全 文 ：© 1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net
园 　艺 　学 　报 　2008, 35 (2) : 181 - 188
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2007 - 06 - 20; 修回日期 : 2007 - 11 - 223 通讯作者 Author for correspondence ( E2mail: zhaih@ sdau1edu1cn; Tel: 053828241335)
苹果细胞质型苹果酸脱氢酶基因克隆、表达及酶活
性分析
姚玉新 1 , 郝玉金 1 , 李　明 1 , 庞明利 1 , 刘　志 2 , 翟　衡 13
(1 山东农业大学园艺科学与工程学院 , 作物生物学国家重点实验室 , 山东泰安 271018; 2 辽宁省果树科学研究所 ,
辽宁熊岳 115214)
摘　要 : 根据亚细胞定位 , 苹果酸脱氢酶可分为 5种类型 , 其中依赖于 NAD的细胞质型苹果酸脱氢酶
( cyMDH) 在植物上的研究较少。从苹果果实中分离了 cyMDH 的全长 cDNA 序列 , 命名为 M al2cyMDH
( GenBank登录号为 DQ221207) , 该序列含有一个 996 bp的开放阅读框 (ORF)。序列同源性分析表明
Mal2cyMDH与其他物种 cyMDH有较高的同源性 , 进化树分析表明几乎所有的 cyMDH可以聚类在一个分支
上 , 并且 cyMDH可能是 MDH的最原始种。原核表达得到一个 37 kD左右的融合蛋白 , 酶活测定表明该酶
主要催化合成苹果酸。苹果果实中 cyMDH酶活分析表明在高酸和低酸基因型中该酶的还原活性存在明显差
异。
关键词 : 苹果 ; 细胞质型苹果酸脱氢酶 ; 基因 ; 克隆 ; 原核表达 ; 酶活性
中图分类号 : S 66111　　文献标识码 : A　　文章编号 : 05132353X (2008) 0220181208
Gene C lon ing, Expression and Enzym e Activ ity A ssay of a Cytosolic M a la te
D ehydrogena se from Apple Fru its
YAO Yu2xin1 , HAO Yu2jin1 , L IM ing1 , PANG M ing2li1 , L IU Zhi2 , and ZHA I Heng13
(1 College of Horticultural Science and Engineering, Shandong A gricultural U niversity, S ta te Key Laboratory of C rop B iology,
Taipian, Shandong 271018, China; 2L iaoning Research Institu te of Pom ology, X iongyue, L iaon ing 115214, Ch ina)
Abstract: Malate dehydrogenase (MDH) ubiquitously exists in animals, p lants and m icrooganism s, and
catalyzes the interconversion from oxaloacetate to malate. Cytosolic NAD2dependentMDH gene ( cyMDH) en2
codes a key enzyme crucial for malic acid synthesis in the cytosol, which has not been extensively charac2
terized in p lants. In this study, a full2length cDNA of cyMDH was isolated from app le fruits with RT2PCR as
well as 3′and 5′rap id amp lification of cDNA ends, and designated asM al2cyMDH ( GenBank accession No.
DQ221207). It contained a 996 bp ORF and sequence analysis showed a high sim ilarity to other p lant
cyMDH s. Phylogenetic analysis indicated that almost all the cyMDH s could be clustered into the same group
and it was likely to rep resent the original MDH. An about 37 kD fused p rotein was obtained by the recom2
binant p rokaryotic exp ression and its enzyme activity assay showed that it mainly catalyzed oxaloacetate to ma2
late. It was also discovered that the enzyme activity of cyMDH exhibited remarkably difference between the
high2 and low2acid app le germp lasm.
