培养基 (不含任何植物生长调节剂的
MG基本培养基 ) 中生根 , 30 d后统计植株转换率。
2　结果与分析
211　P icloram对贡蕉未成熟雄花胚性愈伤组织诱导和悬浮培养的影响
未成熟雄花花梳 (图版 , 1) 在对照 (含有 9μmol/L 2, 42D ) 培养基中诱导培养 10 d后 , 1～5
号位置的花梳大部分褐化死亡 , 6～12号则开始膨大 , 初期主要为花瓣伸长生长 , 花序轴和子房则变
化很小。苞片膨大明显 , 边缘愈伤化呈白色致密状 , 后期褐化死亡。花序轴诱导产生白色松软并富含
水分的愈伤组织 , 继代培养时易褐化死亡。这种由苞片和花序轴所产生的愈伤组织为非胚性愈伤组
织。50～60 d后 , 在小花基部开始出现乳白色或浅黄色圆球形、质地致密的分生小球体 (图版 ,
2a)。继续培养 2～3个月 , 部分分生小球体旁出现松散易碎的浅黄色愈伤组织 (图版 , 2b)。将其分
离、继代和筛选培养可得到大量浅黄色、松散易碎、表面含有少量白色体细胞胚的胚性愈伤组织
(图版 , 3)。13～15号甚至更高位置的花梳主要表现为不断伸长和膨大生长 , 60 d后褐化死亡 , 有时
也产生愈伤组织和少量分生小球体。
以 Picloram替代 2, 42D时 , 未成熟小花梳的形态特征变化较大 , 前期明显膨大 , 褐化程度大大减
少。苞片和花瓣形成白色软泥状愈伤组织 (图版 , 4 ) , 花序轴诱导出白色致密的愈伤组织 (图版 ,
5) , 两者在后期继代培养中都易褐化死亡 , 而小花子房部分则可诱导出浅黄色的胚性愈伤组织 (图
版 , 6) , 或直接诱导出白色体细胞胚 (图版 , 7) , 未见 2, 42D诱导获得分生小球体。愈伤组织分离继
代培养时 , 可获得大量的增殖 (图版 , 8) , 比 2, 42D诱导后继代获得的胚性愈伤组织含水量高。
由图 1可见 , 对照的胚性愈伤组织诱导率为 7156% , 当 Picloram为 4114μmol/L时 , 胚性愈伤组
织诱导率只有 2167%。当 Picloram为 8128、16156μmol/L时 , 诱导率达 15156%和 16144% , 均比对
照高出 1倍以上。可见 , 合适浓度的 Picloram能有效提高外植体未成熟雄花的胚性反应。
将 2, 42D和 Picloram诱导获得的胚性愈伤组织分别置于 ML液体培养基中启动悬浮培养时 , 两者
的胚性愈伤组织在摇床的振荡下都容易散开 , 但由 Picloram诱导的在 3 d内出现较严重的褐化 , 而
2, 42D诱导的则未观察到褐化现象 , 可能与愈伤组织的含水量偏高有关。每 5 d更换一次新鲜培养基 ,
20 d后褐化组织又能长出浅黄色的小颗粒愈伤团 , 并随培养时间的延长逐渐增殖。将新增殖的浅黄
色愈伤团挑出后重新启动悬浮培养 , 3个月后即可建立起稳定均质的胚性细胞悬浮系 (图版 , 9)。
212　ABA对贡蕉 ECS体细胞胚诱导和萌发的影响
结果表明 , ABA抑制体细胞胚的发生 , 且随浓度的递增 , 抑制作用增强 , 体胚数量递减。3179
和 7158μmol/L ABA处理的体胚数分别为 94 ×103和 86 ×103个 /mL, 仅为对照 (未添加 ABA ) 的
1 /3。而 1189μmol/L的 ABA抑制作用较弱 , 体胚数为 250 ×103个 /mL PCV。
在相同培养基中成熟培养 90 d后 , 对照体细胞胚开始萌发 , 抽生出绿色叶鞘。将直径 1～115 mm
的体胚转入萌发培养基后 , 对照体胚 10 d后开始萌发 , 而经 ABA处理的体胚初期表现为逐渐膨大 , 并
可见到绿色叶鞘的萌发 , 但后期绝大部分出现愈伤化 (图版 , 10) , 从而严重影响植株的再生。
213　TD Z对贡蕉体细胞胚萌发和植株再生的影响
TDZ处理促进贡蕉体胚的萌发 (图版 , 11～14)。在培养 5 d后即可见绿色叶鞘出现 , 比 BAP对
照提前 5 d左右。对照体胚的萌发率和植株转换率分别为 17128%和 16149% , 而 011、012、015
