全 文 ：园 　艺 　学 　报 　2006, 33 (4) : 845～848
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2005 - 08 - 16; 修回日期 : 2005 - 12 - 01
基金项目 : 海南省自然科学基金项目 (200580503) ; 农业部南亚热作专项 (2004LY07) ; 中国热带农业科学院院校基金项目 (Rky0442)3 通讯作者 Author for correspondence ( E2mail: H888111@1261com)
香蕉两种主要病毒多重 PCR检测方法的建立
彭　军 1 　王国芬 1 　黄俊生 1, 23 　代　鹏 1 　谢玉萍 1 　李伟东 3
(1 中国热带农业科学院环境与植物保护研究所 , 海南儋州 571737; 2 中国热带农业科学院热带生物技术研究所热带作
物生物技术国家重点实验室 , 海南海口 571101; 3 中华人民共和国海南出入境检验检疫局 , 海南海口 570311)
摘 　要 : 根据香蕉束顶病 (B anana bunchy top virus, BBTV) 和香蕉花叶心腐病 (Cucum berm osa ic virus,
CMV) 的复制酶基因、外壳蛋白基因序列分别设计特异性引物对 , 在 BBTV单一 PCR和 CMV RT2PCR优化
体系的基础上 , 建立了可同时检测 BBTV、CMV的多重 PCR检测方法。此方法可以特异地从感染 BBTV和
CMV的样品中扩增出 2条带 , BBTV (748 bp) 和 CMV (557 bp)。扩增产物序列测定结果表明 , BBTV扩
增产物与 GenBank中其他分离物的核苷酸序列同源性为 91% ～99% , CMV扩增产物与 GenBank中其他分离
物的核苷酸序列同源性为 93% ～98%。
关键词 : 香蕉 ; 香蕉束顶病毒 ; 黄瓜花叶病毒 ; 病毒检测 ; RT2PCR
中图分类号 : S 66811　　文献标识码 : A　　文章编号 : 05132353X (2006) 0420845204
D evelopm en t of a M ultiplex PCR Protocol for the D etection of Two V iruses
of Banana
Peng Jun1 , W ang Guofen1 , Huang Junsheng1, 23 , Dai Peng1 , Xie Yup ing1 , and L iW eidong3
(1 Environm ent and Plant Protection Institu te, Chinese A cadem y of Tropica l A gricu ltura l Sciences, D anzhou, Hainan 571737,
China; 2 S tate Key Labora tory of Tropical C rop B iotechnology, Institu te of Tropical B ioscience and B iotechnology, Chinese A cadem y
of Tropical A gricultura l Sciences, Haikou, Hainan 571101, China; 3 Hainan Entry2exit Inspection and Q uarantine B ureau of Peo2
ples Republic of China, Haikou, Hainan 570311, Ch ina )
Abstract: A multip lex RT2PCR was developed for the simultaneous detection of two viruses of banana
and p lantain (M usa spp. ). Two sets of specific p rimer pairs were designed according to the gene sequence of
B anana bunchy top virus (BBTV) rep licase region and Cucum berm osa ic virus (CMV ) coat p rotein region, re2
spectively. Based upon the establishment of the op tim ized PCR and RT2PCR detection of BBTV and CMV , the
multip lex RT2PCR which can simultaneously detect the two banana viruses was developed. It was shown that
all samp les infected with BBT and CMV could be amp lified simultaneously by multip lex RT2PCR, and yield
two specific bands of BBTV (748 bp) and CMV (557 bp) visualized by agarose gel electrophoresis. Sequence
analysis of the amp lified p roducts showed high homology of BBTV (91% - 99% ) and CMV (93% - 98% )
with the sequences of BBTV and CMV in GenBank.
