全 文 ：园 　艺 　学 　报 　2006, 33 (2) : 239～243
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2005 - 03 - 04; 修回日期 : 2005 - 06 - 023 通讯作者 Author for correspondence ( E2mail: hrshu@ sdau1edu1cn)
苹果 apeta la2同源基因的克隆和转化研究
周盛梅 1 　宿红艳 2 　王　磊 2 　张宪省 3 　束怀瑞 13
(1 山东农业大学园艺科学与工程学院 , 泰安 271018; 2 烟台师范学院生命科学学院 , 烟台 264025; 3 山东农业大学生
命科学学院 , 泰安 271018)
摘 　要 : 利用同源克隆的方法从苹果的花芽中分离出 apeta la2的同源基因 MA P2。MA P2全长 2 212 bp,
编码 549个氨基酸。分析表明 , MA P2具有 A P2家族典型的结构域 , 是苹果的 A P2同源基因。Southern杂交
结果表明 , MA P2在基因组中以低拷贝形式存在。采用 RT - PCR的方法分析 MA P2在不同组织中的表达 ,
结果显示 , MA P2在苹果营养组织、花芽以及不同花器官中均有表达 , 与拟南芥的 A P2、矮牵牛的 PhA P2A
的表达模式一致。为确定 MA P2在苹果中的生物学功能 , 构建了 35S∶MA P2正义表达载体 , 并对 ‘皇家嘎
啦 ’苹果进行了农杆菌介导的遗传转化。
关键词 : 苹果 ; apetala2; 基因克隆 ; 表达分析 ; 转基因
中图分类号 : S 66111　　文献标识码 : A　　文章编号 : 05132353X (2006) 0220239205
C lon ing and Tran sforma tion of ape ta la2 Hom ologues Genes from Apple
Zhou Shengmei1 , Su Hongyan2 , W ang Lei2 , Zhang Xiansheng3 , and Shu Huairui13
(1 Institu te of Horticulture Science and Engineering, Shandong A gricultural U niversity, Taipian 271018, China; 2 College of L ife
Sciences, Yantai N orm al U niversity, Yan ta i 264025, China; 3 College of L ife Sciences, Shandong A gricultural U niversity, Taipian
271018, China)
Abstract: MA P2, with homology to A rabidopsis A P2, was isolated from the flower buds of app le (M a lus
dom estica Borkh). MA P2 cDNA is 2 212 bp long and encodes a 549 am ino acid p rotein. L ike other A P2
genes, MA P2 encodes a p rotein containing two distinct A P2 domain, a transcrip tion2activating domain and a
putative nuclear location signal. This indicates thatMA P2 is a homologue of A P2 in app le. A lthough the hom2
olog among the three p roteins in the putative nuclear location signal is 100% , MA P2 shares only 4511% and
5512% sim ilarity with A P2 and PhA P2A , respectively. This reflects the diversity in the function of A P2 gene
fam ily excep t for acting in the nuclear. RT - PCR analysis showed thatMAP2 is exp ressed in floral buds, all
floral organs and vegetative organs, which is sim ilar to the exp ression pattern of A P2 and PhAP2A. To study
the function ofMA P2 in app le, we introduced the sense MAP2 under the control of 35S p romoter of Caulif low er
m osa ic virus into Royal Gala p lants.
