全 文 ：园 　艺 　学 　报 　2006, 33 (5) : 1011～1014
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2006 - 01 - 18; 修回日期 : 2006 - 05 - 10
基金项目 : 国家自然科学基金项目 (30471189)3 通讯作者 Author for correspondence ( E2mail: Zhuangmu@mail1caas1net1cn)
部分蔬菜 CM V分离物 CP基因的克隆及序列分析
陈　伟 1, 2 　罗 　静 1, 2 　庄 　木 23 　李艳红 1 　冯兰香 2 　王晓武 2 　谢丙炎 2 　
刘玉梅 2 　方智远 2
(1 首都师范大学生命科学学院 , 北京 100037; 2 中国农业科学院蔬菜花卉研究所 , 北京 100081)
摘 　要 : 对来自国内不同地区、不同蔬菜作物上的 8个黄瓜花叶病毒分离物 , 采用一步法 RT2PCR扩增
得到 CP基因全长片段 , 分别克隆到 pMD218T载体并测序。结果表明 , 本研究 8个分离物的 CP基因均为 657
个碱基 , 可编码 218个氨基酸 , 它们之间的核苷酸序列同源性较高 , 达 9218% ～9911%; 将它们与 GenBank
中部分 CMV CP基因序列比较 , 显示出与 CMV亚组Ⅰ株系的核苷酸序列同源性达 9017%～9810% , 而与亚组Ⅱ
株系的核苷酸序列同源性仅有 7518%～7811%。因此 , 这 8个分离物应归属于 CMV亚组Ⅰ。
关键词 : 黄瓜花叶病毒 ; CP基因 ; RT2PCR; 序列分析
中图分类号 : S 63　　文献标识码 : A　　文章编号 : 05132353X (2006) 0521011204
C lon ing and Sequence Ana lysis of Coa t Prote in Genes of C ucum ber m osa ic
virus Isola ted from Severa l Vegetable
Chen W ei1, 2 , Luo J ing1, 2 , Zhuang Mu23 , L i Yanhong1 , Feng Lanxiang2 , W ang Xiaowu2 , Xie B ingyan2 ,
L iu Yumei2 , and Fang Zhiyuan2
(1 Capital N orm al U niversity, L ife College, B eijing 100037, Ch ina; 2 Institu te of V egetables and Flow ers, Chinese A cadem y of
A gricultural Sciences, B eijing 100081, Ch ina)
Abstract: The eight CP genes of CMV isolated from different areas and vegetables in China were amp li2
fied by one2step RT2PCR, and transformed into pMD218T vector and then sequenced, respectively. The
results showed that the sequences of the eight CP genes were all 657 nucleotides that could encode the p rotein
of 218 am ino acids of each isolate, and the isolates shared high sequence homology from 9218% to 9911%
among them. The nucleotide sequence alignment showed, compared with some CP gene sequences of CMV re2
ported in GenBank, the eight CP genes shared 9017% - 9810% homology with those of CMV subgroup I
strains, whereas only shared 7518% - 7811% homology with those of CMV subgroup Ⅱ strains. Therefore, it
was supposed that all the eight CMV isolates reported in this study belonged to the subgroup I of CMV.
