全 文 ：园 　艺 　学 　报 　2007, 34 (1) : 117 - 124
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2006 - 05 - 24; 修回日期 : 2006 - 11 - 20
基金项目 : 国家自然科学基金资助项目 (30671426) ; 浙江省重大科技项目 (2005C12019202)3 通讯作者 Author for correspondence ( E2mail: jshcao@zju1edu1cn)
白菜多聚半乳糖醛酸酶基因 B cM F6的克隆、序列
分析及其表达
张　强 , 黄　鹂 , 曹家树 3
(浙江大学蔬菜研究所 , 杭州 310029)
摘 　要 : 从白菜 (B rassica cam pestris L. ssp. ch inensis Makino) 核隐性不育两用系 ‘Bajh97201A /B’可
育株中分离得到的一个 cDNA2AFLP差异片段入手 , 利用 RACE技术成功克隆了一个花粉特异的多聚半乳糖
醛酸酶 ( PG) 基因 B cM F6的 DNA和 cDNA全长序列 , 并对其序列进行了分析。结果表明 , 该基因包含 4
个外显子和 3个内含子 , 最大开放阅读框为 1 194 bp, 编码 397个氨基酸序列 , 对推导的氨基酸序列进行
分析 , 1到 22个氨基酸是 1信号肽序列 , 其后有 4个平行β螺旋重复 ( PbH1) 结构 , 该序列包含 3个 N -
糖基化位点 , 4个蛋白激酶 c磷酸化位点 , 5个酪蛋白激酶 Ⅱ磷酸化位点 , 10个 N - 豆蔻酰化位点 , 1个
PG活性位点 (227 RVTCGPGHGIS1 IGS240 ) 等。将 B cM F6基因氨基酸序列与数据库中的其他 PGs基因进行同
源序列比对 , 构建系统进化树 , 发现该基因具有所有 PGs基因特有的 4个保守结构域 , 并且与花粉中特异
表达的 PG基因聚为一类 , 表明该基因是与花粉发育相关的多聚半乳糖醛酸酶基因。RT2PCR对其表达的研
究表明 , 该基因在可育株 (野生型 ) 的中大蕾、开放花和短角果中特异表达 , 进一步表明该多聚半乳糖醛
酸酶基因与白菜的花粉发育相关。
关键词 : 白菜 ; B cM F6; 花粉发育 ; 多聚半乳糖醛酸酶 ; 克隆
中图分类号 : S 63413　　文献标识码 : A　　文章编号 : 05132353X (2007) 0120117208
C lon ing, Character iza tion and Expression of a Polyga lacturona se Gene
B cM F 6 from Ch inese Cabbage2pak2cho i( B rassica cam pestris L. ssp. ch inen2
sis M ak ino)
ZHANG Q iang, HUANG L i, and CAO J ia2shu3
(Laboratory of Cell & M olecu lar B iology, Institu te of V egetable Science, Zhejiang U niversity, Hangzhou 310029, Ch ina)
Abstract: On the basis of one cDNA2AFLP differential fragment isolated from the fertile B line of
Chinese cabbage2pak2choi (B rassica cam pestris L. ssp. ch inensis Makino) nuclear recessive sterile A /B line
(Bajh97201A /B) , the full length DNA and cDNA of B cM F6 gene encoding pollen2specific polygalacturonase
were cloned by rap id amp lification of cDNA ends ( RACE). The gene consisted of 1 194 bp encoding a
p rotein of 397 am ino acids and was interrup ted by three introns of 81 bp, 95 bp and 127 bp in length.
Sequence analysis revealed that it has three N2glycosylation sites, four p rotein kinase C phosphorylation site,
five casein kinaseⅡphosphorylation site, ten N2myristoylation sites and one polygalacturonase active position
(227 RVTCGPGHGIS1 IGS240 ). And the first 22 am ino acids of the p redicted B cM F6 p rotein form a N2term inal
hydrophobic domain which disp layed the p roperties of a signal pep tide and four parallel beta2helix repeats
followed behind. Four domains which were highly conserved in all p lant and fungal PGs was p resent in
B cM F6. Phylogenetic analysis showed that B cM F6 falls into the category of clade2C, which included PG
related to pollen. These results showed that B cM F6 acts as pollen2specific polygalacturonase. Furthermore,
the exp ression using RT2PCR discovered that B cM F6 was exclusively exp ressed in m iddle and big flower bud,
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opened flower and slow pod of fertile line (wild type) , which showed B cM F6 closely related with the develop2
ment of flower.
