全 文 ：园 　艺 　学 　报 　2007, 34 (2) : 349 - 354
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2006 - 10 - 20; 修回日期 : 2007 - 01 - 31
基金项目 : 辽宁省博士启动基金资助项目 (1040179) ; 沈阳农业大学博士后基金资助项目3 通讯作者 Author for correspondence ( E2mail: jiechen59@ sjtu1edu1cn)
致谢 : 感谢上海交通大学农业与生物技术学院蔡润教授和潘俊松副教授惠赠黄瓜品种。
黄瓜杂交二代抗黄瓜白粉病的蛋白质组学初步分析
范海延 1 , 陈　捷 23 , 吕春茂 3 , 张春宇 1 , 孙　权 1
(1 沈阳农业大学生物科学技术学院 , 沈阳 110161; 2 上海交通大学农业与生物学院 , 上海 201101; 3 沈阳农业科技开
发院 , 沈阳 110161)
摘 　要 : 通过分组分离法建立 F2代抗感池 , 利用 22DE差异显示和质谱分析研究了抗病池和感病池的
差异蛋白质组。抗感池经双向电泳检测到近 500个蛋白点 , 质谱分析鉴定出 9种抗感池表达差异蛋白点 ,
分别为抗病基因蛋白 ( SSP3110) , 142323脑蛋白家族蛋白 ( SSP1411) , 粪卟啉原氧化酶 Ⅲ ( SSP5513) , 碳
酸酐酶 ( SSP5412 ) , α - 半乳糖苷酶 ( SSP5710 ) , 推定的蛋白 ( SSP6002 ) , 1718 kDa 的热激蛋白
( SSP0710) , 假想蛋白 ( SSP3111) , ( S) - 2 - 羟酸氧化酶 ( SSP4610)。其中有 3种蛋白的性质及生物学功
能未知 , 其余 6种蛋白分别与光合作用、呼吸作用、抗病反应及信号转导等有密切关系。这些蛋白都可能
是与抗性有关或与发育相关的蛋白网络中的一部分 , 它们在黄瓜抗病反应中起着不同的作用。
关键词 : 黄瓜 ; 白粉病 ; 蛋白质 ; 双向电泳 ; 质谱
中图分类号 : S 64212　　文献标识码 : A　　文章编号 : 05132353X (2007) 0220349206
Proteom ic Ana lysis of F2 Genera tion of Cucum ber Aga in st the Cucum ber
Powdery M ildew D isea se
FAN Hai2yan1 , CHEN J ie23 , LüChun2mao3 , ZHANG Chun2yu1 , and SUN Quan1
(1B iolog ical Science & Technology, Shenyang A gricu ltural U niversity, Shenyang 110161, China; 2 School of A griculture and B iol2
ogy, Shangha i J iaotong U niversity, Shangha i 201101, Ch ina; 3A cadem y of Shenyang A griculture Science and Technology, Sheny2
ang 110161, Ch ina)
Abstract: Proteom ic app roaches using two2dimensional gel electrohoresis (22DE) were adop ted to iden2
tify p roteins from cucumber leaves differentially exp ressed in F2 generation of cucumber. Nearly 500 p roteins
were rep roducibly detected, including 39 specific p roteins exp ressed in F2 sensitive pool samp les and 22 spe2
cific p roteins exp ressed in resistance pool samp les, 35 p roteins were two2fold upper lim it and 46 p roteins were
two2fold lower lim it. Analysis with MALD I2TOF2MASS showed that nine important p roteins associated with de2
fensive reaction were identified in F2 cucumber, a p rotein of disease resistance gene ( SSP3110) , 142323 brain
p rotein homolog ( SSP1411) , cop roporphyrinogen Ⅲ oxidase ( SSP5513) , carbonic anhydrase ( SSP5412) ,
alpha2galactosid2ase2like p rotein ( SSP5710) , putative p rotein ( SSP6002) , 1718 kDa class small heat shock
p rotein ( SSP0710) , hypothetical p rotein ( SSP3111) , ( S) 222hydroxy2acid oxidase ( EC11113115) 2cucur2
bit ( SSP4610). A ll of those p roteins were p robably parts of network of resistance or development2related p ro2
teins. This study gives new insights into cucumber powdery m ildew resistant response in cucumber leaves and
demonstrates the power of the p roteom ic app roach in p lant biology studies.