Key words: Cucum ber m osa ic virus; CP Gene; RT2PCR; Sequence analysis
黄瓜花叶病毒 (Cucum ber m osa ic virus, CMV )〔1, 2〕由 3条正义单链 RNA组成 , RNA1和 RNA2编码
与病毒复制有关的非结构蛋白 , RNA3编码病毒的运动蛋白和外壳蛋白 (Coat p rotein)〔3〕。目前 , 根
据寄主反应、血清学关系、病毒外壳蛋白肽链图谱分析、dsRNA分析、核酸杂交、RT2PCR产物酶解
分析及核苷酸序列分析等 , 将 CMV株系或分离物划分为两个性质不同的亚组 , 即亚组Ⅰ和亚组Ⅱ〔4, 5〕。
众多研究显示 , 目前侵染并危害国内蔬菜作物的 CMV以亚组Ⅰ分离物为主 (检出率占总体的 90%以
上 )〔5～9〕。不同的 CMV株系或分离物在致病性、寄主范围、繁殖速率、种传、虫传、血清学等方面的
差异 , 均来自基因组的差异〔10, 11〕。作者在将国内 58个番茄 CMV 分离物划分为两个血清组的基础
上〔6〕, 选择来自国内不同地区、不同蔬菜作物上的 8个 CMV分离物 , 进行 CP基因克隆及序列分析 ,
以进一步从分子水平上确认它们的亚组地位 , 为抗病毒基因工程育种工作提供分子理论基础。
园 　　艺 　　学 　　报 33卷
1　材料与方法
从国内不同地区和不同蔬菜上采集
的 8个 CMV分离物 (表 1) 由中国农
业科学院蔬菜花卉研究所病毒课题组收
集并纯化和保存。将不同分离物分别接
种繁殖于防虫温室内健康的 ‘三生 -
NN’烟上 , 发病后取新鲜病叶为试材。
取未接种的健康新鲜叶片为负对照。
根据 GenBank中的 CMV CP基因序
列 , 用 DNAStar的 Primer select (3110)
程序进行设计 , 合成一对特异引物 , 上
表 1　来自国内不同地区和作物上的 CM V分离物
Table 1　CM V isola ted from d ifferen t area s and plan t in Ch ina
分离物
Isolates
序列号
Accession No.
来源地区
O rigin
寄主植物
Host
侵染后症状
Symp tom
BF DQ302714 北京 Beijing 番茄 Tomato 重花叶 Severe mosaic
BG DQ302715 北京 Beijing 甘蓝 Cabbage 花叶 Mosaic
BH DQ302716 北京 Beijing 黄瓜 Cucumber 重花叶 Severe mosaic
BT DQ302717 北京 Beijing 甜椒 Pepper 花叶 Mosaic
CF DQ302718 成都 Chengdu 番茄 Tomato 重花叶 Severe mosaic
GF DQ302719 广东 Guangdong 番茄 Tomato 重花叶 Severe mosaic
JF DQ302720 南京 Nanjing 番茄 Tomato 重花叶 Severe mosaic
SF DQ302721 上海 Shanghai 番茄 Tomato 重花叶 Severe mosaic
游引物 (5pi→3pi) : GTCATGGACAAATCTGAATCAACC; 下游引物 (5pi→3pi) : GCCGTAAGCTGGATGGA2
CAAC, 预期扩增产物长度为 784 bp (包括 CP基因全长和部分 3pi末端序列 )。
病毒样品制备、利用一步法进行 RT2PCR扩增均参考庄木等〔7〕的方法。每个 RT2PCR反应体积为
25μL, 其中包括 : 病毒原液 100倍的稀释溶液 015μL为模板 , 5 U Superscrip t Ⅱ逆转录酶 ( Gibicol
公司 ) , 4 U Rnasin inhibitor ( TAKARA) , 200μmol/L dNTPS, 上游引物下游引物各 015μmol/L , 215
U Taq酶 (天为时代公司 ) , 1 ×Taq PCR buffer (内含 115 mmol/L MgCl2 )。反应程序为 42℃逆转录
30 m in; 接着 PCR: 95℃变性 2 m in, 然后 94℃ 30 s, 55℃ 40 s, 72℃ 1 m in, 共 36个循环 , 最后
72℃延伸 5 m in。扩增反应在 PTC2100热循环仪 (美国 M1J1Research) 中进行。
扩增反应结束后以 110%的琼脂糖凝胶电泳检测 RT2PCR产物 , 确认获得预计的目标带后 , 回收
RT2PCR产物 ( TAKARA试剂盒 ) 并与 pMD182T载体 ( TAKARA ) 连接 , 转化大肠杆菌 DH5α。挑取
白斑克隆提取质粒 DNA (天为时代公司试剂盒 ) , 进行 PCR检测及 H ind Ⅲ酶切鉴定重组质粒。为避
免 PCR扩增和序列分析过程产生的差异 , 每个分离物选取 3个重组克隆送交上海生工生物工程公司
测序 , 比较分析后确定每个分离物的序列。
采用 DNAStar中 MegA lign软件的 ClustalW 方法 , 比较获得的各个分离物 CP基因序列间的同源