Key words: Chinese cabbage2pak2choi; B rassica cam pestris ssp. ch inensis; B cM F6; Pollen;
Polygalacturonase; Clone
近几十年来花粉发育一直是研究的热点 , 已有许多与花粉发育相关的基因被克隆 , 其表达模式和
功能也得到了说明 (McCorm ick, 1993, 2004; Scott et al. , 2004; W ilson & Yang, 2004) , 尤其是对
拟南芥和水稻等模式植物的基因组序列测序的完成和已知许多植物物种有大量的 EST序列存在 , 人
们可以利用互联网上的公共资源和发展起来的花粉分析新技术 , 对花粉的发育有更加深入的了解
(McCorm ick, 2004)。例如两个花粉研究的团体 (Becker et al. , 2003; Honys & Twell, 2003) 利用微
阵列技术分析了拟南芥成熟花粉的基因表达模式 , 分别确定了有 1 584个和 992个基因是在花粉中表
达的 , 其中有近 10% (162个 ) 或 40% (397个 ) 是花粉特异的。对于基因组序列信息有限的物种 ,
cDNA2AFLP技术是鉴定基因表达和克隆新基因的较好方法 (McCorm ick, 2004) , 并已用于分析矮牵
牛花药不同发育阶段的基因表达模式 (Cnudde et al. , 2003)。
多聚半乳糖醛酸酶 (polygalacturonase, PG) 是一种细胞壁结合蛋白 , 可以催化果胶分子中 α2
(1, 4) -聚半乳糖醛酸的裂解 , 参与植物发育许多阶段的果胶降解 , 尤其是那些需要细胞分离的阶
段 (Hadfeild & Bennet, 1998)。PG基因在花粉的成熟、萌发和花粉管的生长中也起着重要作用 , 对
理解花粉发育具有重要意义。PG基因是一大基因家族 , 已有许多不同的花粉特异的 PG基因被克隆 ,
如玉米 (N iogret et al. , 1991; A llen & Lonsdale, 1992)、甘蓝型油菜 (Robert et al. , 1993)、烟草
( Tebbutt & Rogers, 1994)、苜蓿 (Q iu & Erickson, 1996) , 但未见在白菜中克隆的花粉特异 PG基因
的报道。我们采用 cDNA2AFLP技术从本实验室保存白菜 (B rassica cam pestris L. ssp. ch inensis Markino
var. comm unis Tsen et Lee) 核隐性雄性不育两用系 ‘Bajh97201 A /B’的可育株中发现一个长度为 357
bp的片段与 PG基因有较高的同源性 , 采用 RACE技术和 RT2PCR分析 , 以确定其是否为花粉特异表
达的 PG基因。
1　材料与方法
111　材料
材料为本实验室保存白菜核隐性雄性不育两用系 ‘Bajh97201A /B’, 经多代自交而成 , 遗传性状
稳定 , 可育株与不育株分离比例为 1∶1, 育性由 1对等位基因控制 , 不育株为雄配子减数分裂胞质分
裂 (m ale m eiotic cy tok inesis, mm c) 突变体。幼苗期取幼嫩叶片 ; 莲座期取莲座叶 ; 抽薹期和开花期分
别取花茎叶 , 花茎 , 五级花蕾 (Ⅰ级 : 横径 < 110 mm; Ⅱ级 : 横径 1～116 mm; Ⅲ级 : 横径 116～
212 mm; Ⅳ级 : 横径 212～218 mm; Ⅴ级 : 横径 > 218 mm ) , 开放花 , 嫩角果 , 用纱布包好 , 立即
投入液氮中固定 , 于 - 75℃保存备用。开花期调查编号植株的育性 , 根据育性鉴定结果 , 分别取同一
时期、同一育性的 15份总 RNA混合。
112　总 RNA和 D NA的提取及 cD NA全长和 D NA全长的获得
DNA提取方法采用 CTAB法 (王关林和方宏筠 , 2002)。RNA的分离参照 L ife Technologies公司