μmol/L TDZ处理后其分别为 59146%和 54184%、72177%和 67105%、75142%和 65106% (图 2)。
TDZ的使用在提高萌发率和植株转换率的同时 , 萌发体胚出现玻璃化的比例也比对照有所提高 , 且
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园 　　艺 　　学 　　报 34卷
TDZ使用浓度越高 , 玻璃化现象越严重。因此 , 3个浓度处理中 , 以 012μmol/L TDZ最合适。
3　讨论
大多数植物组织培养中生长素为控制植株再生的主要因素 , 其中 2, 42D为诱导外植体脱分化最有
效的生长素之一。本结果表明 , 在以香蕉未成熟花序为外植体诱导愈伤组织时 , 以 Picloram 替代
2, 42D能取得更好的诱导效果 , 其中 8128μmol/L Picloram处理的胚性愈伤组织诱导率为 910μmol/L
2, 42D处理的 2倍以上。同样 , Picloram对指状粟 ( Finger m illet) ( Eapen & George, 1990)、狐尾粟
( Fox2tail m illet) (V ishnoi & Kothari, 1996) 的未成熟花序诱导愈伤组织和体细胞胚胎发生也非常有
效。He & Lazzeri (2001) 比较了 2, 42D和 Picloram诱导硬质小麦胚性反应的效果 , 尽管两者的胚性
愈伤组织诱导率没有明显的差异 , 但 Picloram诱导的胚性培养物的植株再生能力显著高于 2, 42D诱导
的。但本试验中 Picloram诱导的胚性愈伤组织由于含水量较高 , 在进行液体悬浮培养的初期容易出现
褐化 , 尽管经过频繁更换新鲜培养基和筛选培养后 , 能建立胚性细胞悬浮系 , 但需要消耗更多的培养
基和时间 , 这也成为 Picloram广泛应用的限制因素。
大量研究表明 , ABA在提高体细胞胚胎发生频率和质量上具有重要作用 (崔凯荣 等 , 2000)。
通过外施 ABA、AgNO3、增加渗透压和部分干燥处理等措施可以大大改善顶端分生组织的分化和植株
转换率 ( Thorpe, 1995)。然而 , 本试验结果相反 , ABA不但抑制贡蕉 ECS的体胚发生 , 体胚在萌发
过程中还出现严重的愈伤化 , 且其抑制程度随 ABA浓度的提高而增强。Lee等 (1998) 通过用一定
浓度的 ABA处理不同时期的 A ra lia corda ta Thunb体细胞胚 , 发现 ABA抑制异常胚形成的效果与其处
理浓度和胚的发育时期有关。因此 , 本文结果可能是 ABA处理的时间不同所致。Lee和 Ahn (1997)
及 Dong等 (1997) 也曾报道 , 在开始诱导体胚时加入一定量的 ABA能抑制火炬松和白云杉胚性培养
物体细胞胚的发生。由于 ABA诱导胚体成熟的作用机理是基于调节离体细胞激素平衡的结果 ( Shay2
akhunetov & Shakirev, 1996) , 其调节作用还受到使用浓度、培养条件 (光照、时间 ) 以及其它物质
如 PEG、AgNO3、蔗糖和甘露醇 (Nakagawa et al1, 2001; L in et al1, 2004) 的协调作用。因此 , 关
于 ABA对香蕉 ECS体胚发生、成熟与萌发的影响及其作用机理有待进一步的研究。
TDZ具有很高的细胞分裂素活性。已有研究表明 , TDZ能比 BAP更有效地促进水稻 ( Gairi &
Rashid, 2004) 和竹 (L in et al1, 2004) 体细胞胚的萌发。本试验表明 , 012μmol/L TDZ处理的体胚
萌发率和植株转换率比同样浓度的 BAP提高 3倍以上。Griga (1998) 认为 TDZ能诱导没有茎端分生
组织分化的豌豆早期体胚再生出芽是高植株转化率的根本原因。由于在当前的试验体系中贡蕉 ECS
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　1期 魏岳荣等 : Picloram, ABA和 TDZ对香蕉体细胞胚胎发生的影响 　
体胚的发生和成熟并不完全同步 , 因此 , 在含 BAP的萌发培养基中不能萌发的未成熟体胚能在 TDZ
