全 文 ：园 艺 学 报 , 一 一
乙 心
以马铃薯 为 内对照双重 法检
测马铃薯纺锤块茎类病毒
马 恢‘ , 谢晓亮, , 尹 江‘ , 温春秀, , 吴志明”
河北省高寒作物研究所 , 河北张家口 ’ 河北省农林科学院经济作物研究所 , 石家庄
摘 要 根据马铃薯纺锤块茎类病毒 刊 基因序列设计特异引物 , 采用反转录聚合酶链式反应
一 技术进行 检测研究 。 为避免由于提取的 降解或者 一 反应质量不高所造成的假
阴性问题 , 在检测过程中引人马铃薯线粒体 脱氢酶 亚基基因 为内对照 , 该内对照的一个
引物跨越了该基因内含子区域 , 只对剪接后的 进行特异扩增而不扩增其本身 。 利用内对照引物
和 特异引物进行双重 一 检测 , 分别扩增出 的内对照基因特异片段和 的 特
异条带 , 与预期引物设计大小一致。 引人的内对照可以较好地监控 的 一 检测过程 。
关键词 马铃薯 马铃薯纺锤块茎类病毒 双重 一 马铃薯线粒体
中图分类号 文献标识码 文章编号 一 一
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马铃薯纺锤块茎类病毒 尸 。 护 “ , 是严重危害马铃薯的主要病害 , 特别
是与马铃薯卷叶病毒 娇 , 或马铃薯 病毒 , 等复合感
染 , 常造成较大的经济损失 。 不能通过茎尖脱毒除去 , 在脱毒时首先需要进行严格检测 , 淘汰
感染类病毒的植株后进行脱毒 , 。 建立快速
、 灵敏和特异的 检测方法在脱毒种
薯产业中极为重要 。 的检测方法 主要有指示植物法
、 双 向聚丙烯酞胺凝胶电泳法
收稿 日期 一 一 修回 日期 一 一
墓金项目 河北省科技攻关项 目
通讯作者 一
园 艺 学 报 卷
、 核酸杂交和反转录聚合酶链式反应法
一 等 , 其中指示植物法可 以提高症状出现 比
率和加快症状出现速度 , 但是所需要时间长 , 不同类病毒在寄主上引起的症状很难区分 , 有一定的局
限性 , 。 双向电泳法对试验条件和技术要求较低 , 但是操作繁琐 , 且
易降解 一 , , 。 核酸杂交技术特异性强
、 灵敏度高 , 但
是操作繁琐 , 对技术的要求水平高 , 一 一 , 。 一 法具有
特异性强 、 灵敏度高
、
快速和简便等优点 , 理论上只需知道病毒和类病毒的基因序列 , 设计一对特异
引物 , 便能对其进行特异检测 , 且可检测出 级的植物病毒
, 已经越来越多地用于常规检测
, 马秀芬 等 , 吴志明 等 , 。
国内外在马铃薯类病毒的 一 检测上 , 主要通过类病毒基因的特异扩增产物来判断结果 , 通
过设置阴性对照和阳性对照解决假阳性的问题 , 以 , 周国辉
等 , 。 由于马铃薯组织中富含多糖和酚类物质 , 在提取 时不易去除 , 造成 提取质量
不高 , 影响了随后的酶反应活性 , 同时 很容易降解 , 极易造成假阴性结果 。 本文首次报道 了以
马铃薯的线粒体 脱氢酶 亚基基因 为内对照进行 的双重 一 检测的技术
体系研究 , 为 检测提供更为可靠和有效的手段 。
材料与方法
马铃薯感病植株叶片采 自河北省高寒作物研究所马铃薯种质资源圃。 阴性对照为经过 一 检
测证明没有感染 的脱毒试管苗 , 阳性对照为经过 一 和基因测序确证感染了 的试
管苗 , 上述对照均由河北省农林科学院经济作物研究所脱毒马铃薯研究室提供 。
引物由北京赛百盛基因有限公司合成。 通过检验引物的特异性和灵敏度 马秀芬 等 , 吴志
明 等 , 筛选确定了复合 一 引物 , 其中 引物 气
一 ’ , 引物 气 一 ‘ 。 根 据 国 际 基 因 库上
马铃薯线粒体 脱氢酶 亚基基因 登录号 设计内对照引
物 ‘ 竹 门了 一 ‘和 ‘ 一
一 ‘ 。
根据吴志明等 建立的 法进行 的提取 , 沉淀用 处理的无菌水悬浮 ,
一 ℃保存 。 以提取的 为模板 , 用 引物
、 的引物 进行复合 合成 。 在
的微量离心管中加人下列试剂 样品 林 , 互补引物 林
· 一 ’ 各 林 , 灭菌重蒸水
林 。 ℃ 变性 , 冰上冷却 一 然后再加人 协
· 一 ’ 林 ,
卜 , · 一 ’ 林 , 一 反转录酶
· 林 一 ’ 林 , 水补足到 林 ,
混匀后 ℃保温 , ℃ 反应 , 即合成 第一链产物 。
取 微量离心管加人以下试剂 , 同时设置不加模板的对照 , 用 和 引物进行双
重扩增 , 林 ,
· 一 ’ 林 , · 一 ’ 林 ,