Key words: App le; apeta la2; Gene cloning; Exp ression; Transgenic
通过对模式植物拟南芥突变体的研究 , 人们分离到一系列调节花发育的重要基因 , apetala2基因是
其中之一 , 参与花分生组织建立和花器官形成过程中基因表达的调控〔1, 2〕。已经从玉米、矮牵牛、风信
子等植物中相继克隆到了 AP2的同源基因〔3～5〕。这些基因内部均含有高度保守的 AP2结构域 , 并且在表
达模式上具有一定的相似性〔6〕。但是迄今为止对于 AP2及 AP2结构域的结构和功能尚未完全确定。
虽然果树不是研究成花机制的理想材料 , 但是如果将在模式植物中获得的理论和运用的实验技术
应用于果树学研究 , 将有助于在植物花发育研究领域获得新的进展。本研究对苹果的 A P2同源基因
MA P2进行克隆和表达模式分析。为了确定 MAP2在苹果中的生物学功能 , 我们构建 35S∶MA P2正义
表达载体 , 并对 ‘皇家嘎啦 ’苹果进行农杆菌介导的遗传转化。这将对进一步研究 MA P2的功能具
有重要意义。
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1　材料与方法
111　植物材料
苹果 (M a lus dom estica Borkh. ) 栽培品种 ‘红玫瑰 ’取材于山东农业大学农场自然条件下生长的
植株。在花芽分化期剥取花芽 , 用液氮速冻 , 保存于 - 80℃。
112　总 RNA的提取和 cD NA的克隆
总 RNA的提取采用 CTAB方法〔7〕。取 2μg处于分化期的花芽的总 RNA , 用 B26为引物进行反转
录。引物 B26 由中国科学院遗传与发育所薛勇彪博士惠赠 , 序列为 5pi2GACTCGAGTCGA2
CATCGATTTTTTTTTTTTTTTTT23pi。
根据 A P2及其同源基因的 A P2结构域内高度保守的 W ESH IW和 HKCGHW E序列 , 设计了简并引
物 P1 〔5pi2TGGGA (A /G) TC ( G/C /T) CA ( C /T) AT ( C /T) TGGGA23pi〕和 P2 〔5pi2TCCCA (A /
G/C) (C /T) ( G/T) (A /G) CC (A /G) CA (C /T) TT (A /G) TG23pi〕, 进行 RT - PCR扩增。反
应条件为 94℃预变性 3 m in; 94℃变性 45 s, 56℃退火 45 s, 72℃延伸 60 s, 35个循环 ; 最后 72℃延
伸 10 m in。将扩增出的约 280 bp的片段连接到 pGEM 2T easy载体上 ( Premega) , 并进行序列测定。3pi
末端扩增 : 根据已知序列 , 设计特异引物 P321 ( 5pi2TGAAGAAGACTTGAAGCAGATGAG23pi) 和 P322
(5pi2TTTGTGCATGTACTTCGCCG23pi) , 经过巢式 PCR ( nested2PCR) 得到约 1 200 bp的 cDNA片段 , 克
隆到 pGEM 2T easy载体进行序列测定。5pi末端扩增 : 方法同上 , 设计特异引物 P521 (5pi2AAATTTAT2
GTCCGCCACTCCC23pi) 和 P522 (5pi2CAAATCCACCAAGATAAAC23pi) 进行 5piRACE PCR, 扩增出约 800
bp的片段 , 并测序。全长 cDNA的扩增 : 根据得到的 cDNA 5pi端和 3pi端非编码区序列 , 设计两组特
异引物 PQ521 ( 5pi2TTCCTTGTTCAAGTTGATGCC23pi) , PQ522 ( 5pi2TTGCCACGCTGAATTCTGAGT23pi) ,
PQ321 (5pi2GTTAGTTGGACAAAATGACC23pi) 和 PQ322 ( 5pi2AACACCAAAGAGAGCATGCA23pi)。以 PQ52
1和 PQ321为引物进行第 1次 PCR反应 , 再以 PQ522和 PQ322为引物进行第 2次 PCR反应得到 1条约
2 kb的 DNA片段。从两个方向进行测序后命名为 MA P2。引物在基因中的位置如下 :
113　M A P2在不同组织中的表达
提取叶片、花芽、萼片、花瓣、雄蕊、子房和幼果中的总 RNA, 经 DNaseⅠ (RNase2free) 消化
后 , 取 2μg用 Access RT - PCR System试剂盒 ( Premega公司 ) 进行反转录 , 合成第 1条 cDNA。以
PQ522和 PQ322为引物进行 PCR反应。反应程序如下 : 94℃预变性 3 m in; 94℃变性 1 m in, 56℃退火
1 m in, 72℃延伸 90 s, 35个循环。取 5μL的 PCR产物 , 用 1%琼脂糖凝胶电泳分离后在 1μg /mL溴
化乙锭 ( EB) 溶液中染色。
114　基因组 D NA的提取及 Southern杂交分析
采集 ‘玫瑰红 ’苹果春季新发幼叶 , 提取基因组 DNA〔8〕。用限制性内切酶 EcoR Ⅰ和 N coⅠ