性 ; 并与 GenBank中已报道的部分 CMV分离物 CP基因进行序列同源性分析 , 构建系统进化树。
2　结果与分析
211　CM V分离物 CP基因片段的 RT2PCR扩增
8个不同 CMV分离物的一步法 RT2PCR扩增产物 , 在 110%琼脂糖凝胶电泳中均呈现一清晰的条
带 , 片段大小在 784 bp左右 (图 1) , 与预期的片段大小一致 , 而负对照无扩增条带 , 表明已成功扩
增获得各个分离物的 CP基因片段。
212　RT2PCR产物的克隆及测序
回收 RT2PCR产物克隆到 pMD182T载体 , 挑取白斑克隆提取质粒 DNA进行 PCR扩增检测 , 得到
了 784 bp的目标带 (数据未显示 ) ; 以 H ind Ⅲ酶切重组质粒 DNA, 由于插入方向的原因 , 来自北京
甜椒 CMV分离物 BT的重组克隆得到 337 bp的目标带 , 其余分离物的重组克隆均得到 503 bp的目标
带 , 均与预期条带大小相符 (图 2) , 表明国内不同来源的 8个 CMV分离物的 CP基因片段已克隆到
T载体上。
测序结果表明 BF、BG、BH、BT、CF、GF、JF和 SF等 8个 CMV分离物 CP基因的序列长度均
为 657 个核苷酸 , 编码 218 个氨基酸 , 在 GenBank 中登录号分别为 DQ302714、DQ302715、
DQ302716、DQ302717、DQ302718、DQ302719、DQ302720和 DQ302721。
2101
　5期 陈 　伟等 : 部分蔬菜 CMV分离物 CP基因的克隆及序列分析 　
图 1　一步法 RT2PCR扩增不同 CM V分离物的 CP基因片段
1: DNA分子量标准 ; 2: 健康叶片 ; CF～BH: CMV分离物。
F ig. 1　One step RT2PCR am plif ica tion of the CP gene
fragm en ts from som e CM V isola tes
1: DNA marker; 2: Negative control mock; CF - BH: CMV isolates.
图 2　含 CP基因的 pMD182T重组载体 H ind Ⅲ酶切鉴定
1: DNA分子量标准 ; CF～BH: 分离物 CP基因片段的酶切检测。
F ig. 2　D igestion with H ind Ⅲ of recombinant pMD182T vector
con ta in ing CP gene fragments
1: DNA marker; CF - BH: CMV isolates.
213　CM V CP基因核苷酸序列同源性比较
采用 DNAStar软件进行序列分析表明 , 所得到
的 8个 CMV分离物 CP基因的核苷酸序列同源性较
高 , 达 9218%～9911%。来源于北京地区 4种作物
(甘蓝、甜椒、黄瓜和番茄 ) 的分离物核苷酸序列
比较显示 , 除了黄瓜与甘蓝分离物同源性较高达到
9911%以外 , 其它分离物之间的同源性为 9218%～
9316% , 说明在一有限的区域范围内 , 分离物间存
在着一定程度的差异。对来自 5个不同地区 (北
京、成都、广东、南京、上海 ) 番茄上的 CMV分
离物 CP基因核苷酸序列比较 , 北京、上海和南京
来源的分离物间同源性高达 9813%～9818% , 而广
东番茄分离物与其它 4个地区来源分离物同源性只
有 9218%～9513% , 表现出在同一寄主作物但不同
地域的 CMV分离物间 CP基因序列也存在着差异。
将克隆的 8个 CP基因序列与 GenBank中报
道的部分序列进行核苷酸同源性比较 , 同源性在
7518% ～9810% (表 2)。其中与本研究获得的 8
个 CMV分离物同源性 > 90%的是 A s、B2、 Fny、
Ft、Kor、L iTW、Mf、NT9、O、 SD、 Tfn、 Y 和
YN等 13个株系或分离物 , 它们均属于亚组 Ⅰ;
与亚组 Ⅱ的 LY、Q和 Trk7株系的核苷酸序列同
源性只有 7518% ～7811%。通过分子进化树分
析 , 这些病毒分离物可分为 2组 , BF、BG、BH、
BT、CF、GF、JF和 SF等 8个 CMV分离物与亚
组 Ⅰ株系同源性关系更密切 (图 3) , 因此可以确
定本研究的 8个 CMV分离物都属于亚组 Ⅰ。
3　讨论
迄今为止 , 虽然 CMV株系繁多 , 但基本可
分为两个亚组 (即亚组 Ⅰ和亚组 Ⅱ) , 不同亚组
株系或分离物间的 CP基因核苷酸序列和氨基酸
表 2　8个 CM V分离物 CP基因核苷酸序列与 GenBank中部分
序列的同源性比较
Table 2　Hom ologous com par ison of nucleotide sequences of CP
genes of e ight CM V isola tes w ith the sequences from GenBank
株系或分
离物 Strain
or Isolate
序列号
Accession
No.
