全 文 ：园 艺 学 报 2008，35(7)：973—978
Acta Horticuhurae Sinica
番木瓜凝乳蛋白酶基因启动子的克隆及功能研究
杨英军 ，周 鹏 ，李艳梅 ，沈文涛
( 河南科技大学林学院，河南洛阳 471003； 中国热带农业科学院热带生物技术研究所，热带作物生物技术国家重点
实验室，海1：3 571101)
摘 要：采用 PCR技术从番木瓜 (Carica papaya L．)品种 ‘穗中红’克隆了木瓜凝乳蛋白酶基因的
部分序列及其5 侧翼序列，构建含有两种长度启动子片段的植物表达载体，并用基因枪轰击番木瓜叶组织
和农杆菌转化烟草叶盘。结果表明，克隆产物长 7l9 bp，163 bp的3 侧翼序列与 GenBank中的番木瓜凝乳
蛋白酶基因序列同源性为99％，556 bp的 5 侧翼序列有基础启动子区，转录起始位点位于 ATG上游 38 bp
的T。序列登录号为 AY803756。预测在启动子区存在 TATA—box、CAAT—box、WUN和 HSE等顺式作用元
件。两种启动子片段驱动的 GUS基因瞬时表达和稳定表达结果表明，该启动子片段具有乳管特异表达活
性 。
关键词：番木瓜 ；木瓜凝乳蛋白酶；启动子；序列分析；基因表达；乳管
中图分类号：S 667．9 文献标识码：A 文章编号 ：0513-353X (2008)07-0973-06
Cloning and Functional Analysis of a Novel Chymopapain Promoter from
Carica papaya
YANG Ying-jun 一，ZHOU Pengh，LI Yan．mei ，and SHEN Wen．tao
( Colege ofForestry，ltenan University ofScience and Technology，Luoyang，Henan 471003．China； National Key Biotechnol—
ogy Laboratoryfor Tropical Crops Institute of Bioscience and Biotechnology，Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences，
Haikou 571 101，China)
Abstract：A partial gene sequence and 5 flanking sequence of chymopapain were isolated from the ge·
nomic DNA of Carica papaya via PCR technology．The results of alignment indicated that the isolated DNA se—
quence had 99％ homology with that of the chymopapain gene in papaya．The core promoter regions and some
upstream regulatory elements in this fragment were analyzed．Transcriptional start site(TSS)was T predicted
by the software of PROMOTER PREDICTION and PLANT CARE TATA·box，CAAT·box，WUN，HSE re·
gions and other cis·elements were found ineooespanding promoter sequence regions with others．Compared with
the data in GenBank，the results showed that a novel promoter was obtained，the GenBank accession number
is AY803756．Binary vectors were then constructed，GUS expressions were both observed in papaya leaves
transfe~ed via particle bombardment and tobacco plantlet mediated by agrobacterium．GUS activities were de·
tected only in latex．
Key words：Carwa papaya ；chymopapain；promoter；sequence analysis；gene expression；laticifer
番木瓜 (Carica papaya L．)酶学及相关生物技术研究是近年来相当活跃的一个领域 (汪卫星
等，2006；杨英军和周鹏，2007)。木瓜凝乳蛋白酶 [Chymopapain，亦称 papaya proteinase I (PP
lI)]，E．C=3．4．22．6)是木瓜胶乳主要巯基蛋白酶中水解和凝乳活性最强，含量最高的一种，约占