Key words: Cucumber; Powdery m ildew; Protein; Two2dimensional gel electrophoresis; Mass spec2
trometry
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有关黄瓜白粉病 (Sphaerotheca fu lig inea) 抗性遗传规律的研究较多 , 但看法并不一致 , 关于黄瓜
抗病机制也不完全清楚。生命现象的发生往往是多因素影响的 , 必然涉及到多个蛋白质 ; 多个蛋白质
的参与是交织成网络的 , 或平行发生 , 或呈级联因果 ; 同时在执行生理功能时蛋白质的表现是多样
的、动态的。
因此 , 要对生命的复杂活动有全面和深入的认识 , 必然要在整体、动态、网络的水平上对蛋白质
进行研究。本试验通过 22DE差异显示和质谱分析 , 研究了黄瓜杂交 F2代抗性相关蛋白质组的变化 ,
这对于从根本上揭示黄瓜抗白粉病的本质具有重要意义 , 并将为黄瓜抗病基因克隆和抗性育种提供重
要基因资源。
1　材料与方法
111　材料
供试黄瓜为抗黄瓜白粉病的品系 R17和感病品系 S17的 F2代 , 其中 R17和 S17均为 Nevada (荷
兰温室类型光皮品种 ) 与 Husen (以色列温室类型光皮品种 ) 杂交组合分离的后代材料 , R17和 S17
为自交 7代的品系。
将种子催芽后播在装有草炭土 ∶蛭石体积比为 1∶2的营养钵中 , 温室中培养。待长至两片真叶时
取第 1片真叶置于 - 80℃冰箱中备用。
对第 2片真叶进行挑战接种 , 发病后根据分离群体分组分析法 (BSA ) 把 F2群体分为抗病池和
感病池两组。
分别将抗病池和感病池植株的第 1片真叶混合在一起 , 进行蛋白质的提取和制备。
112　双向凝胶电泳
蛋白质提取采用三氯乙酸 /丙酮法 (钱小红和贺福初 , 2004)。
裂解缓冲液配方为 915 mol/L尿素 , 2 mol/L硫脲 , 4% 3 - [ 3 - (胆酰氨丙基 ) 二甲铵基 ] 丙磺酸
内盐 (CHAPS) , 1%二硫苏糖醇 , 0125%两性电解质 (pH 3～10) , 10 mmol/L苯甲基磺酰氟 (Ange2
lika et al. , 2004)。
等电聚焦蛋白样品的浓度检测采用美国伯乐公司蛋白质检测试剂盒 1, 蛋白样品终浓度为 3μg/
μL, 上样量为 350μL。 IPG胶条长度为 17 cm, IEF条件为 20℃, 250 V 2 h, 300 V 2 h, 600 V 2 h,
1 500 V 3 h, 8 000 V 5 h, 和 8 000 V 94 000 Vh。
等电聚焦完成后 , 将 IPG胶条分别在平衡液 Ⅰ (6 mol/L尿素 , 2%十二烷基磺酸钠 , 50 mmol/L
Tris2HCl pH 818, 20%甘油 , 2%二硫苏糖醇 ) 和平衡液 Ⅱ (6 mol/L尿素 , 2% 十二烷基磺酸钠 , 50
mmol /L Tris2HCl, pH 818, 20% 甘油 , 215% 碘乙酰胺 ) 中各平衡 15 m in。将胶条置于凝胶上 , 用低
熔点琼脂糖封胶液封注顶部 (胶条与凝胶之间不能有气泡 )。
SDS凝胶配制参照郭尧君 (1999) 的方法 , 第 2向 SDS - 聚丙烯酰胺凝胶电泳的分离胶浓度为
1215% , 电泳参数为 15 mA /凝胶 1 h, 50 mA /凝胶 6 h。G2250胶体考染法染色。上述试验所用的等
电聚焦仪、电泳槽和电泳仪均为美国伯乐公司产品。图像采集和图像分析采用 VersaDocTM Imaging Sys2
tem s与 PDQuest 712。
113　质谱分析与数据库检索
样品用 4700串联飞行时间质谱仪 [ 4700 Proteom ics Analyzer ( TOF /TOFTM ) ] 进行质谱分析 , 激
光源为 355 nm波长的 Nd: YAG激光器 , 加速电压为 20 kV, 采用正离子模式和自动获取数据的模式
采集数据。
肽质量指纹图谱 ( PMF) 质量扫描范围为 700～3 500 Da, 且强度最大的 5个峰进行串级质谱分
析 ; 图谱用肌红蛋白 (myoglobin) 酶解肽段进行外标校正。
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　2期 范海延等 : 黄瓜杂交二代抗黄瓜白粉病的蛋白质组学初步分析 　
所得结果用 GPS2MASCOT进行数据库检索。搜索参数设置 : 数据库为 NCB Inr; 检索种属为绿
色植物 , 数据检索的方式为结合式 ( combined) ; 最大允许漏切位点为 1; 酶为胰蛋白酶。质量误
差范围设置 : PM F 013 Da, M S/M S 014 Da; 在数据库检索时胰酶自降解峰和污染物质的峰都手工
剔除。
2　结果与分析
211　F2抗感池的双向电泳图谱比较
经双向电泳 , 共有近 500个蛋白点在考马斯亮蓝染色的 22D胶上分离。其中 , 感病池在 22D胶上
分离得到约有 490个蛋白点 , 有 39种蛋白质在感病池中特异表达 ; 抗病池在 22D胶上分离得到约有
480个蛋白点 , 其中 22种蛋白在抗病池中特异表达 , 抗病池相对于感病池有 35种蛋白上调 210倍以
上和 46种蛋白下调 210倍以上。
感病池和抗病池的蛋白质组图谱相似系数为 01881 (表 1, 图 1)。
表 1　F2 抗感池蛋白质组的基本信息
Table 1　Genera l informa tion of proteom e of F2 resistan t pools and sen sitive pools
材料
Samp les
总蛋白点数
Total spots
未匹配蛋白点数
Number of spots unmatched
上调 2倍以上的蛋白
Two2fold upper p roteins 下调 2倍以上的蛋白Two2fold lower p roteins
抗病 Resistant 480 22 46 35
感病 Sensitive 490 39 - -
图 1　F2 抗感池的双向电泳图谱
箭头所示为差异蛋白点。
F ig. 1　22D E map of sen sitive and resistance sam ple of F2
A rrows show different p roteins.