的作用下诱导萌发是体胚萌发率和植株转化率大幅度提高的可能原因。但随 TDZ浓度的增加 , 贡蕉
体细胞胚再生植株玻璃化的发生率上升 , 在 Barbara葡萄和银槭中同样表现十分明显。玻璃化植株的
产生是由于含水分过多。这种现象通常是和乙烯的积累、胶化剂浓度与种类、培养基成分及细胞分裂
素的剂量等多因素有关。因此 , 在贡蕉体细胞胚萌发时 TDZ的使用浓度以 012μmol/L较为合适。
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图版说明 : 1. 未成熟小花梳 ; 2. 由 2, 42D诱导获得的分生小球体 ( a) 和易松散胚性愈伤组织 ( b) ; 3. 继代培养后获得的表面带有
白色体细胞胚的胚性愈伤组织 ; 4. Picloram从花梳苞片和花瓣诱导的白色软泥状的愈伤组织 ; 5. Picloram从花序轴诱导的白色致密愈
伤组织 ; 6. Picloram从花梳小花子房诱导的黄色松散的胚性愈伤组织 (箭头所指 ) ; 7. Picloram由花序小花子房直接诱导的体细胞胚
(箭头所指 ) ; 8. Picloram诱导并继代培养后获得的胚性愈伤组织 ; 9. 均质的胚性细胞悬浮系 ; 10. ABA处理诱导的体细胞胚萌发时
出现愈伤化 ; 11. 体细胞胚在含 012μmol/L BAP的对照培养基中萌发 ; 12～14. TDZ诱导体细胞胚萌发 ( TDZ分别为 011、012和 015
μmol/L)。
Explana tion of pla tes: 1. Young floral hand as exp lant for callus induction; 2. Embryogenic m ixture of meristematic globules ( a) and friable em2
bryogenic callus ( b) induced on medium with 9μmol/L 2, 42D; 3. Embryogenic calluswith whitish p roembryos; 4. W hitish non2embryogenic cal2
lus induced from the bract and petal of flower hands on medium with 8128μmol/L p icloram; 5. W hitish and compact callus from the axis of inflo2
rescence; 6. Yellowish and friable embryogenic callus ( arrow) from the ovary of flower hands; 7. Somatic embryos ( arrow) induced directly from
the ovary and petal of flower hands on medium with 8128μmol/L p icloram; 8. Yellowish and friable embryogenic callus after subculture; 9. Ideal
homogeneous embryogenic cell suspension; 10. Somatic embryo with green sheath induced on medium with 3179μmol/L ABA get back to callus on
germ ination medium; 11. Germ ination of somatic embryos on the control medium with 012μmol/L BAP; 12 - 14. Germ ination of somatic embryos
on medium with 011, 012 and 015μmol/L TDZ.
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