干瓜乳的30％，具有重要的医药价值，其中以注射治疗椎间盘突出症的临床应用最为成功 (Starley＆
收稿日期：2008—0l一02；修回日期：2008—05—26
基金项目：国家 ‘863’计划项目 (2002AA241141)；河南科技大学人才科学研究基金项目 (05018)
通讯作者 Author for correspondence(E-mail：zhp630 1@1 26．tom)
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Mohammed，1999)，还可以用于肿瘤的辅助治疗 (Pendzhiev，2002)。
Chymopapain蛋白在乳管中特异表达的特性使番木瓜很适合作为生物反应器，可构建具有乳管特
异表达活性的外源基因转化载体，将外源基因转入番木瓜并在乳管中特异表达，从而使番木瓜变为药
物生产工厂 (Revel et a1．，1993；张更林 等，2000；杨英军和周鹏，2005)。在转基因研究中，启
动子的选择影响外源基因的转录效率，从而导致基因的表达量、表达时期以及表达的组织细胞的专一
性发生变化。因此，分离、克隆高效表达、分泌量大的chymopapain基因启动子，揭示基因表达及调
控的机制，对于外源药物蛋白大量表达，开发番木瓜作为一种植物疫苗具有十分重要的意义。
1 材料与方法
1．1 材料及菌种
番木瓜 (Carica papaya) ‘穗中红’取 自中国热带农业科学院热带生物技术研究所。大肠杆菌
Escherichina coli DH5a、农杆菌 GV3lO1和载体pCAMBIA1301均为本研究所保存。植物转化受体选用
穗中红和烟草 (Nicotiana tubacum NC89)组培苗。
1．2 启动子克隆
1．2．1 总DNA提取、PCR引物设计与合成 采用改良CTAB法提取番木瓜幼嫩叶片总 DNA。根据报
道的chymopapain基因cDNA序列 (登录号 X07789)设计下游引物。S1：5 r_cagcaaacacattaatccaagcca一
3 ；s2：5 一gctcaacatccacgatcaaatagctg．3 。Genome Walking试剂盒提供两个接头引物 (上游引物)。
C 1：5 一gtacatattgtcgttagaacgcgtaatacgactca一3 ； C2：5 -cgtagaacgcgtaatacgactcactatagggaga一3 。
1．2．2 基因组的酶切、PCR反应、克隆和测序 用 EcoR I，Sal I和Xba I酶切基因组，分别加接头
后用作模板。分子操作参照 Genome Walking、pGEM-T—easy和 Wizard DNA clear up试剂盒说明进行。
重组质粒酶切鉴定纯化后，由大连宝生物公司测序。
1．2．3 序列的同源性搜索 序列同源性分析采用 BLASTn软件完成，用 BANKIt程序申请登录号，同
时采用在线启动子分析软件，进行转录启始位点查找。
1．3 启动子功能的研究鉴定
1．3．1 表达栽体的构建 根据chymopapain基因启动子序列测序结果，设计并合成用于分离不同长
度启动子序列的 PCR正向引物 QDZ1、QDZ3和反向引物 QDZ2。为克隆方便，在引物 5 端分别加
Hind1I和 Nco I位点，QDZ1的序列为：5 一ccg AAGCTTtctagaaacacatataatcctgcag一3 (36 bp)；QDZ2：
5 一ata CCATGGt aacactag ctaactctcaagag一3 (34 bp)；QDZ3：5 一agt AAGCTFtatcatctacctactcag一3 (27 bp)。
以包含全长启动子序列质粒为模板，扩增获得不同长度启动子片段，其 PCR反应程序为 95℃
5 rain，接着94℃30 S，40℃ l min，72℃ l min，40个循环，最后在72℃延伸 10 min。回收目的片
段后分别与 pGEM—T—easy连接，再用 Hind 1I和 Nco I酶切，回收后与用经同样酶切的载体 pCAM—
BIA1301大片段连接，得到不同长度的启动子表达载体。
1．3．2 启动子功能鉴定 基因枪介导的 GUS基因在番木瓜叶片中的瞬时表达：取温室栽植的番木瓜
幼苗嫩叶，70％酒精消毒，灭菌蒸馏水冲洗数次后晾干。稍加修整平铺于用液体培养基 (MS+0．5
mol·L 甘露醇)浸湿的滤纸上，28℃摇床暗培养 24～48 h，用各载体包埋的微弹进行轰击。微弹
的制备与轰击，参见Bio—Rad公司基因枪操作规程。
农杆菌介导的GUS基因在烟草中的转化及 PCR检测：电激法将载体转化入农杆菌 GV3101，并转
化烟草叶盘。农杆菌浸染叶盘后3～5 min，转移到选择培养基 (MS+1．0 mg·L BA+35 mg·L
Hyg+500 mg·L Carb)上，于25℃、光强3 000 lx(光照 12 h，黑暗 12 h)培养箱中培养至抗性
芽出现；3～4周后将 2～3 cm长抗性芽接到生根培养基 (Ms+0．1 mg·L NAA+35 mg·L。。Hyg+