来源
O rigin
与 8个分离物
同源性
Homology( % )
亚组
Sub2
group
A s X77855 韩国 South Korea 9318～9710 Ⅰ
B2 AB046951 印度 Indonesia 9218～9412 Ⅰ
Fny D10538 美国 United States 9310～9418 Ⅰ
Ft D28487 日本 Japan 9116～9316 Ⅰ
Kor L36251 韩国 South Korea 9017～9218 Ⅰ
L iTW AJ131619 中国 China 9113～9315 Ⅰ
Mf AJ276481 韩国 South Korea 9218～9414 Ⅰ
NT9 D28780 中国 China 9315～9716 Ⅰ
O D00385 日本 Japan 9118～9411 Ⅰ
SD AB008777 中国 China 9411～9810 Ⅰ
Tfn Y16926 意大利 Italy 9318～9716 Ⅰ
Y D12499 日本 Japan 9215～9415 Ⅰ
YN AJ239098 中国 China 9310～9612 Ⅰ
LY AF198103 澳大利亚 Australia 7616～7811 Ⅱ
Q M21464 澳大利亚 Australia 7619～7811 Ⅱ
Trk7 L15336 匈牙利 Hungary 7518～7710 Ⅱ
图 3　根据 CM V分离物 CP基因核酸序列所得的亲缘关系树
F ig. 3　A phylogen ic tree of som e CM V isola tes ba sed on
CP gene sequences
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序列同源性为 70% ～80% , 而同一亚组内不同株系或分离物间 CP基因序列同源性却达到 90%以
上〔5, 11〕。我们的研究结果显示 CMV不同分离物 CP基因之间存在着地理和寄主间的差异 , 并且氨基酸
序列间比相应的核苷酸序列间具有略高的同源性。这 8个 CMV分离物 CP基因的氨基酸序列同源性
为 9613% ～9911% ; 它们与 GenBank中 A s、B2和 Fny等 13个亚组 Ⅰ株系的氨基酸序列同源性在
9217% ～9911%之间 , 与 LY、Q和 Trk7等 3个亚组 Ⅱ株系的氨基酸序列同源性在 7613% ～7910%之
间 (数据未显示 )。因此 , 本研究的 8个 CMV分离物均属于 CMV亚组 Ⅰ, 这与先前的血清学鉴定和
利用位于 RNA2上的 2b基因序列进行株系亚组定位的结果相一致〔6, 7〕。虽然 BF和 BG的 2b基因片段
(300 bp) 100%同源〔7〕, 但本研究中二者 CP基因序列同源性仅为 9218% , 这说明 CMV的 CP基因比
2b基因具有较高的自然变异。
近年来 , 植物抗病毒基因工程和 RNA沉默的研究进展显示 , 利用高效引发 RNA沉默反向重复表
达载体 , 转化植物后易获得对相应病毒的高度抗性〔12, 13〕。基于本研究对 CP基因核苷酸序列的分析 ,
选择 CP基因相对保守性高的序列构建反向重复表达载体的研究工作正在进行中。
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