212　F2抗、感池差异蛋白的质谱鉴定
我们认为 , 在不同重复胶的同一位置都出现的蛋白点是同一个蛋白 , 选取其中 14个差异蛋白点
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进行了分析鉴定。
通过串联飞行时间质谱仪质谱分析 , Swiss2Prot和 NCB I数据库查询 , 鉴定出 9个蛋白点 (表 2) ,
另 5个蛋白点因匹配率太低而未得到鉴定。
表 2　F2 抗、感池差异蛋白质谱鉴定结果
Table 2　F2 d ifferen tia lly accum ula ted prote in s iden tif ied by M S
序号
Spot No.
蛋白名称
Protein name
得分
Score
等电点
P I
分子量
MW (Da)
匹配度
Intensity matched
编号
No.
SSP3110 抗病基因蛋白 65 5131 138 90512 401021 gi | 12322541
D isease resistance gene, putative
SSP1411 142323脑蛋白家族 61 4182 29 61916 91999 gi | 695767
142323 brain p rotein homolog
SSP5513 粪卟啉原氧化酶Ⅲ 334 5197 36 73512 311599 gi | 29367603
Cop roporphyrinogen Ⅲ oxidase
SSP5412 碳酸酐酶 121 6166 28 73616 201310 gi | 21593413
Carbonic anhydrase, putative
SSP5710 α -半乳糖苷酶 97 6132 46 07719 101582 gi | 30725668
A t5g08380
SSP6002 推定的蛋白 60 6101 80 82612 271194 gi | 6850848
Putative p rotein
SSP0710 1718 kDa热激蛋白 73 5160 177 64010 91469 gi | 4836471
1718 kDa class small heat shock p rotein
SSP3111 假想蛋白 63 9139 23 85711 191415 gi | 24817258
Hypothetical p rotein
SSP4610 ( S) - 2 - 羟酸氧化酶 150 8179 40 28812 141258 gi | 7431428
( S) 222hydroxy2acid oxidase ( EC11113115) 2cucurbit
鉴定出的 9个蛋白点代表 9种不同的蛋白质 , 其中仅 F2抗病池表达的蛋白点 (QUAL ITY) 有
SSP4511, SSP5513, SSP5412, SSP3110, SSP0710, SSP3111, SSP4610; 仅 F2感病池表达的蛋白点
(QUAL ITY) 有 SSP1411, SSP6002; 抗病池比感病池蛋白含量高 210 倍以上 , 表达的蛋白点为
SSP5710 (图 2)。
F2抗病池鉴定出的蛋白点 SSP3110为一种抗病基因蛋白 , 该蛋白与一种抗病基因表达的蛋白匹配
率高 , 而且已在拟南芥中得到纯化 , 它可能与植物的防御反应相关。
SSP5513为粪卟啉原氧化酶 Ⅲ, 是植物中四吡咯生物合成中的第 8种酶 , 催化粪卟啉原 Ⅲ氧化脱
羧生成原卟啉原 IX。在植物中这个反应和卟啉生物合成较早的步骤均在质体中进行 , 原卟啉原 IX可
转变为叶绿素生物合成中第一个中间产物。
SSP5412为碳酸酐酶 , 参与催化 CO2和水与碳酸、质子和碳酸氢盐离子之间的快速转换。绿色植
物光合作用所需的 CO2来自于大气 , 在植物体内 CO2以碳酸氢盐离子的形式贮存 , 光合作用中碳酸酐
酶在碳酸氢盐离子转化成 CO2过程中起重要作用。
蛋白点 SSP5710是α -半乳糖苷酶 , 在 F2抗感池中均明显可见 , 但抗病池中的含量明显比感病池
提高 , 它在黄瓜中的作用尚未知。
SSP1411为 142323脑蛋白家族 , 是感病池中的上调蛋白。对于复杂的生活环境和生长发育的变