( Takara公司 ) 分别将 DNA 完全酶解。取 10μg酶切产物 , 电泳分离后将 DNA 转移到尼龙膜上 ,
65℃预杂过夜。以 MA P2的 3pi端非保守区为模板 , 采用随机引物法合成 32 P标记的探针 ( Primer a
gene labeling system, Premega) , 65℃杂交 24 h。用洗膜液依次洗膜后 , 将 X光片置于膜上 , 于 - 70℃
进行放射自显影。
115　M A P2正义表达载体的构建
在 MA PⅠ基因 3pi端非编码区设计特异引物 PQS322 (5pi2CCACTAGTAACACCAAAGAGAGCATGCA2
3pi) (下划线示 SpeⅠ酶切位点 ) , 以 112中的反转录产物为模板 , 以 PQS322和 PQ522为引物进行 PCR
扩增。反应程序是 : 94℃预变性 3 m in; 然后进行以下循环 : 94℃变性 45 s, 60℃退火 45 s, 72℃延伸
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　2期 周盛梅等 : 苹果 apeta la2同源基因的克隆和转化研究 　
1 m in, 共进行 30个循环 ; 最后 72℃延伸 10 m in。扩增出约 2 kb的特异条带。将 PCR产物与 pMD182
T载体连接 , 并测序鉴定。将筛选到的重组子用 X baⅠ和 SpeⅠ ( Takara) 双酶切后电泳回收 2 kb片
段。同时 , 用 X baⅠ和 S peⅠ双酶切表达载体 pB I121, 电泳回收载体片段。取 5μg pB I121载体片段和
1μg MA P2片段混合 , 用 DNA连接试剂盒 ( Takara公司 ) 将 MA P2正向插入 pB I121的 35S启动子下
游。将连接产物转化 DH5α并进行双酶切鉴定。
116　‘皇家嘎啦 ’苹果的遗传转化
参照文献 〔9〕的方法进行遗传转化。将构建的表达载体 pB I1212MAP2转入农杆菌 LBA4404。切
割好的外植体于农杆菌液中浸蘸 , 取出后转移到与悬浮农杆菌相同的液体培养基中 , 黑暗条件
(25℃) 下培养 2～3 d。将外植体用灭菌水充分清洗后 , 用无菌滤纸吸去多余液体 , 转移到预筛选培
养基 (MS附加 6 -苄基嘌呤 410 mg/L、吲哚乙酸 014 mg/L、羧苄青霉素 250 mg/L) 中 , 黑暗条件下
培养 3～4 d。然后移入筛选培养基 (MS附加 6 -苄基嘌呤 410 mg/L、吲哚乙酸 014 mg/L、羧苄青霉
素 250 mg/L、卡那霉素 20 mg/L) 中 , 在黑暗条件下培养 3～4 d后转光照条件下 (25℃, 16 h光照
和 8 h黑暗 ) 培养 6周。期间每 2周更换 1次新鲜选择培养基。选取抗卡那霉素的新梢 , 在附加 20
mg/L卡那霉素的增殖培养基上扩繁。在 1 /2 MS附加吲哚乙酸 011 mg/L的生根培养基上诱导生根。
图 1　MA P2与 A P2、PhA P2A的氨基酸序列的同源性比较
阴影部分表示序列的同源性 100%。下划线表示两个保守的重复区域 AP2 domain, 下划虚线表示转录激活区域。
核定位信号 ( KKSR) 序列用方框标出。
F ig. 1　A lignm en t of the deduced am ino ac id sequences of MA P2 w ith A P2 ( A rabidopsis) and PhA P2A ( petun ia)
Dark shading with white letters reflects 100% sequence conservation. The underlined am ino acid indicate the two conserved
A P2 domain, and the nuclear location sequence ( KKSR) and transcrip tion2activating domain
are indicated by a box and dashes, respectively.
2　结果与分析
211　M A P2的克隆及序列分析
为研究 A P2同源基因在苹果花发育过程的作用 , 利用同源克隆的方法从苹果早期花芽中分离出
全长约 212 kb的 cDNA片段。该 cDNA全长为 2 212 bp, 编码 549个氨基酸。序列分析结果显示 (图
1) , 其氨基酸序列具有 AP2家族成员的典型特征 , 具体表现为 : 内部含有两个高度保守的重复序列
即 AP2结构域 , 该结构域可以识别 DNA顺式作用元件并与之结合〔10〕。此外 , 在其 N端第 16～60氨
基酸之间有一富含丝氨酸的转录激活区域〔11〕, 在第 170～180氨基酸之间还含有 1个碱性区域 , 内含
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核定位信号 KKSR〔12〕。以上这些结果表明 , 我们已经从苹果中分离出 A P2的同源基因 , 该基因被命名