TR IzoLµ 的说明书进行。RNA沉淀室温干燥 5～10 m in, 用 DEPC水溶解 , - 75℃保存备用。
cDNA第 1链和第 2链的合成参照 SMARTTM PCR cDNA Synthesis Kit U serManual方法进行。以双
链 cDNA为模板 , 进行 RACE扩增。根据双链 cDNA合成试剂盒的特征设计了锚定引物 , 3′2RACE
为 : 5′2GTGGTAACAACGCAGAGTACTTTTT23′, 5′2RACE 为 : 5′2ACACTCAGAGTACGCGGG23′, 根 据
B cM F6 cDNA2AFLP得到的差异片段的测序结果设计 1对 3′2RACE特异引物 ( S1: 5′2TTGACGGT2
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　1期 张 　强等 : 白菜多聚半乳糖醛酸酶基因 B cM F6的克隆、序列分析及其表达 　
GAAGGTAACGCTGC23′, S2: 5′2CGTGACTGACGCTAAGATAAGAGGC23′) 和 1对 5′2RACE特异引物
(A1: 5′2GACTCCAACACTCCTTCCCAC23′, A2: 5′2CGTCAAAGATACCACCTCC23′) , 引物序列由上海
生工生物工程技术服务有限公司合成。利用巢氏 PCR扩增拼接 B cM F6全长 , PCR反应体系 : cDNA
模板 015μL, 10 ×PCR缓冲溶液 5μL, 25 mmol·L - 1的 Mg2 + 4μL, 特异引物 (20μmol·L - 1 ) 1μL,
锚定引物 (20μmol·L - 1 ) 1μL, 10 mmol·L - 1 dNTPs 1μL, Taq酶 (5 U·μL - 1 ) 015μL, 加水到总
体积 50μL。PCR程序 : 94℃预变性 2 m in; 94℃变性 30 s, 50℃退火 30 s, 72℃延伸 2 m in, 30个循
环 ; 72℃延伸 7 m in, 4℃保存。PCR产物用 V ITAGENE公司的 DNA凝胶回收试剂盒回收 , 回收的产
物插入 pGEM 2T easy载体 , 转化大肠杆菌 , 蓝白斑筛选阳性克隆。碱裂解法抽提质粒 , 用 EcoRⅠ进
行单酶切鉴定和 PCR鉴定后 , 重组质粒送上海博亚生物公司测序。
根据 RACE获得的 B cM F6的 cDNA拼接全长序列设计引物扩增其 cDNA和 DNA全长序列 , PCR
体系同前。其引物序列为 : P1: 5′2GTA GGA TCC ATT GTA ATC CCC AGT AAC23′和 P2: 5′2 GCA
TCT AGA GTG TAT TGG TTA TCG CA 23′, 引物序列在 5′端引入 B am H Ⅰ酶切位点 , 3′端引入 X ba l Ⅰ
酶切位点 , 下划线部分为酶切位点 , 外加 3个保护性碱基。
113　B cM F 6核苷酸序列分析、同源比对和系统树构建
DNAStar软件分析 B cM F6基因最大开放阅读框 , 推导氨基酸序列 ; 并对其编码蛋白序列进行结
构特征分析 ; 对推导的蛋白质氨基酸序列进行生物学意义的位点分析 ; 利用 ClustalX软件将 B cM F6
与数据库中的其他 PG序列进行同源序列比对 , NJ法构建系统树。
114　B cM F 6基因的时空表达分析
用 ‘Bajh97201A /B’不育株和可育株花蕾、开放花、嫩角果、茎和叶片的 RNA反转录得到的
cDNA为模板 , 用 B cM F6的 cDNA的全长引物 P1、 P2进行 RT2PCR。反应体系如下 : cDNA模板 013
μL、10 ×PCR缓冲溶液 2μL、25 mmol · L - 1的 Mg2 + 116μL、特异引物 ( 20μmol·L - 1 ) 015μL、
锚定引物 (20μmol·L - 1 ) 015μL、10 mmol·L - 1 dNTPs 014μL、Taq酶 (5 U·μL - 1 ) 012μL, 加