化 , 植物需要一系列调节因子和相应的反应 , 这些变化似乎与庞大多样的 142323家族密切相关。142
323二聚体同工型通过蛋白质间相互作用和磷酸化作用参与细胞内和细胞间信号转导。在拟南芥、玉
米、大麦、水稻、烟草、燕麦、大豆、蚕豆、马铃薯、豌豆和番茄中均已发现 142323 蛋白。这些蛋
白的功能也已被发现。拟南芥和玉米中的 142323家族在转录调节过程中与 G2box DNA /蛋白质复合体
有关。当植物处于低温、低氧、盐胁迫和病原菌侵染等逆境时 , 142323蛋白可能调节磷酸化事件 , 并
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　2期 范海延等 : 黄瓜杂交二代抗黄瓜白粉病的蛋白质组学初步分析 　
在黄瓜受霜霉病菌侵染时可作为植物毒植物素壳梭孢素的受体分子 (A itken, 1995; Ferl, 1996;
W u et al. , 1997)。
蛋白点 SSP0710为 1718 kDa的热激蛋白。通常热激蛋白家族 HSPs是细胞质蛋白 , 在不同胁迫条
件下生物可合成 HSPs。HSPs在蛋白质互作中起重要作用 , 包括蛋白质折叠、蛋白质构象建立 , 并能
阻止蛋白质聚集 ( Pearl, 2001)。因此该热激蛋白可能与植物抗病防御反应有关。
SSP6002、SSP3111和 SSP4610分别为一种推定的蛋白、假想蛋白和 ( S) - 2 - 羟酸氧化酶 , 这 3
种蛋白的性质及其在黄瓜抗白粉病中的作用尚不清楚。
图 2　F2 代抗感池的差异蛋白比较
箭头所示为差异蛋白点。
F ig. 2　The d ifferen tia l prote in spots from F2 resistan t sam ples and sen sitive sam ples
A rrows show different p roteins.
3　讨论
蛋白质是生理功能的执行者 , 是生命现象的直接体现者 , 对蛋白质结构和功能的研究将直接阐明
生命在生理和病理条件下的变化机制。
蛋白质生理功能的实现离不开蛋白质与蛋白质或蛋白质与其他生物大分子之间的相互作用
(Auerbach et al. , 2002)。细胞内的许多活动 , 如信号转导等都是通过一个复杂而广泛的蛋白质相互
作用网络来实现。
以往人们对单一防御反应相关酶蛋白和信号做了大量研究 , 所得出的结论多数是依据少数生理因
子与抗性关系得出的。通过蛋白质组学研究表明 : 植物对病害的抗性本质需要从蛋白质群角度进行探
索 , 才能最终为人们提供自然条件下黄瓜抗白粉病全息机制。
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本研究双向电泳中检测到近 500个蛋白点 , F2代抗病池与感病池蛋白质点总数相差不明显。我们
发现抗性后代与能量代谢、信号转导和抗性基因表达有一定的相关性。在抗病池中发现了抗病基因蛋
白和热激蛋白 , 两者可能与黄瓜抗病或抗逆密切相关。
由于已发现 142323蛋白参与磷酸化过程 , 并可与病菌毒素结合 , 因此在感病池发现的 142323蛋
白可能与易感病性信号分子调控有关。F2抗病池或感病池中均有一些不匹配的蛋白 , 可能与特异非亲
和性互作有关。植物抵御病害的一系列防御反应是许多蛋白质相互作用共同完成的 ( Sun et al. ,
2004)。
本研究中所有的上调或下调蛋白都可能是与抗性有关或是与发育相关的蛋白网络中的一部分 , 它
们在黄瓜抗病反应中可能起着不同的作用。
虽然我们在黄瓜叶片蛋白质的双向电泳图谱上可以观察到 500个左右的蛋白质点 , 但这并不能代
表整个黄瓜叶片的蛋白质组。
本研究仅分析了黄瓜蛋白质组的很小一部分 , 仍有许多抗性相关蛋白需要进一步鉴别。比如 , 随
着病原菌侵入的时间进程 , 寄主防御反应会涉及哪些蛋白和蛋白互作网络 , 在抗性反应中起关键作用
的膜蛋白和核蛋白 , 离子运输及信号转导过程是哪些 , 为了更好的了解黄瓜抗病反应我们尚需更深入
的研究。
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