Key words: app le; cytosolic malate dehydrogenase; gene; cloning; p rokaryotic exp ression; enzyme ac2
tivity
苹果酸脱氢酶 (MDH) 广泛存在于动、植物和微生物中 , 并且在不同物种间具有较高的保守性 ,
主要催化草酰乙酸和苹果酸的相互转化。在植物、哺乳动物和大部分细菌中苹果酸脱氢酶以同型二聚
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体形式存在 , 依赖 NAD和 NADH的苹果酸脱氢酶相对分子量分别为 32～37 kD和 42～43 kD。根据辅
酶专一性、亚细胞定位和生理功能 , 植物苹果酸脱氢酶可以分为 5类 : 叶绿体依赖 NADP的、线粒体
依赖 NAD的、微体依赖 NAD的、叶绿体依赖 NAD的和细胞质依赖 NAD的苹果酸脱氢酶 ( Yu &Ma,
2004)。叶绿体、线粒体和微体的苹果酸脱氢酶已被广泛研究 , 而细胞质依赖 NAD的苹果酸脱氢酶
( cyMDH) 目前研究较少。
cyMDH在细胞质和细胞器的多种穿梭系统中起重要作用 ( Kromer & Heldt, 1991; Hanning &
Heldt, 1993; Yu & Ma, 2004) , 对核酸选择性通道 (Basil et al. , 2002) 和糖异生功能 (Natalie &
Lee, 2003) 也有影响 , 同时还是苹果酸代谢的关键酶之一 , 与磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶 ( PEPC)
(Chollet et al. , 1996) 在细胞质中共同催化合成苹果酸。果实中该酶基因的表达与苹果酸积累的关系
除在桃转录水平上有所分析 (Christelle et al. , 2002) 外 , 还未见其他研究。苹果 (M alus dom estica
Borkh. ) 果实主要积累苹果酸 , 是研究苹果酸脱氢酶的表达、酶活与苹果果实酸度关系的最佳材料。
本研究旨在从苹果果实中克隆 cyMDH基因 , 通过原核表达体外鉴定该基因的功能 , 分析果实中 cyM2
DH酶活性与果实含酸量的相关性。
1　材料与方法
111　植物材料
从 ‘东光 ’ ב富士 ’ (辽宁省果树科学研究所 ) 苹果杂交后代中选取高酸和低酸个体各 1株 ,
盛花后 30、60、90、120和 150 d采集果实 , 取果肉组织 , 立刻液氮速冻 , 以备提取 RNA和酶。
112　苹果酸含量的测定
每个发育时期取 4个果实 , 取果肉等量混合 , 研磨过滤 , 用毛细管电泳测定苹果酸含量。测定条
件为 : 未涂层毛细管 (50μm ×57 cm) ; 应用电压 10 kV; 进样时间 3 s; 测定波长 (λ) 200 nm; 测定
温度 20 ℃; 缓冲液 100 mmol·L - 1 K2 HPO4 + 015 mmol·L - 1 CTAB; pH 710。
113　cD NA克隆
利用改良热硼酸法 (姚玉新 等 , 2005) 提取果实总 RNA。取 2μg RNA利用 M 2MLV RTase cDNA
Synthesis Kit ( Takara, China) 合成单链 cDNA。根据不同物种 cyMDH的保守区设计兼并引物 , 扩增
获得 M a l2cyMDH的中间片段 , 引物序列为 5′2GTT CGY GTY CTY GTY ACY GG23′( forward) 和 5′2CTN
ACY GNC CRT NAY GAN TG23′( reverse) , 3′和 5′端序列通过 Rap id Amp lification Kit of cDNA Ends
( Takara, China) 获得。
114　同源序列比对和系统进化分析
比对的氨基酸序列来自 http: ∥www1ncbi1nlm1nih1gov。序列比对用 Clustal W 多元比对程序 , 进
化树由 DNASTAR软件构建。
115　原核表达及 SD S2PAGE
利用引物 5′2CG GGA TCC ATG GCG AAA GAA CCA GTT C23′( forward, 粗体代表保护碱基和酶
切位点 ) 和 5′2AGT CGA AGT GTC CGA ATA GAA T23′( reverse) 扩增 M al2cyMDH编码框序列 , 克隆
到 pMD182T载体上。利用 B am HⅠ和 Sa lⅠ双酶切克隆载体上的目的片段和原核表达载体 pET230a