水到总体积 20μL。PCR程序 : 94℃预变性 3 m in; 94℃变性 30 s, 50℃退火 30 s, 72℃延伸 2 m in,
25个循环 ; 72℃延伸 7 m in, 4℃保存。
2　结果与分析
211　RACE获得 B cM F 6的 3′2UTR和 5′2UTR序
列
首先 , 分别利用 3′RACE、5′RACE锚定引物
分别和 B cM F6的特异引物 S1、A1进行巢式 PCR
的首轮扩增 , 扩增的 PCR结果稀释 50倍后作为
第 2轮 PCR扩增的模板 , 再用 B cM F6的特异引物
S2、A2分别和 3′RACE、5′RACE锚定引物配对
结合进行巢式 PCR 的第 2轮扩增。如图 1所示
(箭头所指 ) , B cM F6的 3′2UTR序列和 5′2UTR序
列巢式 PCR扩增的第 2轮均获得了特异的条带 ,
把特异条带回收、连接到 T2easy载体 , 然后转化
大肠杆菌 , 经质粒酶切和 PCR验证正确后 , 送上
海博亚公司测序。
图 1　B cM F6的 3′2UTR序列和 5′2UTR序列巢式 PCR扩增
1. 100 bp ladder的 DNA marker; 2. 3′2UTR第 1轮 ;
3. 3′2UTR第 2轮 ; 4. 5′2UTR第 1轮 ; 5. 5′2UTR第 2轮。
F ig. 1　Nested PCR results of the 3′2UTR and 5′2UTR of B cM F6
1. 100 bp ladder DNA marker; 2. The first round of nested PCR of
3′2UTR; 3. The second round of nested PCR of 3′2UTR;
4. The first round of nested PCR of 5′2UTR; 5. The second
round of nested PCR of 5′2UTR.
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212　B cM F 6基因 D NA全长和 cD NA全长的获得
分别以可育株系的 DNA以及花蕾双链 cDNA为模板 , 用根据 RACE获得的 cDNA拼接全长设计
的引物 P1、P2为引物 , 扩增获得 B cM F6基因全长和 cDNA全长。PCR扩增结果表明 (图 2、图 3) ,
B cM F6的 cDNA全长在 1 200 bp左右 , 与预期的相符 ; DNA扩增全长在 1 600 bp左右 (图 3) , 表明
B cM F6的 DNA序列中含有内含子。
对所获 cDNA和 DNA扩增序列进行回收、连接、转化以及测序。测序结果表明 : B cM F6基因
DNA的扩增长度为 1 576个碱基 , 减去两端酶切位点碱基 6个和保护碱基 3个 , 实际长度为 1 558 bp。
cDNA扩增全长 1 255 bp, ORF为 1 194 bp。
图 2　B cM F6的 cD NA全长扩增
1. 100 bp ladder的 DNA marker;
2. B cM F6的 cDNA全长扩增。
F ig. 2　Am plif ica tion results of the cD NA full length of B cM F6
1. 100 bp ladder DNA marker; 2. Amp lified
p roduct of genom ic DNA in fertile line.
图 3　B cM F6的 D NA全长扩增
1. 100 bp ladder的 DNA marker;
2, 3. B cM F6的 DNA全长扩增。
F ig. 3　Am plif ica tion results of the D NA full length of B cM F6
1. 100 bp ladder DNA marker; 2, 3. Amp lified
p roduct of genom ic DNA in fertile line.
