全 文 ：© 1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net
园 　艺 　学 　报 　2007, 34 (2) : 403 - 406
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2006 - 07 - 20; 修回日期 : 2007 - 01 - 29
基金项目 : 农业部蔬菜遗传育种和生理重点开放实验室项目 ; 中—荷联合园艺作物基因组技术实验室资助项目3 通讯作者 Author for correspondence ( E2mail: dyqu@mail1caas1net1cn)
马铃薯 kun itz型蛋白酶抑制子基因片段的分离及
表达分析
李广存 1, 2 , 金黎平 1 , 谢开云 1 , 卞春松 1 , 段绍光 1 , 屈冬玉 13
(1 中国农业科学院蔬菜花卉研究所 , 北京 100081; 2 山东省农业科学院高新技术研究中心 , 济南 250100)
摘 　要 : 以马铃薯高抗青枯病基因型 ED13为材料 , 利用 cDNA2RGA方法获得了青枯病菌处理和水对
照处理之间的差异表达片段 ( KTI2like EST)。该 EST与 kunitz2type抑制子基因高度同源 , 属于 kunitz2type
抑制子基因家族 , 是马铃薯半胱氨酸蛋白酶抑制子基因家族的重要成员。半定量 RT2PCR分析表明该基因
受青枯病菌的诱导 , 12 h内启动表达 , 48 h内表达量达最高。马铃薯半胱氨酸蛋白酶抑制子基因参与马铃
薯对病原的抗病防御 , 推测所获得的 KTI2like EST也可能参与了马铃薯的抗病防御。
关键词 : 马铃薯 ; 马铃薯青枯病 ; cDNA2RGA; KTI2like EST; RT2PCR
中图分类号 : S 532　　文献标识码 : A　　文章编号 : 05132353X (2007) 0220403204
Isola tion and Expression Ana lysis of Kun itz2type Enzym e Inh ib itor Gene
Fragm en t in Pota to ( Solanum tuberosum L. )
L I Guang2cun1, 2 , J IN L i2p ing1 , X IE Kai2yun1 , B IAN Chun2song1 , DUAN Shao2guang1 , and QU Dong2yu13
(1 Institu te of V egetables and Flow ers, Chinese A cadem y of A gricu ltura l Sciences, B eijing 100081, Ch ina; 2 H igh2Tech Research
Center, Shandong A cadem y of A gricu ltura l Sciences, J ipinan 250100, China)
Abstract: The differentially exp ressed fragment, designated as kunitz2type enzyme inhibitor like ( KTI2
like) EST, was isolated from ED13 with high resistance to Ra lston ia solanacearum (R s) using cDNA2RGA
( resistance gene analogs, RGA ). Results of BLAST against NCB I database showed that the KTI2like EST
shared a high sim ilarity with kunitz2type inhibitor genes, and m ight be one of the important members of potato
cysteine p roteinase inhibitor ( PCP I) gene fam ily. Analysis of sem i2quantity RT2PCR indicated that the KTI2
like gene was induced by R s and itwas trigged to exp ress before 12 h and reached the highest level at about 48
h post2inoculation, then leveled off. Results of this study combined with the fact that PCP I is involved in p lant
defence against insects and pathogens indicated that the KTI2like gene m ight p lay an important role in p lant re2
sistance against R s.