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7 期 杨英 军 等 ： 番木瓜 凝乳蛋 白酶基 因启动子 的克隆及功能研 究 975
500 m g ? L
— C arb) 上 ， 2 ～ 3 周后取 叶片进行 P C R 分析和 G U S 检测 。
利用 相应 引物对各 5 ’缺失载体转化 的烟 草植 株 叶片总 D N A 进行 P C R 鉴 定 。 将 阳性株 移栽 至 温
室 ， 以对启动子进 一 步的功 能检测 。 G U S 活性 检测参考 J efferson (1987 ) 的方 法进行 ， O lym pus 显 微
镜下 观察照相 。
2 结果 与分析
2． 1 启动子 片段的克隆与序 列分析
经 两轮巢式 P C R 反 应 ， 在 以 X ba I 酶切 基 因
组 为模板 的 P C R 产物 中获得 了 一 个较 大 的片段 ，
命名 5 B ． 800 (图 1 )。
经 回 收 、 连 接 、 鉴 定 和 测 序 ， 5 B 一 800 全 长
752 bp， 去 掉 接头 引物 后 还 有 7 19 bp。 将该 7 19
bp 序列登 录 NC B I 并 B L A S T n ， 发现 5 ’端长 556 bp
的片段 没有任何 同源 片段 ， 3 ’端长 163 bp 序列与
番木瓜 chym opapa in 基 因 序 列 同源 性 高 达 99 ％ ，
表明克 隆到 了 chym opapain 基 因 的 启 动 子 ， 该 启
动子 区 长 556 bp。 将 该 序 列 提 交 ， 登 录 号 为
A Y 803756 (图 2 )。
1 A 4 A 5 A M lB 4 B 5B
? - 一 5B - 800
图 1 两 轮 P C R 扩增 的 电泳 结果
1 、 4 和 5 分别为 E coR I 、 S alI 和 X ba I 酶切产物 ；
A 为第 1 次扩增结果 ； B 为第 2 次扩增结果 ； M 为分 子量 标准 。
F ig． 1 T he electrophoresis profi e ofP C R am plification produ cts
1 ， 4 and5 ： G enom ic D N A dige sted w ith E co R I ． S alI and
X ba I ； A ： T he am plification products offirst P C R ；
B ： T he products ofsecond P C R ； M ： M arker (D L l5000 )．
对获得的 chym opapain 基 因启动子转录起 始位点进 行预 测 ， 发 现 在 4 78 ～ 528 bp 的位置 存在 可 能
的基础启动子 区 ， 预测转录起始位点位于 翻译起始密码 子 A T G 前 38 bp 的 T 。 对该序列进行分析 ， 发
现 A T G 上 游除了存在多个 ’rA rA — box 和 C A A T ． box 外 ， 还 有如 H S E 是热激响应元件 ， E R E 是 乙烯响应
元 件 ， W U N 是伤害响应元 件等顺 式作用 元 件 (图 2)。
l tctagaaaca cattataattcctgcagata ttttataaaa aaatU gaggaaaatatggtaacgaaaaataaataggattcttttttttc cccc‘：团 a tgtaattaat
H S E C A A T - box
12lttgctttt,
m atatattgta agtaaggtta tteatgaaattaact园 aaggaaataa ttcatttatttgttggaattattcgattattatatatatttaatttttta attgacttga
C A A T - box
24 1 aatactgaattgcactaaaa aaaattaetgagattaacgc taaacttatc ctatgagtta agttaR ~ aaatatcatc tacctactca gattaaaacE盈 ca仕acgactgtatat
— — — — — — — — — — — — — — ◆
H S E 【壬Z 口v E R E C A A T - box f盯 YN
361 tagaaatcctaaattcactgaggttaaaatggtttaatet必 ttgc taaccctaaa atgacggtgc aagtagagtgaatgacaaga tcttttatttagagagaaagaaaottgatt
C ：~ T - box H S E
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图 2 chym opapain 基 因启动子 序 列及 其顺 式作 用元件分析
单下划线为预测 的基础启动子 序列 ， 较大 的黑 体字母 T 为预 测的转录起始位点 ， 阴影 部分为基 因编码 区 和 预测 的作用 元件