213　B cM F 6基因核苷酸序列和氨基酸序列的分析
B cM F6基因的 DNA和 cDNA全长序列比较分析表明 , 该基因序列包含 3个内含子和 4个外显子。
内含子的长度依次为 81 bp、95 bp和 127 bp。其外显子 - 内含子交接点处序列都遵守 GT2AG规律 ,
是典型的剪接体识别序列。
利用 DNAStar软件对 cDNA序列进行分析 , 发现该基因最大开放阅读框为 1 194 bp, 编码 397个
氨基酸序列 (图 4) , 起始密码子 ATG后第 1个碱基为 G, 与 Kozak共有序列最保守的碱基一致。对
其编码蛋白质的特征分析表明 , 编码的蛋白质的分子量为 4218 kD, 等电点为 81619, pH 710时的电
荷为 101492, 碱性氨基酸 ( K, R) 44个 , 酸性氨基酸 (D , E) 34个 , 疏水氨基酸 (A , I, L , F, W ,
V) 137个 , 极性氨基酸 (N , C, Q, S, T, Y) 112个。
对推导的蛋白质氨基酸序列进行结构功能域分析 , 发现从 1到 22个氨基酸 MGVHFGISVLFV2
VCLLGLSANA是 1信号肽序列 , 蛋白质序列中含有信号肽序列将有助于它们向细胞内特定区域的移
动 , 这表明与蛋白质的定位有关 ; 还发现从 170到 196氨基酸、197到 218氨基酸、250到 271氨基
酸、281到 302氨基酸是 4个平行β螺旋重复 ( Parallel beta2helix repeats, PbH1) 的结构 , 该结构与
细胞内多聚糖的水解有关。对推导的蛋白质氨基酸序列进行生物学意义的位点分析 , 发现该序列包含
3个 N -糖基化位点 , 4个蛋白激酶 c磷酸化位点 , 5个酪蛋白激酶 II磷酸化位点 , 10个 N - 豆蔻酰
化位点 , 1个 PG活性位点 (227 RVTCGPGHGIS1 IGS240 ) 等。
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　1期 张 　强等 : 白菜多聚半乳糖醛酸酶基因 B cM F6的克隆、序列分析及其表达 　
图 4　B cM F6基因核苷酸序列及推测氨基酸序列
黑体 ATG为起始密码子 , TAA为终止密码子 , 阴影部分表示 3个内含子序列 , 加框部分为信号肽序列 , 双下划线部分为
N - 糖基化位点 , 单下划线为多聚半乳糖醛酸酶活性位点 , 单下划线加倾斜部分为染色体浓缩信号的调节体。
F ig. 4　Nucleotide and deduced am ino ac id sequences of B cM F6 gene
ATG ( initiation codon) and TAA ( stop codon) are showed in bold. Shaded regions indicate three introns regions. Boxed region indicates
the signal pep tide. Double underlined sequences indicate three possible sites of glycosylation. Underlined sequences indicate the polyga2
lacturonase active site. Italic sequences with underlined sequences indicate the regulator of chromosome condensation (RCC1) signature.
214　B cM F 6基因的同源比对与系统树构建
图 6表明 B cM F6基因具有所用 PG基因所特
有的 4个结构域 , 其中结构域 Ⅰ、Ⅱ中的 3个天
冬酰氨残基和结构域 Ⅲ中的 H残基被认为与催化
反应有关 , 并且所有半胱氨酸残基的位置均有较
好的保守性 , 半胱氨酸可能在维持胞外蛋白的三
维结构中发挥重要作用 ( Robert et al. , 1993 )。
构建系统树 (图 5) 表明 , 明显可以看出 , 其分
子进化树分为 3个分支。B cM F6基因和拟南芥的
A t5g48140、PGA3、 PGA5 基因 , 油菜的 S ta4424
基因 , 甘蓝的 PG1基因聚为一类。其中与拟南芥
A15g48140基因的亲缘关系最近 , 同源性达到
77% , 与其它几个基因的蛋白同源性大小依次是
71%、71%、67%和 68%。
图 5　根据 B cM F6基因的推断氨基酸序列与数据库中植物 PG基因
编码氨基酸序列同源性比对构建的分子进化树
Fig. 5　M olecular phylogenetic trees based on the deduced
am ino acid sequences of plant PGs
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　1期 张 　强等 : 白菜多聚半乳糖醛酸酶基因 B cM F6的克隆、序列分析及其表达 　
215　B cM F 6基因的时空表达分析
分别用核隐性雄性不育两用系 ‘Bajh97201A /B’不育株和可育株的 1～5级花蕾、开放花、嫩角果、
茎和叶片的 cDNA为模板 , 用 B cM F6基因的全长引物 P1、P2进行 RT2PCR分析 (图 7) 表明 , B cM F6
基因在可育株 (野生型 ) 的Ⅲ级、Ⅳ级、Ⅴ级的花蕾和开放花、嫩角果中特异表达 , 在不育株都不表达 ,
因此该基因是可育株花粉发育后期特有表达的基因 , 可能与花粉的育性和花粉管的伸长有关。
图 7　B cM F6基因在核隐性雄性不育两用系 ‘Ba jh97201A /B’不育株和可育株中的表达
1、2、3、4、5分别代表Ⅰ级 ( < 110 mm)、Ⅱ级 (1～116 mm)、Ⅲ级 (116～212 mm)、Ⅳ级 (212～218 mm)、
Ⅴ级 ( > 218mm) 花蕾 ; m: 不育株 ; w: 可育株 ; F: 开放花 ; Si: 嫩角果 ; S: 茎 ; L: 叶。
F ig. 7　The RT2PCR expression results of BCM F6 in nuclear recessive ster ile A /B line‘Ba jh97201A /B’
1, 2, 3, 4, 5 indicate stageⅠ ( < 110 mm) , stageⅡ (1 - 116 mm) , stageⅢ (116 - 212 mm) , stageⅣ ( < 218 mm) ,
stageⅤ ( > 218 mm) flower bud; m: Sterile line; w: Fertile line respectively;
F: Open flowers; Si: Germ inal siliques; S: Stem s; L: Leaves.