Key words: Banana; B anana bunchy top virus (BBTV) ; Cucum ber m osa ic virus (CMV ) ; V irus de2
tection; RT2PCR
1　目的、材料与方法
香蕉束顶病 (B anana bunchy top virus, BBTV) 和香蕉花叶心腐病 (Cucum ber m osa ic virus, CMV)
是危害我国香蕉的两种重要病毒病 , 染病后植株矮缩甚至死亡 , 造成果实品质和产量严重下降。香蕉
主要通过组培技术进行无性繁殖 , 种苗一旦带毒 , 将加剧香蕉病毒的传播和危害。应用无毒香蕉苗是
控制病毒病的主要措施之一 , 而快速稳定的检测技术是香蕉种苗无毒化生产的根本保障。目前 , 国内
园 　　艺 　　学 　　报 33卷
检测香蕉病毒的方法主要有酶联免疫 ( EL ISA ) 法、PCR及免疫 PCR等〔1～7〕, 国外有利用多重免疫
捕捉 PCR检测香蕉病毒病的报道〔8～10〕。
通过田间调查及分子检测发现在云南、海南、广东等地区普遍存在 BBTV、CMV混合感染的现
象 , 以单一 PCR检测需要多次操作 , 检测成本高。为提高香蕉病毒检测效率和降低成本 , 建立了可
同时检测 BBTV、CMV的多重 PCR技术 , 为香蕉种苗生产提供理论参考和技术保障 , 也为其他感染
多种病毒的植物检测开辟了一条思路。
2004年从广东、广西、海南等省 (区 ) 香蕉产地采集带有 BBTV、CMV典型症状的病株及两种
病毒混合感染的香蕉病株 , 盆栽保存。BBTV病株矮化、束叶 , 叶柄和叶脉可见深绿色条斑 ; CMV病
株叶片上出现褪绿的黄色不连续条纹且生长矮小。
根据 GenBank数据库中已报道的 BBTV复制酶基因和 CMV外壳蛋白基因序列 (表 1) , 比较多个
株系之间的保守序列设计引物对并由赛百盛公司合成。
表 1　BBTV和 CM V引物序列
Table 1　Sequences of BBTV and CM V pr im ers
病毒 V irus 上游引物 Up p rimer (5pi23pi) 下游引物 Down p rimer(5pi23pi) 产物大小 Product size ( bp)
BBTV RP1 : ATGTGG TATGCTGGATGTTC RP2r: GTTCATATTTCCCGCTTTGA 748
CMV CMV2L: CACCCAACCTTTGTGGGTAG CMV2R: CAACACTGCCAACTCAGCTC 557
取 011 g香蕉叶脉 , 参考文献 〔11～13〕的方法提取病毒总核酸。
反转录反应采用 Invitrogen公司 SuperScrip tTM III反转录体系进行 , PCR反应按 TaKaRa公司 Taq
DNA聚合酶操作说明进行。 PCR扩增程序为 : 94℃变性 3 m in; 95℃ 30 s, 60℃ 1 m in, 72℃ 1 m in
30 s, 循环 35次 ; 最后 72℃延伸 5 m in。
对多重 PCR的各引物浓度及反应的退火温度进行优化 , 筛选出多重 PCR反应体系的最佳反应模式。
PCR产物经 115%琼脂糖凝胶电泳 , 以 DL2000 Marker为标准分子量 , 根据目的条带判断病毒的
有无及种类。切胶后用 PCR产物回收试剂盒 (上海华舜生物工程有限公司 ) 回收目的 DNA片段 , 克
隆于 pMD182T载体 ( TaKaRa) , 送大连 TaKaRa公司测序。
2　结果与分析
211　BBTV、CM V多重 PCR体系的建立
将 BBTV单一感染样品、CMV单一感染样品、BBTV /CMV混合感染样品分别进行双重 PCR, 电
泳结果表明 , 2对引物均能扩增得到预期大小片段的产物 , 电泳呈单一明亮条带 , 适合于病毒检测 ;
而在混合感染样品中 , 扩增的产物呈两条明亮的电泳条带 , 也可以根据扩增条带片段分别判断检出的
病毒种类 (图 1)。
图 1　多重 PCR同时检测香蕉 BBTV和 CM V产物电泳结果
0: ddH2O; CK - : 阴性对照 ; M: DNA标准分子量 ; 1, 2: BBTV感
染样品 ; 3, 4: CMV感染样品 ; 5, 6: BBTV及 CMV感染样品。
F ig. 1　Results of sim ultaneous am plif ied of BBTV and
CM V by m ultiplex PCR
0: Water control; CK- : Negative sample; M: DNA marker; 1, 2: BBTV
infected; 3, 4: CMV infected; 5, 6: BBTV and CMV mixed infected.