Key words: Potato; Potato bacterial wilt; cDNA2RGA; KTI2like EST; RT2PCR
马铃薯青枯病是由青枯病菌 (R alston ia solanacearum ) 引起的一种世界性细菌性病害 , 该病菌可
侵害马铃薯等 50多个科的数百种植物 , 且传播快 , 寄主广 , 防治困难 , 目前尚没有行之有效的化学
药剂防治办法。自上个世纪中期至今 , 人们已经从不同植物种中分离和鉴定了许多抗青枯病相关基因
和数量性状位点 (Quantity Trait Locus, QTL ) , 但只有很少几个基因 (如具有广谱抗性的 A P1基因 )
来自马铃薯 (李广存 等 , 2004)。
植物与病原的互作是一个复杂的系统的反应 , 当受到病原侵袭时 , 植物本身将启动一大批防卫基
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园 　　艺 　　学 　　报 34卷
因和通过多重防卫反应来干扰和阻止病原的入侵。马铃薯作为一种重要的茄科作物 , 病菌的侵染同样
会促使其体内发生大量基因的表达量变化。
蛋白酶抑制子是植物体内自然存在的病程相关蛋白 , 当植物受到病原侵袭时所发生的最为普遍的
抗病防御反应就是激活这些基因来赋予植物自然抵抗能力 ( Fan & W u, 2005) , 同时这些基因的表达
量也将随之而变化。
在以往的研究中 , 抗病基因类似序列法 (RGA ) 主要用于对基因组 DNA的分析 , 由于植物在病
原胁迫下只有部分基因得到表达或表达量发生变化 , 因此本研究主要是基于转录水平 , 利用 cDNA2
RGA法进行青枯病菌胁迫下相关基因的寻找和分离 , 以便简化分析背景 , 使目标序列相对富集 , 便
于克隆。
1　材料与方法
111　材料
采用茎枝菌液共培养法接种处理二倍体马铃薯高抗青枯病基因型 ED13 (由中国农业科学院蔬菜
花卉研究所马铃薯组保存 ) , 所用病原菌为青枯病菌小种 3号 (B iovar 2) PO41 (由中国农业科学院
蔬菜花卉研究所植保室提供 )。分别于病原菌处理和水处理 0、6、12、24、48、72和 96 h时取样 ,
液氮冷却后 , - 80℃保存。
Taq DNA聚合酶、DNA分子量标准、各种生化试剂及试剂盒等购自 Clontech公司、 Invitrogen公
司、Promega公司、TAKARA公司、上海生工生物工程技术服务有限公司及北京天为时代公司等。
112　总 RNA的提取及 cD NA的合成
采用 TR Izol Reagent ( Invitrogen公司 ) 法分别提取病菌处理和水处理 0、6、12、24、48、72和
96 h样品的总 RNA , 测定其 OD值 , 并电泳检测所提取总 RNA的质量。
参照 SMARTTM cDNA L ibrary Construction Kit (Clontech公司 ) 的操作说明书分别合成病菌处理和
水处理 48 h样品的双链 cDNA以用于 RGA的 PCR扩增。同时采用 Superscrip t Ⅱ ( Invitrogen) 逆转录
酶 , 以 oligo2dT (18 mer) 为引物分别逆转录合成病菌处理和水处理 0、6、12、24、48、72和 96 h样
品的 cDNA第一链 , 以用于差异表达片段的 RT2PCR验证。
113　RGA分析
根据拟南芥 R PS2基因和烟草 N 基因 ( Yu et al. , 1996) 的保守 P环 ( GGVGKTT) 和保守疏
水结构域 ( GLPLAL ) 设计简并引物 P5: 5′2ATG GGN GGN GTN GGN AAR AC23′和 P3: 5′2YCT
AGT TGT RAY DAT DAY YYT RC23′。N为 A /G /C /T, R为 A /G, Y为 C /T, D为 A /G /T。
cDNA 2RGA的 PCR反应条件为 : 94℃ 1 m in; 94℃ 45 s, 55℃ 1 m in, 72℃ 115 m in, 35个循
环 ; 最后 72℃延伸 5 m in。
将 PCR扩增产物进行 6%的 PAGE电泳 , 回收差异表达片段并克隆至 pMD 218T载体上 , 转化
大肠杆菌 TOP10感受态细胞 , 筛选阳性重组子测序 , 所得序列利用 BLAST软件与 GenBank进行比
对分析。
114　RT2PCR验证
根据 D rouin和 Dover (1990) 报道的 Actin基因第 3个外显子核苷酸序列和本试验所获得的 EST
序列及 BLAST比对结果 , 分别设计内参引物 (Actin2F: 5′2GATGGTGTCAGCCACAC23′; Actin2R: 5′2
ATTCCAGCAGCTTCCATTCC23′) 和基因特异引物 ( GSP2F: 5′2GGAGTCGGATTATGGTGATG23′; GSP2
R: 5′2ATTTGGAACCTTCTGGTGTC23′) 进行所获得 EST的 RT2PCR分析。
为使所分析基因在不同时间点的表达具有可比性 , 首先根据内参引物对所有不同时间点的 cDNA
第一链的 PCR扩增量来调整样品 cDNA第一链的起始浓度 , 使其趋于一致。其次 , PCR扩增为不饱和
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　2期 李广存等 : 马铃薯 kunitz型蛋白酶抑制子基因片段的分离及表达分析 　