( + ) 构建原核重组表达载体 pET30a2cyMDH, 测序验证读码框正确后转化大肠杆菌 BL21。利用 015
mmol·L - 1 IPTG在不同温度下分别诱导 , 诱导产物进行 SDS2PAGE检测。
116　重组蛋白的纯化及酶活性的测定
收集来自 1 000 mL培养基诱导培养的大肠杆菌 , 悬浮于 30 mL提取缓冲液 ( 50 mmol·L - 1 Tris2
HCl, pH 815, 500 mmol·L - 1 NaCl, 10%甘油 , 1% Triton X2100, 20 mmol·L - 1 巯基乙醇和 1
mmol·L - 1 PMSF) 中。加入 80μL 10μg·mL - 1的溶菌酶 , 30 ℃放置 15 m in。超声波破碎细胞。
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15 000 ×g离心 15 m in, 取 30 mL的上清液利用 N i2NTA柱纯化。取 30μL用于 SDS2PAGE电泳。并利
用 B radford法测定蛋白含量 (B radford, 1976)。
还原活性反应体系为 50 mmol·L - 1 MOPS, pH 719, 015 mmol·L - 1 OAA, 012 mmol·L - 1
NADH, 定容到 3 mL。氧化活性反应体系为 50 mmol·L - 1 MOPS, pH 719, 50 mmol·L - 1 L2malate,
110 mmol·L - 1 NAD + , 定容到 3 mL。立刻混匀 , 置于 30 ℃水浴中保温 , 每隔 1 m in测定在 340 nm
的吸光值 , 测定 6个数据 , 以吸光值为纵坐标 , 时间为横坐标 , 直线斜率即为反应速度 (OD·m in - 1
·mg- 1 Pr)。根据 NADH标准曲线将单位换算为μmol·L - 1 ·m in - 1 ·mg- 1 Pr, 表示在单位时间单位
酶作用下 NADH浓度的变化量。
每个样品测定 3个重复。
117　细胞质总酶的提取及 cyMD H酶活性的测定
酶的提取操作均在 0～4 ℃进行。取 - 80℃储藏的苹果果肉 5 g放入研钵中 , 加入 1% (质量 /体
积 ) PVPP, 冰上冷冻研磨成粉末 , 立刻加入 5 mL提取缓冲液 ( 100 mmol·L - 1 MOPS, pH 810, 1
mol·L - 1 NaCl, 250 mmol·L - 1 sucrose, 100 mmol·L - 1 bicine, 2 mmol·L - 1 EDTA2NaOH, pH 810,
012 mmol·L - 1 MgSO4 , 0175 mg·mL - 1 BSA和质量体积比为 1% PVPP) , 混匀放置 1 h。将匀浆通过
4层纱布进行过滤 , 然后 2 800 ×g离心 20 m in, 取上清液。100 000 ×g极度离心 1 h (Bechmann J30 i
ultracentrifuge) , 取上清液。上清液透析处理 12 h, 分装 , - 80 ℃储藏备用。
酶活性测定同 116一节中融合蛋白酶活测定方法。
2　结果与分析
211　M a l2cyM D H 克隆与序列分析
利用兼并引物进行 PCR扩增 , 获得了一个 705 bp的中间片段 , 然后利用 3′和 5′RACE技术获得
该基因的全长 cDNA, 共 1 246 bp, 包含一个 ATG起始密码子和 TAG终止密码子 , 8 bp长的 5′非编码
区和 239 bp的 3′非编码区 , 编码一个含有 332个氨基酸残基的蛋白 , 预测的等电点 (p I) 为 712, 估
计的分子量为 35 593 Da。
推断的 Mal2cyMDH氨基酸序列与其他植物 cyMDH的氨基酸序列相比同源性在 90%以上 , 尤其是
与双子叶植物的同源性更高 , 其中与来自桃果实的 cyMDH同源性最高达到 96%。与动物和细菌的也
超过 50%。此外 , 在 Mal2cyMDH 序列上也发现了催化基元 “ IW GNH ”和 NAD 结合基元
“TGAAGQ I”, 这两个基元在各物种的 cyMDH中广泛存在且高度保守 (图 1)。
亲水性分析显示在 Mal2cyMDH的 N端第 9个氨基酸开始存在一个强的疏水结构域 (图 2) , 这个
结构在其他物种 cyMDH中也广泛存在。总之 , 所克隆基因的氨基酸序列特征强烈暗示了该基因编码
细胞质型苹果酸脱氢酶。
212　进化树分析
不同物种、不同类型的苹果酸脱氢酶在进化树上可以分为两组 (图 3)。第 1组由线粒体型苹果