方框内为 T A T A — box ， C A A T — box 元 件和 翻译起始密码 子 A T G ， 箭头为载体构建时设计的引物位置 和方 向 。
F ig． 2 T he sequen ce ofchym opapain prom oter and its cis? action elem ents analysis
T he core prom oters ， the transcription startsites (T S S )， gene code region and predicted cis- elem en ts ， startcode A T G ．
T A T A — box ， C A A T — box ， prim ers sequ ence design ed for vectors ， are indicated by single underlin e ，
black and large letter ， shadow ， fram e and arl~ w s ， respectively．
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976 园 艺 学 报 35 卷
图 3 不 同长 度启动子 驱 动 G U S 基 因在番木瓜 叶片 (A — D )、 烟 草 叶片 (E — H ) 和 番木瓜 果 实 II — L ) 中的表 达
F ig． 3 T he histochem isty detection results ofpapaya leaves (A — D )， transgenic tobaccos leaves (E — H ) and
papaya fruits (I — L ) driven by the deleted prom oter
A ． E and I ： pC A M B IA 1 ； B ， F and J ： pC A M B IA 2 ； C ， G an d K ： pC A M B IA 1301 ； D ， H and L ： C on tr0 1．
2 3 4 5 6 7 8 2 3 4 5 6
A B
图 4 不 同长度 chym opapain 基 因启 动子 驱 动 G U S 基 因在瓜 乳 中的瞬 时表达
A ： 瓜 乳上 清液用各种载体处 理 ； B ： 启动子驱 动 G U S 基 因在瓜 乳 中的瞬时表 达 。
F ig． 4 T he G U S detec tion res ults ofth e deleted prom oter ofchym opapain gene in latex
A ： T he resuits ofthe plan t chim eric plasm ids in upper latex ； B ： T he detection results ofthe deleted prom oter ofchym opapain gen e in latex ．
A ： 1 ． U pper latex (contr0 1)； 2 ． pC A M B IA 1301 (contr0 1)； 3 — 5 ． pC A M B IA 1 ； 6 — 8． pC A M B IA 2 ．
B ： 1 ． L atex (contr0 1)； 2 ． L atex + X — glue (contr0 1)； 3 ． pC A M B IA 1301 + latex (contr0 1)；
4 ． pB ll21 + latex (contr0 1)； 5 ． L atex + pC A M B IA l；6 ． La tex ’ pC A M B IA 2 ．
2 3 4
A
2 5 3 4
圈
图 5 农杆菌悬 液未加 瓜 乳 (A ) 和 加 瓜 乳 (B ) 的 G U S 染色检测
F ig． 5 T he G U S detection results ofth e deleted prom oter ofchym opapain gene in A grobacterium
A ： D etection results ofthe A grobacterium w ithou tlatex ； B ： D etection results ofthe A groba cterium w ithin latex ；
1 ． G V 3301 (con tr0 1)； 2 ． pC A M B IA 130 1 (con tr0 1)； 3 ． pC A M B IA 1 ； 4 ． pC A M B IA 2 ； 5 ． L atex ．
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7期 杨英军等：番木瓜凝乳蛋白酶基因启动子的克隆及功能研究 977
2．2 chymopapain基因启动子缺失载体的构建
根据克隆的chymopapain启动子序列，设计并合成用于获得缺失片段的PCR引物 (位置见图2)，