扩增 , 以保持所分析基因的起始差异。 PCR扩增条件为 94℃ 1 m in; 94℃ 30 s, 56℃ 45 s, 72℃ 1
m in, 30个循环。
2　结果与分析
211　cD NA2RGA分析
分别提取青枯病菌处理和水处理 48 h样品的
总 RNA , 合成双链 cDNA, 并以此为模板进行
PCR扩增。图 1为 RGA2PCR扩增产物的 6%聚丙
烯酰胺凝胶电泳图谱 , 箭头所指即为差异表达片
段 , 大小约为 140 bp。回收该片段 , 并进行克隆
测序。
212　序列分析
BLAST分析表明所获得的 EST 与马铃薯
kunitz2type胰蛋白酶抑制子基因 ( Kunitz2type tryp2
sin inhibitor, GenBank注册序列号为 BAC2303311)、
马铃薯半胱氨酸蛋白酶抑制子 9前体 (Solanum
图 1　PCR扩增结果
1. 病菌处理 ; 2. 水处理。
F ig. 1　PCR results on PAGE
1. R s2treated; 2. W ater2treated.
tuberosum cysteine p roteinase inhibitor 9 p recursor, GenBank注册序列号为 CAA4019711)、马铃薯半胱氨
酸蛋白酶抑制子 3前体 (Solanum tuberosum cysteine p roteinase inhibitor 3 p recursor, GenBank注册序列
号为 AAB6310311) 等氨基酸同源性分别为 94%、94%、93%。
大多数马铃薯半胱氨酸蛋白酶抑制子 ( Potato cysteine p roteinase inhibitors, PCP Is) 基因成簇分布
在马铃薯的第 3条染色体上 , 并且马铃薯半胱氨酸蛋白酶抑制子 9前体属于 A、B、C, 3个 KTI基因
家族中的 KTI2C类 (核酸序列注册号为 X56874) (Heibges et al. , 2003) , 因此推测 KTI2like也应属于
KTI2C类。
根据已克隆抗病基因保守的 NBS和 LRR结构域设计简并引物进行 cDNA2RGA分析 , 由于简并引
物与模板核酸序列之间的配对具有一定的随机性 , 因此所获得的差异表达片段大小并非都符合 NBS
和 LRR结构域之间的理论大小。
本研究所获得的片段 KTI2like EST大小为 103 bp (去除两端的引物序列后 )。图 2为 KTI2like EST
核甘酸序列及推导的氨基酸序列。
图 2　KT I2like EST在青枯病菌接种后不同时期的表达
F ig. 2　RT2PCR ana lysis of KT I2like gene a t d ifferen t tim e po in t of Rs2trea ted sam ples
213　RT2PCR验证
以反转录合成病菌处理 0、6、12、24、48、72和 96 h马铃薯植株叶片的 cDNA第一链为模板 ,
进行 cDNA2RGA分析。结果表明 : KTI2like基因在正常情况下维持低水平表达 , 但该基因受马铃薯青
枯病菌的诱导 , 在病菌接种后 12 h内启动表达 , 然后表达量逐渐升高 , 至 48 h达最高水平 , 而后又
逐渐降低恢复到正常低水平 (图 3)。说明植物本身具有这些基因 , 在未受外界刺激时 , 维持低水平
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表达以调节植物体内相关蛋白的代谢 , 当受到外界刺激后 , 为了抵抗外界的危害而启动其自身的防御
机制 , 从而表现出基因表达量的变化。这与植物半胱氨酸蛋白酶抑制子具有调节植物体内蛋白质降
解 , 抑制来自细菌、病毒等外源半胱氨酸蛋白酶的作用的报道 (A rai & Abe, 2000) 是吻合的。
图 3　KT I2like EST核甘酸序列及推导的氨基酸序列
F ig. 3　KT I2like EST nucleotide sequence and its deduced am ino ac id sequence
马铃薯中存在中等分子量大小的 PCP I多基因家族 , 可在必要时短时间内产生大量的蛋白 (Hei2
decker & Messing, 1986) , 该类基因不含内含子 , 有利于植物对外源信号刺激快速反应 (DpiOnoforio et
al. , 1991) , PCP I受茉莉酸的诱导并在植物液泡中积累 , 参与马铃薯对病原的抗病防御 ( Gruden et
al. , 1997)。
本研究所获得的 KTI2like基因受青枯病菌的诱导并快速反应 , 与文献报道 ( Tadamasa et al. ,
2000) 一致 , 因此推测 KTI2like基因参与了马铃薯抗青枯病的反应。
References
A rai S, Abe K. 2000. Cystatin2based control of insects, with special reference to orycystatin. In: M ichaud D ed. Recombinant p rotease inhibitors
in p lants. Eurekah. com: 27 - 42.