酸脱氢酶 (mMDH)、乙醛酸体型苹果酸脱氢酶 ( gMDH ) 和部分叶绿体依赖 NAD的苹果酸脱氢酶
( cnMDH s) 组成。第 2组可以进一步分为两个亚组 , 一个亚组包括叶绿体依赖 NADP的苹果酸脱氢
酶 ( chMDH s)、细菌细胞质型苹果酸脱氢酶和部分叶绿体依赖 NAD的苹果酸脱氢酶 ( cnMDH s) ; 另
一亚组则完全由细胞质型苹果酸脱氢酶 ( cyMDH s) 组成。
就 cyMDH而言 , 植物、哺乳动物和细菌的同源性在 54% ～72% , 并且聚类结果显示 , 同一种
MDH物种间的相似性超过了不同 MDH物种内的相似性 , 例如 , 拟南芥与家鼠、细菌 cyMDH的同源
性分别为 61%和 51% , 而拟南芥的 cyMDH与其 mMDH和 gMDH的同源性仅为 1813%和 14% , 这表
明 MDH是一个非常原始的基因 , 在物种分化之前已经形成了不同种类的 MDH (图 3)。
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图 3　cyMD H的系统进化树分析
F ig. 3　Phylogenetic tree of cyMD H
213　M a l2cyM D H 原核表达与融合蛋白酶活性
重组质粒 pET30a2cyMDH经测序验证序列正确后 , 转入大肠杆菌 BL21, 用 IPTG诱导其表达 , 结
果发现 , 由 37 ℃到 16 ℃随着诱导温度的降低 , 相同的诱导时间内表达产量逐渐减少 , 16 ℃诱导条
件下随着时间延长表达产量增加 (图 4, A)。
可溶性蛋白在 37 ℃条件下几乎得不到 , 而在 16 ℃条件下诱导可以在上清液中得到 , 并且通过延
长诱导时间可以提高蛋白的产量 (图 4, B)。最终在 16 ℃、015 mmol·L - 1 IPTG条件下诱导 24 h得
到了大量可溶性蛋白 , 分子量在 37 kD左右 , 在诱导的含空载体的该菌株中未检测到目的蛋白的表
达。收集诱导表达的菌体 , 超声波破碎分离可溶性蛋白 , 经 N i2NTA柱洗脱 , 在 300 mmol·L - 1的洗
脱浓度下得到纯度较高的融合蛋白 (图 4, C)。
分光光度法酶活性测定表明 , 在空载体及空表达载体的蛋白粗体液中检测到极微弱的 MDH酶活
性 (01105 μmol·L - 1 ·m in - 1 ·mg- 1 Pr) , 在纯化的融合蛋白中检测到较高的 MDH 还原活性
(133124μmol·L - 1 ·m in - 1 ·mg- 1 Pr) 和微弱的氧化活性 (01679μmol·L - 1 ·m in - 1 ·mg- 1 Pr)。
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图 4　pET30a2cyMD H在大肠杆菌 BL21中的表达 ( A)、上清液可溶性蛋白 ( B) 及 N i2NTA柱纯化融合蛋白 ( C) 的 SD S2PAGE
A: 1～4表示分别在 37 ℃、30 ℃、22 ℃、16 ℃诱导 4 h; 5, 6表示在 16℃分别诱导 12和 24 h; 7为空载体 pET30a ( + )。
B: 1和 2表示在 16 ℃分别诱导 12和 24 h; 3表示 37 ℃诱导 12 h。
C: 1～4表示洗脱浓度分别为 50、100、200、300 mmol·L - 1。箭头所示为目的蛋白。
F ig. 4　SD S2PAGE of pET30a2cyMD H expression products ( A) , soluble prote in in the superna tan t ( B) and
recom b inan t prote in s pur if ied by N i2NTA column ( C)
A: 1 - 4 show inducement at 37 ℃, 30 ℃, 22 ℃, 16 ℃ for 4 h;
5, 6 show inducement at 16 ℃ for 12 and 24 h; 7 was pET30a ( + ) .
B: 1 and 2 show inducement at 16 ℃ for 12 and 24 h; 3 show inducement at 37 ℃ for 12 h.
C: 1 - 4 were eluted by 50, 100, 200 and 300 mmol·L - 1 , respectively. The target fused p rotein was arrowed.
