全 文 ：园 　艺 　学 　报 　2008, 35 (6) : 799 - 804
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2007 - 12 - 21; 修回日期 : 2008 - 05 - 13
基金项目 : 江苏省高技术研究项目 (BG2006313) ; 国家高技术研究与发展计划重点项目 (2006AA100108)3 通讯作者 Author for correspondence ( E2mail: zhangzh@ njau1edu1cn)
致谢 : 南京农业大学园艺学院房经贵教授审校本文的英文部分 , 特此致谢。
砂梨果实 ACC氧化酶 cDNA克隆及其反义表达载
体构建
乔玉山 1 , 宋长年 1 , 渠慎春 1 , 胡钟东 1 , 熊爱生 2 , 姚泉洪 2 , 章 镇 13
(1 南京农业大学园艺学院 , 南京 210095; 2 上海市农业科学院生物技术研究所 , 上海 201106)
摘 　要 : 利用 RT2PCR和 RACE技术从 ‘早生新水 ’砂梨成熟果实 cDNA中克隆出 ACC氧化酶基因保
守片段及其 5′和 3′端 , 拼接后获得砂梨果实 ACC氧化酶 cDNA全长。该 cDNA全长 1 225 bp, 将其命名为
Pyp2ACO , GenBank登录号为 EF451060。Pyp2ACO核苷酸序列有一个 945 bp的开放读码框 , 5′端非翻译区
为 63 bp, 3′端非翻译区为 217 bp, 与西洋梨和苹果的编码区核苷酸序列有较高的同源性 , 分别为 9813%和
9811%。Pyp2ACO推导编码 314个氨基酸 , 该序列具备非血红素二价铁离子依赖型的氧化 /加氧酶类的 12
个保守氨基酸和催化活性所需的 3个氨基酸。将 Pyp2ACO编码区序列反向插入 pYPX145载体 , 构建了由双
35S启动子所控制的双元表达载体 , 同时已成功将表达载体导入根癌农杆菌菌株 LBA4404, 为耐贮藏转基
因梨选育奠定了基础。
关键词 : 砂梨 ; ACC氧化酶 ; cDNA; 克隆 ; 反义表达载体
中图分类号 : S 66112　　文献标识码 : A　　文章编号 : 05132353X (2008) 0620799206
C lon ing of cD NA for ACC O x ida se from Fru it of Pyrus pyrifo lia Naka i and
Con struction of Its Correspond ing An tisen se Expression Vector
Q IAO Yu2shan1 , SONG Chang2nian1 , QU Shen2chun1 , HU Zhong2dong1 , X IONG A i2sheng2 , YAO Quan2
hong2 , and ZHANG Zhen13
(1 College of Horticulture, N an jing A gricu ltura l U niversity, N an jing 210095, Ch ina; 2B iotechnology Research Institu te, Shanghai
A cadem y of A gricultural Sciences, Shanghai 201106, China)
Abstract: A conserved fragment of ACC oxidase cDNA, and its corresponding 5′2 and 3′2end sequences
were successfully obtained from sand pear ( Pyrus pyrifolia Nakai‘Zaosheng Xinshui’) by RT2PCR and
RACE. They were sp liced into a 1 225 bp full length cDNA which designated as Pyp2ACO. Its open reading
frame is 945 nucleotides in length, and its up stream and downstream are 63 bp of 5′2UTR and 217 bp of 3′2
UTR. The sequence was deposited in GenBank database, accession number EF451060. The nucleic acid of
Pyp2ACO shares 9813% and 9811% sequence identity with those of P. comm unis L. and M alus dom estica
Borkh. The deduced am ino acid sequence of Pyp2ACO is 314 residues and contains twelve conserved residues
belonging to non2heme iron ( Ⅱ) dependent fam ily of oxygenases/oxidases and three residues essential for
emzyme activation. A binary antisense exp ression vectorwith Pyp2ACO coding region was constructed by inser2
ting the target fragment in reverse orientation in pYPX145. The exp ression of the gene is controlled by a doub2
le 35S p romoter. The vector was successfully introduced into A g robacterium tum efaciens strain LBA4404 for
further transformation to develop transgenic pear for fruit with longer shelf life.