DpiOnoforio M, Lee D M, Starr C M, M illerM, Hanover J H. 1991. The gene encoding rat nuclear pore glycop rotein p62 is intronless. J. B iol.
Chem. 266: 11980 - 11985.
D rouin G, Dover G A. 1990. Independent gene evolution in the potato actin gene fam ily demonstrated by phylogenetic p rocedures for resolving gene
conversions and the phylogeny of angiosperm actin genes. J. Mol. Evol. , 31: 132 - 150.
Fan S G, W u G J. 2005. Characteristics of p lant p roteinase inhibitors and their app lications in combating phytophagous insects. Bot. Bull. Acad.
Sin. , 46: 273 - 292.
Gruden K, Strukelj B, RavnikarM, Poljsak2PrijateljM, Mavric I, B rzin J, Pungercar J, Kregar I. 1997. Potato cysteine p roteinase inhibitor gene
fam ily: molecular cloning, characterisation and immunocytochem ical localisation studies. PlantMolecular B iology, 34: 317 - 323.
Heibges A, Glaczinski H, Ballvora A, Salam ini F, Gebhardt C. 2003. Structural diversity and organization of three gene fam ilies for Kunitz2type
enzyme inhibitors from potato tubers (Solanum tuberosum L. ) . Mol. Gen. Genom ics, 269: 526 - 534.
Heidecker G T, Messing J. 1986. Structural analysis of p lant genes. Annu. Rev. Plant Physiol. , 37: 439 - 466.
L i Guang2cun, J in L i2p ing P, Xie Kai2yun, Qu Dong2yu. 2004. Research p rogress of potato bacterial wilt. Chinese Potato Journal, 18 (6) : 350
- 354. ( in Chinese )
李广存 , 金黎平 , 谢开云 , 屈冬玉. 2004. 马铃薯青枯病研究进展. 中国马铃薯 , 18 (6) : 350 - 354.
L i Guang2cun, J in L i2p ing, Xie Kai2yun, PangW an2fu, B ian Chun2song, Duan Shao2guang, Qu Dong2yu. 2006. A new identification method for
Ralston ia solanacearum resistance in potato (Solanum tuberosum L. ) . Chinese Potato Journal, 20 (3) : 129 - 134. ( in Chinese)
李广存 , 金黎平 , 谢开云 , 庞万福 , 卞春松 , 段绍光 , 屈冬玉. 2006. 马铃薯青枯病抗性鉴定新方法. 中国马铃薯 , 20 ( 3) : 129 -
134.
Tadamasa Ueda, Shigem i Seo, Yuko Ohashi, Junji Hashimoto. 2000. Circadian and senescence2enhanced exp ression of a tobacco cysteine p rotease
gene. PlantMolecular B iology, 44: 649 - 657.
Yu Y G, Buss G R, MaroofM A S. 1996. Isolation of a superfam ily of candidate disease2resistance genes in soybean based on a conserved nucleo2
tide2binding site. Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 93: 11751 - 11756.
604