3　讨论
现在已经清楚 PG基因由一个相当大的基因家族编码 , 它们在发育许多方面表达 , 例如 PG活性
与器官脱落 ( Taylor et al. , 1990; Bonghi et al. , 1992)、侧根生长 ( Peretto et al. , 1992)、豆荚和花
药裂开 (Meakin et al. , 1991)、花粉粒成熟、萌发和花粉管生长 ( Pressey & Reger, 1989; Pressey,
1991) 有关。在快速生长组织中已检出 PG活性 , 表明它可能与细胞伸长有关 ( Pressey & Avants,
1977; Sitrit et al. , 1996)。Hadfield和 Bennet (1998) 对众多的已克隆植物 PG的氨基酸序列进行分
析 , 将 PG分成 3大分化单位 , 即分化单位 A (果实和脱落区 , 无预期的前序列 )、分化单位 B (果
实和脱落区 , 具预期的前序列 )、分化单位 C (花粉区 , 无前序列的外切 PG) , 编码外切 PG。本研究
从白菜核隐性不育两用系 ‘Bajh97201A /B’可育株 (野生型 ) 中成功克隆的 B cM F6含 4个外显子和
3个内含子 , 与 Tebbutt和 Rogers (1994) 提出的花粉专一的 PG基因只有 3～4个内含子数的说法一
致。根据 Hadfeild和 Bennet (1998) 的分类结果 , B cM F6基因明显属于与花粉发育相关的多聚半乳
糖醛酸酶基因 , 推测该基因可能在花粉萌发和花粉管伸长中发挥作用 , 对其核苷酸序列的同源基因聚
类分析也证明了这一点。
不同 PG基因家族成员编码的氨基酸序列差异较大 , 但仍有一些高度保守的区域存在 , 这些高度
保守的残基与催化功能有关。本试验克隆的多聚半乳糖醛酸酶同源基因 B cM F6具有 PG基因所特有的
4个保守的结构域 , 并且与花粉中特异表达的基因聚为一类 , 这些结果表明 B cM F6基因可能作为外
切多聚半乳糖醛酸酶在花粉发育中和花粉管萌发中发挥作用。前导肽后面 4个与细胞内多聚糖水解有
关的平行β螺旋重复 ( Parallel beta2helix repeats, PbH1) 的结构也说明了这一点。
花粉授精和花粉管进入雌蕊生长 , 然后进行一系列的生化反应 , 这是发育的最初阶段。花粉中表
达的基因根据第 1次有丝分裂的时间先后可被分为早期基因和晚期基因 , 花粉中表达的 PG属于晚期
基因 , 主要编码花粉成熟和花粉管生长的蛋白 (Mascarenhas, 1990)。PG基因在花粉管中的作用可
能是降解柱头的细胞壁而使花粉管穿透生长或供给花粉管生长的前体物质 ( Hadfield & Bennet,
1998) , 另一方面花粉管 PG可能作用于自身的细胞壁而加速生长 (B rown & Crowch, 1990)。可能
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exo2PG通过修饰具活性的低聚半乳糖苷信号分子成为不具活性的低聚体促使低聚半乳糖苷信号分子
的快速转换而引导花粉管通向子房 ( Garcia2Romera & Fry, 1995)。
RT2PCR分析结果证明了 B cM F6基因是可育株花粉发育的后期特有表达的基因 , 可能与花粉的育
性和花粉管的伸长有密切的关系。由于 PG基因在发育的许多方面表达 , 其具体的功能应通过转正义
表达基因和通过 RNA干涉或反义 RNA抑制 PG基因表达的方法来确认 , 进一步加深我们对花粉发育
的认识和了解。
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