Key words: Pyrus pyrifolia Nakai; ACC oxidase; cDNA; clone; antisense exp ression vector
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园 　　艺 　　学 　　报 35卷
砂梨 ( Pyrus pyrifolia Nakai) 是我国主栽梨类型之一 , 尤其在我国南方梨产区占有重要的地位。
Itai等 (1999) 的研究表明 , 果实乙烯释放峰值很低时 (小于 015μL·kg- 1 ·h - 1 ) , 砂梨品种果实贮
藏性能较好 , 并且呈现出早熟品种不耐贮藏而晚熟品种较耐贮藏的特点。植物体内乙烯生物合成途径
已经明确 , 这为通过基因工程技术调控果实乙烯释放量提供了可能 , 而实现该目标的前提是分离出合
成途径的关键酶基因。ACC氧化酶是调控乙烯合成的关键酶之一 , 已在西洋梨 (Lelièvre et al. ,
1997)、苹果 (Dong et al. , 1992b; Ross et al. , 1992)、美味猕猴桃 (MacD iarm id & Gardner, 1993)、
桃 (Callahan et al. , 1992, 1993)、杏 (Mbéguié2A2Mbéguiéet al. , 1999) 和柿 (Nakano et al. , 2003)
等果树上克隆了该酶的 cDNA。
‘早生新水 ’是从 ‘新水 ’实生后代中选育出的早熟品种 (骆军 等 , 2006) , 与其他早熟砂梨品
种相似 , 果实不耐贮藏。本试验中以该品种的果实为试材 , 克隆 ACC氧化酶基因的 cDNA全长 , 并
构建该基因编码区的反义转化载体 , 为转基因耐贮藏砂梨品种的选育奠定基础。
1　材料与方法
111　材料
砂梨 ‘早生新水 ’成熟果实取自上海市农业科学院林业果树研究所。
根癌农杆菌 (A grobacterium tum efaciens) 菌株 LBA4404和大肠杆菌 ( Escherich ia coli) 菌株 DH5α
由本实验室保存 ; 植物双元表达载体为自主构建的 pYPX145 (DDBJ /EMBL /GenBank 登录号为
AY178048) ; T/A克隆所需的 pMD218 T载体和 pMD218 Simp le T载体购自 TaKaRa公司。
SMARTTM PCR cDNA Synthesis Kit购自 Clontech公司 , RE酶、Ex2Taq酶、dNTPs、DNA Marker购
自 TaKaRa公司 , T4 DNA连接酶购自 Promega公司 , DNA回收试剂盒为 Bay Gene公司生产。各种引
物由上海英骏生物技术有限公司 ( Invitrogen) 合成 , 其编号及序列见表 1。
表 1　引物序列
Table 1　Sequence of pr im ers
编号
No.
序列
Sequence (5′- 3′)
基因中的位置
Position in gene
作用
Function
预期片段大小 / bp
Expected size
P01 GCAGGACTGCAGCTGACTGACTAC T30VN cDNA合成
P02 GACCAGTGGTATCAACGCAGAGTAC GCGGG Synthesize of cDNA
P032F GATGCCTGTGAGAACTGGGGNTTYTTYGA 扩增保守片段 ±510
P042R GAGCTGCAGACCACTGACYTTRTCRTCYTG For conserved fragment
P052F ATCTACTGAGCTTTTGGACA 123～142 3′RACE ±1 000
P062R GCAGGACTGCAGCTGACTGACTAC
P072F GACCAGTGGTATCAACGCAGAGTAC 5′RACE ±700
P082R GGCGTCGCTGTGGGCCCGGAG 520～540
P092F ATGGCGACCTTCCCAGTTGT 　 1～20 扩增基因编码区 　 942
P102R GGTAGTTGCAACAGGGGTCGAT 921～942 For CDS of gene
P112F GAGCTCATGGCGACCTTCCCAGTTGT 　 1～20 扩增基因编码区 　 948
P122R GGATCCGGTAGTTGCAACAGGGGTCGAT 921～942 For CDS of gene
　　注 : 相同框是相互匹配的引物与接头 ; 下划线为引入的酶切位点 , GAGCTC为 Sac I, GGATCC为 B am H I; 引物编号中 F代表上
游引物 , R代表下游引物。
Note: The same frame denotes matching p rimers or adap tors; GAGCTC (Sac I) and GGATCC (B am H I) underlined in p rimers indicate re2
striction enzyme sites; F and R in p rimer number rep resent forward and reverse p rimer, respectively.