图 2　香蕉 BBTV /CM V混合感染植株不同部位取样
多重 PCR检测结果
0: ddH2O; M: DNA标准分子量 ; 1: 根 ; 2: 吸芽 ;
3: 假茎 ; 4: 叶柄 ; 5: 叶片。
F ig. 2　D etection results of BBTV and CM V m ixed infection
in d ifferen t parts by m ultiplex RT2PCR
0: W ater control; M: DNA Marker; 1: Root; 2: Suker;
3: Pseudostem; 4: Petiole; 5: Leaf.
648
　4期 彭 　军等 : 香蕉两种主要病毒多重 PCR检测方法的建立 　
将 BBTV /CMV混合感染的香蕉植株的根、吸芽、假茎、叶柄和叶片等部位分别取样进行多重
PCR检测 , 均检测出混合感染的两种病毒 , 其特异性和稳定性较好 (图 2)。
212　多重 PCR反应条件的优化
在有效 RT2PCR检测体系基础上对多重 PCR反应体系中的主要影响因子进行优化分析得出最佳
反应模式。多重 PCR反应采用 “5 + 20”反应模式 , 即反转录 5μL + PCR反应试剂 20μL, 在同一个
PCR管内反转录和多重 PCR。
反转录反应体系是 5 ×Buffer 2μL, 011 mol/L DTT 015μL, 20μmol/L下游引物 CMV2R 015μL,
10 mmol/L dNTPs 1μL, 提取样品 1μL, 40 U /μL RNase 01125μL, 200 U /μL SuperScrip t Ⅲ反转录酶
01075μL, 用 ddH2 O补足 5μL。反应结束后即在同一 PCR管中加入 20μL PCR反应试剂 : 10 ×PCR
Buffer 215μL, 10 mmol/L dNTPs 4μL, 20μmol/L BBTV上下游引物各 015μL, 20μmol/L CMV上下
游引物各 015μL, 5 U /μL Taq DNA聚合酶 013μL, 用 ddH2 O补足使 PCR管内总反应体积为 25μL。
213　检测灵敏度比较
对提取样品进行梯度稀释试验 , 结果显示可以从稀释至 107 提取液 (相当于 10 - 10 g总 DNA ) 中
扩增检测出 BBTV (图 3, A) ; 可以从稀释至 105 提取液 (相当于 10 - 12 g总 RNA ) 中检测出 CMV
(图 3, B)。多重 PCR与单一 PCR具有相同的检测灵敏度 (图 3, C)。
图 3　多重 PCR与单重 PCR检测灵敏度比较
M: DNA标准分子量 ; 1～8: 样品稀释度依次 10～108。
F ig. 3　D etection sen sitiv ity com par ison m ultiplex PCR between PCR
M: DNA marker; 1 - 8: Samp le dilution from 10 - 108.
214　PCR产物序列分析
测序结果显示 : BBTV扩增片段为 748 bp, 与预期的 PCR产物大小相同 , 是 BBTV R epilicase基因
部分序列 , 与 GenBank中其他分离物核苷酸序列同源性为 91% ～99% , 其中与印度、斐济、汤加、
V1及夏威夷分离物同源性最低为 91% , 与其他地区分离物的同源性较高。CMV的扩增片段为 557
bp, 与预期的 PCR产物大小相同 , 是 CMV CP基因的部分序列 , 与海南分离物的核苷酸同源性最高
为 98% , 与台湾分离物的核苷酸同源性为 94% , 与印度等其他地区分离物的核苷酸同源性大于
93%。
3　讨论
采用多重 PCR检测植物病毒 , 在国内少有报道 , 多重 PCR技术的关键是要选择合适的引物 , 避
免引物之间、引物与其他模板之间的非特异性互作干扰 , 从试验结果可以看出我们设计的两对引物均
能获得较好的扩增效果 , 且两个扩增片段之间相差约 200 bp, 有利于区分产物和每对引物的扩增。
本研究对多重 PCR检测体系及扩增程序进行优化 , 在单个 PCR管内反转录和多重 PCR, 即将所
有反转录的 cDNA全部用做后续 PCR反应的模板 , 与常规 RT2PCR相比 , 降低了成本 , 简化了操作程
序 , 与前人报道的单重 PCR具有相当的检测灵敏度 , 目前已经应用于香蕉种苗的病毒检测。
目前 , 对广东、广西、海南等省 (区 ) 的田间样品检测结果表明 CMV 的感染率为 5%左右 ,
748
园 　　艺 　　学 　　报 33卷
BBTV的感染率为 15% , 两种病毒混合感染率为 011%左右。采用多重 PCR检测体系对海南省香蕉组
培种苗基地约 2 000份样品检测中发现 CMV的感染率为 2% ～5% , BBTV的感染率较低 , 为 0105% ,
目前尚未在组培苗中检测到混合感染现象。
参考文献 :
1　Xie W S, Hu J S. Molecular cloning, sequence analysis, and detection of banana bunchy top virus in Hawaii. Phytopathology, 1995, 85:
339～347
2　Hu J S, L i H P, Barry K, W angW. Comparison of Dot B lot, EL ISA, and RT2PCR assay for detection of two cucumber mosaic virus isolate
infecting banana in Hawaii. Plant D isease, 1995, 79 (9) : 902～906