扩增获得不同长度启动子片段，回收后与经过同样酶切的载体 pCAMBIA 1301大片段连接，鉴定后得
到重组质粒，分别命名为pCAMBIA 1和pCAMBIA 2。
2．3 启动子驱动 GUS基因在番木瓜叶片组织中的瞬时表达
采用基因枪将载体pCAMBIA 1、pCAMBIA 2以及对照pCAMBIA 1301轰击进入番木瓜叶片，轰击
后暗培养2 d的叶片经 X．Gluc染色和脱色后，显微镜下观察 GUS染色情况。结果表明，两种长度的
启动子片段都能驱动 GUS基因表达，在轰击部位均出现一些蓝色斑点 (图3，A、B)，而非转化组织
中无蓝色斑点 (图3，D)；各种载体的GUS染色部位主要分布在输导组织叶脉中，而对照组成型35S
启动子在叶脉及叶肉中均有较深的染色 (图3，C)，因此可以初步推断该启动子具有输导组织表达特
异性 (即乳管特异性)。
2．4 启动子驱动GUS基因在烟草叶片中的稳定表达
取PCR筛选的烟草幼苗叶片，X．Gluc染色和脱色后，显微镜下观察 GUS组织化学染色情况。结
果表明，不同启动子片段也都能驱动 GUS基因表达 (图3，E、F)，并且表达水平均较高，接近于对
照pCAMBIA 1301中的35S启动子驱动的GUS基因表达 (图3，G)，几乎所有处理的叶片全部染成较
深的蓝色，而非转化组织中无 GUS表达 (图3，H)。GUS染色部位主要分布在叶脉中，而作为对照
的组成型35S启动子在叶脉及叶肉中均有较强的染色。因此，推断两个启动子片段均具有驱动活性并
具有乳管特异性。这个结果与基因枪轰击番木瓜叶片转化结果基本吻合。
2．5 启动子驱动GUS基因在果实中的表达
用农杆菌悬液对番木瓜果实的侵染表达研究中，含有两个启动子片段的表达载体浸染的果实都检
测到了 GUS基因的表达 (图3，I、J)，而在对照 (空白农杆菌悬液浸染的果实)中没有蓝色表现
(图3，L)，进一步证明了这些启动子的果实表达特性。
2．6 启动子驱动GUS基因在瓜乳中的表达
番木瓜瓜乳是乳管细胞中有活性的内含物，含有与基因转录和翻译有关的物质，因此可以利用这
一 天然的活性产物进行启动子功能的研究。分别将载体、农杆菌与显色底物加到瓜乳和瓜乳上清液
中，在适当温浴条件下保持1～2 d，发现各载体在瓜乳中均有蓝色表现，只是显色的深浅有差别，表
明各启动子都有启动 GUS基因表达的活性；而在瓜乳上清液没有显色，表明瓜乳上清液中不含使
GUS基因表达的活性成分 (图4，图5)，证明各启动子只在瓜乳中特异表达，而在瓜乳上清液中不
表达。
3 讨论
3．1 启动子的克隆与表达活性
从 ‘穗中红’番木瓜基因组中获得了chymopapain基因的启动子区，并进一步将启动子的两个不
同缺失片段与报告基因 GUS融合，构建植物表达载体，采用基因枪轰击转化番木瓜叶片和农杆菌介
导转化法转化烟草，组织化学检测结果表明该启动子是一种高强度的乳管组织特异性启动子。chymo．
papain基因的两种缺失片段都有活性，表明 1～304 bp问的序列包含有正调控序列或增强子元件，
304～556 bp(252 bp)间的序列包含有乳管特异表达的序列。另外，在这些调控区还存在许多转录
因子结合位点，哪些转录因子在哪些功能区参与了启动子活性调控，需进一步研究。
3．2 关于番木瓜的乳管
关于泌乳植物泌乳管的研究，国内外主要集中于巴西橡胶树，发现了多种橡胶树的乳管类型
(Zhao，1987)，已经证明橡胶树的乳管组织是合成与贮存橡胶胶乳的地方，是决定橡胶产量的最重
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978 园 艺 学 报 35卷
要的结构成分 (张治礼 等，1996)。
同橡胶树一样，番木瓜的乳管是原生质结构局部退化而又局部保持高度分化的细胞群，属于有节
联结类型，由一系列管状乳细胞错综连接的网状系统，连接处细胞壁融化贯通，乳汁互相流动。它起
源于分生组织，是分布于韧皮部中的一类分泌组织或输导组织。其分化发育的超微结构研究仅见于
Zeng等 (1994)的报道。后来韦群辉和唐自明 (2000)研究了番木瓜果实的显微结构，证明番木瓜
果实的维管束是散在于皮层的薄壁组织。Vanessa等 (2002)报道木瓜蛋白酶和拟南芥的xylem pepti—
dase XCPI具有共同特性，而已知xylem peptidase XCP1是一个特异表达于木质部的蛋白，有理由认为
番木瓜的乳管应属于输导组织的维管系统。因此，本研究的基因枪转化和农杆菌介导转化材料的检测
都是对转化叶片的叶脉部位进行的，叶脉部位显示蓝色，即表明相应片段的启动子具有驱动 GUS基
因表达的功能，具有乳管表达特性。
下一步工作是分离更长的5 启动子区域的上游序列，并对该序列进行系列缺失，构建包含不同
长度的启动子缺失片段的植物表达载体，通过转基因研究，确定增强子区和启动子活性区等，并在此
基础上构建高效表达载体，驱动有重要免疫功能的外源蛋白高效表达，开发番木瓜使其成为一种植物
疫苗。
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