为 MA P2 ( forM alus A P2)。通过 MA P2与拟南芥的 A P2、矮牵牛的 PhA P2A 的氨基酸序列比较发现 ,
尽管 3个蛋白的核定位信号序列、两个 A P2结构域及其连接部分均具有较高的同源性 , 但 MA P2与
AP2和 PhA P2A的同源性仅分别为 4511%和 5512% , 其它区域氨基酸序列的显著差异预示了它们在功
能上可能存在很大不同。
212　M A P2在不同组织中的表达
采用 RT - PCR的方法分析 MA P2在不同组织
中的表达情况。结果显示 , 在叶片、花芽、萼片、
花瓣、雄蕊和子房中均扩增出长约 2 kb的条带 ,
只有在幼果中未检测到相应的条带 (图 2) , 说明
MA P2在营养组织、花芽以及不同花器官中均有
表达 , 与拟南芥的 A P2、矮牵牛的 PhA P2A 的表
达模式一致。
213　M A P2基因的 Southern杂交分析
如图 3所示 , 用两种限制性内切酶分别酶切
的 DNA均有多个杂交信号条带 , 但是信号强弱有
所不同 , 说明 MA P2在苹果基因组中是以低拷贝
形式存在的。
214　转基因植株的获得
为确定 M A P2基因的功能 , 根据 M A P2基
因的核苷酸序列 , 在起始密码子上游和终止密
码子下游分别设计特异引物 PQ5 22和 PQ S3 22 ,
以花芽总 RNA 的反转录产物为模板 , 扩增出
约 2 kb大小的 DNA 片段 , 序列测定证实该
DNA片段为 M A P2编码区 cDNA。将该片段正
向插入植物表达载体 PB I121的 35 S启动子的
下游 , 采用农杆菌介导法进行 ‘皇家嘎啦 ’苹
果的遗传转化 , 在筛选培养基上获得再生抗性
植株 (图 4 ) 。
图 2　不同组织 MA P2表达的 RT - PCR分析
1: 叶片 ; 2: 花芽 ; 3: 萼片 ; 4: 花瓣 ; 5: 雄蕊 ; 6雌蕊 ;
7: 子房 ; 8: 幼果。
F ig. 2　RT - PCR ana lysis of MA P2 expression in var ious tissues
1: Leaf; 2: Floral bud; 3: Sepal; 4: Petal; 5: Stamen; 6: Pistil;
7: Ovary; 8: Young fruit.
图 3　MA P2的 Southern杂交分析
1: 基因组 DNA; 2: EcoRⅠ酶切产物 ; 3: N coⅠ酶切产物。
F ig. 3　Southern blot ana lysis of MA P2 in apple
1: Genom ic DNA; 2, 3: Genom ic DNA digested by EcoRⅠ
and N coⅠ, repectively.
图 4　转基因 ‘皇家嘎啦’苹果植株的获得
A: 在增殖培养基上生长的 ‘皇家嘎啦’植株 ; B: 从转化的叶片上再生的绿色愈伤 ; C和 D: 在筛选培养基上生长的再生抗性植株。
F ig. 4　Tran sgen ic procedure of‘Roya l Ga la’
A: ‘Royal Gala’p lants in regeneration medium; B: Green callus regenerated from transformed leaves;
C and D: Transgenic p lants in selective medium.
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　2期 周盛梅等 : 苹果 apeta la2同源基因的克隆和转化研究 　
3　讨论
基于对 ap2突变体的分析 , 人们发现 A P2基因不仅在花瓣和萼片的形成过程中起重要作用 , 而且
与 AP1、L FY及 CAL等花的分生组织决定基因相互作用 , 参与花的分生组织的早期建立〔1, 2〕。但是
Maes等〔4〕获得的矮牵牛 A P2同源基因 PhA P2A的突变体没有表现出任何花发育相关的突变特征。本
研究从苹果花芽中分离出 AP2的同源基因 MA P2, MA P2与 A P2、PhA P2A的氨基酸序列比较结果 (图
1) 显示 , MAP2与 A P2和 PhA P2A的同源性仅分别为 4511%和 5512% , 除核定位信号序列和 A P2结
构域之外 , 这 3个基因的氨基酸序列差异很大 , 暗示在不同物种间 , 尤其在具有不同开花特性的物种
间 AP2同源基因的功能可能存在一定的差异。
尽管序列同源性分析和基因表达模式常常作为推测基因功能的重要标准 , 但是功能分析才能最终
说明它在植物发育过程中的作用。为确定 MA P2在苹果中的功能 , 我们构建 35S∶MAP2正义表达载
体 , 并对 ‘皇家嘎啦 ’苹果进行农杆菌介导的遗传转化 , 期望获得的转基因植株能够在花发育等方
面表现出某些特征 , 以验证 MA P2基因的功能。虽然在果树上进行遗传转化还存在许多障碍 , 如生长
缓慢 , 童期较长 , 但我们希望通过更多的尝试能够在果树上得到更直接的结果。
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