3　Su H J, Tsao L Y, W u M L, Huang T H. B iological and molecular categorization of strains of banana bunchy top virus. Journal of Phytopa2
thology, 2003, 151: 290～296
4　周莉娟 , 郑伟文. PCR法检测香蕉束顶病毒. 福建农业学报 , 2001, 16 (4) : 45～48
Zhou L J, ZhengW W. Detection of banana bunchy top virus (BBTV) by PCR. Fujian Journal of Agricultural Science, 2001, 16 (4) : 45
～48 ( in Chinese)
5　周莉娟 , 郑伟文. 香蕉花叶心腐病检测的两步法及一步法 RT2PCR比较研究. 江西农业大学学报 , 2003, 25 (5) : 776～779
Zhou L J, Zheng W W. Comparative studies on two2step and one2step RT2PCR for detection of banana mosaic disease. Acta Agriculturae Uni2
versitatis J iangxiensis, 2003, 25 (5) : 776～779 ( in Chinese)
6　李华平 , 胡晋生 , 范怀忠. 香蕉花叶病检测技术的比较. 病毒学报 , 1997, 13 (3) : 273～277
L i H P, Hu J S, Fan H Z. Detection techniques of banana mosaic disease. Chinese Journal of V irology, 1997, 13 (3) : 273～277 ( in Chi2
nese)
7　肖火根 , 胡晋生. 香蕉束顶病毒 PCR检测技术研究. 华南农业大学学报 , 1999, 20 (1) : 5～8
Xiao H G, Hu J S. Detection of banana bunchy top virus by polymerase chain reaction assays. Journal of South China Agricultural University,
1999, 20 (1) : 5～8 ( in Chinese)
8　Sharman M, Thomas E J, D ietzgen G Ralf. Development of a multip lex immunocap ture PCR with colourimetric detection for viruses of banan2
a. Journal of V irologicalMethods, 2000, 89: 75～88
9　Thomas D, Ralf G D. Detection of DNA and RNA virus by PCR and RT2PCR using a rap id virus release p rotocol without tissue homogeniza2
tion. Journal of V irologicalMethods, 1995, 54, 85～95
10　Thompon J R, W etzel S, KlerksM M, Vaskova D, Schoen C D, Spak J, Jelkmann W. Multip lex RT2PCR detction of four aphid2borne straw2
berry viruses in Fragaria spp. In combination with a p lant mRNA specific internal control. Journal of V irologicalMethod, 2003, 111 (2) :
85～93
11　Bekesiova I, Nap J P, M lynaroval L. Isolation of high quality DNA and RNA from leaves of the Carnivorous p lant D rosera rotundifolia. Plant
Molecular B iology Reporter, 1999, 17 (3) : 269～277
12　Avijit Roy, Amer Fayad, Barthe G, B rlansky R H. A multip lex polymerase chain reaction method for reliable, sensitive and simultaneous de2
tection of multip le viruses in citrus trees. Journal of V irologicalMethods, 2005, 129: 47～55
13　唐科志 , 彭　军 , 王雪峰 , 周 　彦 , 周常勇 , 刘科宏 , 刘 　英 , 杨方云. 利用一步法 RT2PCR检测柑橘裂皮病类病毒. 园艺学报 ,
2005, 32 (3) : 408～413
Tang K Z, Peng J, W ang X F, Zhou Y, Zhou C Y, L iu K H, L iu Y, Yang F Y. Quick detection of citrus exocortis viroid (CEVd) by one2
step RT2PCR. Acta Horticulturae Sinica, 2005, 32 (3) : 408～413 ( in Chinese)
848