214　高酸和低酸苹果果实中苹果酸含量和 cyMD H酶活性分析
在同一发育时期 , 高酸和低酸两个基因型间苹果酸含量有显著差异。苹果酸在两个基因型苹果中
的变化趋势前期相似 , 后期不同 , 即花后 30 d含量均较高 , 然后逐渐下降 , 后期低酸基因型苹果持
续下降而高酸基因型的有小幅度上升 , 最终导致二者苹果酸含量差异显著 (图 5)。
经测定 , cyMDH还原活性在低酸果实中先降低然后逐渐升高 ; 在高酸果实中 , 花后 60 d左右达
到高峰 , 然后下降再逐渐升高。两个基因型间 cyMDH的还原活性呈现极显著差异 , 在相同的发育阶段
高酸基因型果实的酶活性明显高于低酸基因型 (图 6) , 差异规律与两基因型间苹果酸含量基本一致。
图 5　果实发育过程中苹果酸含量的变化
F ig. 5　Change of ma lic ac id con ten t
dur ing fru it developm en t
图 6　高酸和低酸果实间 cyMD H还原活性比较
F ig. 6　Com par ison of cyMD H activ ity between
the h igh2ac id and low2ac id fru its
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cyMDH仅在 3个时期被检测到微弱的氧化活性 , 即高酸果实中花后 30、90 d和低酸果实中花后 150
d, 比其还原活性低的多 (图 7)。
图 7　高酸和低酸果实间 cyMD H还原和氧化活性比较
F ig. 7　Com par ison of cyMD H activ ity between the h igh2ac id and low2ac id fru its
3　讨论
本研究从苹果果实中分离克隆了细胞质型苹果酸脱氢酶基因 , 将其命名为 M al2cyMDH。进化树分
析表明 , cyMDH在动物、植物和细菌中同源性较高 , 几乎所有的 cyMDH可以被聚在一个亚组。同一
种 MDH物种间的相似性超过了不同 MDH物种内的相似性 , 按照细胞器内源共生起源理论 , 此现象
的原因可能是共同的 MDH 基因在细菌入侵真核生物形成细胞器之前 , 已经复制形成不同种类的
MDH, 并且 MDH的分化在物种分化之前 (McA lister2Henn, 1988; Gray et al. , 2001)。因此 , cyMDH
可能代表了最原始种的 MDH, 进而进化为各种类型的 MDH。当然 , 不同种类的 MDH的关系是非常
复杂的 , 要明确它们之间的起源进化关系仍需要更多的氨基酸序列信息。
苹果酸在果实中的积累不同于果实发育的其他过程 , 例如 , 乙烯合成和细胞壁降解受果实高度特
异表达基因的控制 (Callahan et al. , 1993) , 而苹果酸的积累受到合成、分解以及贮藏等相关基因的
控制 , 分析起来要复杂的多。但在苹果 (V isser & Verhaegh, 1978; Maliepaard et al. , 1998; 姚玉新
等 , 2006)、桃 ( Yoshida, 1970)、葡萄 (Boubals et al. , 1971)、柚子 (Cameron & Soost, 1977) 和番
茄 ( Stevens, 1972) 上的研究都表明 , 果实的低酸性状由一对主效基因控制。主效基因经过一系列
调控最终通过苹果酸代谢关键酶起作用 , 通过转录、蛋白含量及酶活性分析可以明确代谢关键酶基因
的表达与苹果酸积累的关系。本研究克隆了 cyMDH基因并通过原核表达得到的融合蛋白证明了 cyM2
DH催化一个可逆反应 , 但主要是负责苹果酸的合成。在空载体及空表达载体的蛋白粗体液检测到极
微弱的 MDH酶活性 , 暗示了大肠杆菌中存在 MDH同工酶 , 但通过表达载体上的 H is标签纯化得到的
融合蛋白可以排除其它 MDH的影响 , 保证了试验的准确性。另一方面 , 果实中的 cyMDH酶活性在
高酸和低酸果实中存在明显差异 , 暗示了 cyMDH在表达水平上可能存在差异 ; 尤其是从花后 90 d开
始 , 高酸和低酸果实中 cyMDH活性都开始逐渐升高 , 而低酸果实的苹果酸含量却一直下降 , 高酸果
实后期苹果酸含量也下降 , 表明除 cyMDH外其它代谢关键酶对苹果酸的含量也产生了影响。需要指
出的是本试验 cyMDH的提取过程中不能完全排除其它细胞器 MDH的污染 , 可能会影响酶活性的绝
对值 , 但不会影响酶活性变化的总体趋势。
明确 cyMDH基因的表达与苹果果实中苹果酸积累的关系 , 通过转基因获得适合加工的高酸苹果
资源是下一步研究的目标。
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