引物 林 , 引物 林 , 聚合酶
,
林 , 加灭菌双蒸水补足到 林 , 加人 滴矿物
油 , ℃ 变性 一 后 , 加人 林 产物进行 循环扩增 。 扩增条件 ℃ ,
℃ ℃ , ℃ , 个循环 ℃ 。 取 林 产物经 聚丙烯酞胺凝
胶电泳观察结果 。 利用建立的以内对照为基础的 双重 一 检测技术体系进行实际检测 。
结果与分析
复合 · 检测结果
以阳性对照为研究对象 , 进行单重和双重 一 检测 , 结果 图 表明 , 内对照引物可扩增
出一条约 帅 的特异片段 , 特异引物可扩增出一条约 饰 的特异片段 , 双重 一 扩
期 马 恢等 以马铃薯 为内对照双重 一 法检测马铃薯纺锤块茎类病毒
增出两个 目的条带 , 说明以 亚基基因的 为内对照进行病毒复合 一 检测是可
行的。
复合 · 实际应用
部分大田采集样品检测结果如图 所示 , 其中阴性对照仅扩增出 饰 内对照基因片段 , 阳性
对照同时扩增出 帅 的内对照基因片段和 帅 的类病毒特异基因片段 。 共检测 个样品 , 如果
样品的内对照基因没有扩增出来 , 那么可能由于 降解或者 一 反应没有成功 , 由此产生的
结果不可靠 , 可 以看出 , 该内对照可较好地监测整个马铃薯类病毒的 一 检测过程 , 可有效克服
马铃薯病毒和类病毒 一 检测过程中易出现假阴性结果的问题 。
图 以马铃薯 众 亚基基因 为内对照
双重 · 检测 结果
和 竹 双重 卿 单重
空白对照 。
一 别沈
加 川
竹 释
图 双重 检测样品 结果
一 马铃薯样品 阳性对照
阴性对照 空白对照
住
⋯·
一 阳
,
讨论
在植物病毒的 一 检测中引人内对照是一个有效解决检测 中出现假阴性结果的方法 ,
等 为了监测 的质量和 一 反应的正常进行 , 在 一 检测豆类病毒体系中首次
引人了内对照 , 但是该内对照在健康植株上 产生非特异带 , 因而没有达到有效监控假阴性结果的 目
的。 等 在果树病毒的 一 检测研究中 , 利用苹果酸脱氢酶基因和 一 磷酸核酮糖
梭化氧化酶基因作为内对照 , 虽然可 以应用于多种果树的不 同组织 , 但无法有效区分 模板和
模板 , 只有在 一 反应前进行 酶解才可以起到监测作用 , 由此引人的内对照也没有较
好地解决假阴性的问题 。 等 , 在对苹果病毒进行 一 检测时 , 应用苹果线粒
体脱氢酶 的 亚基基因为内对照 , 设计了跨越内含子区域的引物 , 实现了 只对剪接后 的
的特异扩增 , 有效解决了假阴性问题 。 等 采用 的方法进行了草葛病
毒的复合 一 检测 , 解 决 了假 阴性 问题 。 等 利用 蚜虫 细胞 色素 氧化酶 亚 基
基因 , 建立了以 为内对照复合 一 法检测蚜虫携带的马铃薯卷叶病毒和马铃薯
病毒的方法 , 解决了带毒蚜虫 一 法检测的假阴性问题 。
作者在对 进行 一 检测时 , 根据马铃薯线粒体 脱氢酶 亚基基因的基因组
序列 , 设计的内对照引物 的 ‘末端跨越了该基因的外显子和内含子区域 , 它只能选择性地扩增该
亚基基因的 序列 , 而不扩增其基因组 , 避免由于提取的 模板中存在 污染而影
响内对照的可靠性的问题 , 该内对照可有效用于监测整个 一 检测过程 , 且所用的内对照基因在
园 艺 学 报 卷
马铃薯的根 、 茎
、 叶 、 花 、 果实
、 以及休眠的块茎等组织中普遍存在 , 具有 良好的通用性和实用性 。
这是首次以马铃薯 亚基基因 为内对照复合 一 检测 的报道 , 对提高马铃薯病
毒和类病毒的检测技术水平具有重要的理论意义和应用价值。
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马秀芬 , 刘 莉 , 张鹤龄 , 庞瑞杰 中国流行的马铃薯纺锤块茎类病毒 名,
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株系鉴定及其对产量的影响 内蒙占大
学学报
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昊志明 , 贾晓梅 , 谢晓亮 , 温春秀 , 田 伟 , 张庆良
,
马铃薯纺锤块茎类病毒 一 检测和全序列分析 华北农学报
,
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周国辉 , 李梅辉 , 许东林 , 蔡艳清 《 科 马铃薯卷叶病毒分子鉴定及一步 一 检测 植物保护学报 引 一