112　方法
11211　RNA提取与纯化 　果实总 RNA的提取按照 Manning (1991) 的方法。mRNA的纯化采用 Pro2
mega公司生产的 PloyA Tractµ mRNA Isolation System IV 试剂盒进行。
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　6期 乔玉山等 : 砂梨果实 ACC氧化酶 cDNA克隆及其反义表达载体构建 　
11212　cDNA合成 　以 mRNA为模板 , 按照 SMARTTM PCR cDNA Synthesis Kit的基本操作流程合成
cDNA, 不同之处是 : cDNA的合成引物 P01和 P02为自行设计 , 且在引物的 5′端设计有 PCR扩增所
需的接头 (表 1序列中的阴影部分 )。引物 P01是通过 O ligo ( dT) 30和两个简并碱基 (VN ) 与 mRNA
的 Poly+ (A ) 锚定结合引导合成 cDNA第 1条链 , 引物 P02的 3′末端为 O ligo ( dG) 3 , 目的是与 cDNA
第 1条链形成后反转录酶在其 3′末端加上的 O ligo ( dC) 相退火 , 使引物 P02作为反转录酶继续延伸
cDNA第 1条链的转移模板。最后获得的 cDNA是 5′末端带有引物 P01序列、3′末端带有引物 P02互
补序列的单链 cDNA分子。失活反转录酶后 , 用 Tricine2EDTA buffer [ 10 mmol·L - 1 Tricine2KOH (pH
815)、110 mmol·L - 1 EDTA ] 稀释 50倍 , - 70 ℃保存备用。
11213　保守片段的扩增 　以 cDNA为模板 , 用简并引物 P032F /P042R进行 PCR扩增 , 反应体系为 50
μL: cDNA 1μL, 引物各 1μL, Ex2Taq酶 015 U , 反应参数为 : 94 ℃预变性 10 m in; 94 ℃ 30 s,
52 ℃ 30 s, 72 ℃ 1 m in, 35个循环 ; 72 ℃延伸 10 m in。琼脂糖凝胶电泳检测后用 DNA回收试剂盒回
收目标片段进行 T/A克隆 , DNA测序由上海英骏生物技术有限公司完成 (下同 )。
11214　3′和 5′RACE的扩增 　以 cDNA为模板 , 用引物 P052F /P062R进行 3′RACE扩增获得基因的 3′
端 , 其中第 1轮反应为引物 P052F与 cDNA单链结合 , 在 Ex2Taq酶作用下扩增出目标基因 3′端的双
链 cDNA, 第 2轮及以后的反应是在 P052F和 P062R双引物引导下进行 PCR扩增 , 共计 35个循环 ,
其他反应参数与体系同保守片段的扩增。用引物 P072F /P082R进行 5′RACE扩增获得基因 5′端 , 其中
第 1轮反应为引物 P072F与 cDNA单链结合 , 在 Ex2Taq酶作用下扩增出目标基因 5′端的双链 cDNA ,
第 2轮及以后的反应是在 P072F和 P082R双引物引导下进行 PCR扩增 , 共计 35个循环。其他反应参
数与体系同保守片段的扩增。
11215　生物信息学分析 　利用 DNAMAN5122软件对保守片段、3′端和 5′端序列进行拼接分析 ; 核苷
酸和氨基酸序列分析分别利用 BLASTN和 BLASTP ( http: / /www1ncbi1nlm1nih1gov) 进行。
11216　反义表达载体的构建 　用引入 SacⅠ酶切位点的引物 P112F和引入 B am H I的引物 P122R扩增
编码区全长 , 正确的克隆片段按图 1反向插入植物双元表达载体 pYPX145的相应克隆位点 , 并再次
双酶切和测序鉴定。正确表达载体按照 Dower等 (1988) 的方法导入 LBA4404。
11217　其他操作 　DNA连接、转化、质粒提取、酶切鉴定等参照试剂盒操作说明或标准的分子克隆
步骤完成 ( Sambrook & Russell, 2001)。
图 1　Pyp2ACO 编码区双元反义表达载体 T2D NA结构图
F ig. 1　D iagram of T2D NA reg ion s of b inary an tisen se expression vector of Pyp2ACO cod ing reg ion
2　结果与分析
211　cD NA保守片段的扩增
用引物 P032F /P042R扩增获得了预期 ±510 bp的目标片段 , 回收该片段连接至 pMD218 T载体 ,
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经克隆和酶切鉴定正确后测序 , 获得了长度为 516 bp的 DNA 片段 , 经 BLASTN比对 , 该片段与西洋
梨、苹果、桃和杏等蔷薇科果树的 ACC氧化酶 cDNA序列同源性较高 , 初步确定为砂梨 ACC氧化酶
基因 cDNA保守片段。据此设计基因特异引物 P052F和 P082R分别用于 3′和 5′RACE的扩增。
212　砂梨 ACC氧化酶基因 cD NA全长的获得
利用引物 P052F /P062R进行 3′RACE扩增 , 产生了预期 ±1 000 bp的片段 , 经克隆测序 , 该片段
1 064 bp , 经比对与苹果和西洋梨等物种的 ACC氧化酶基因高度同源 , 推断是 ACC氧化酶 cDNA的
3′端。利用引物 P072F /P082R进行 5′RACE扩增 , 获得了预期 ±700 bp的片段 , 经克隆测序 , 该片段
628 bp, 经比对与苹果、西洋梨等植物的 ACC氧化酶基因高度同源 , 推断是 ACC氧化酶 cDNA的 5′
端。对 3′端、5′端和保守片段进行拼接分析 , 去除接头序列后获得了砂梨果实 ACC氧化酶 cDNA全
长 , 命名为 Pyp2ACO。该 cDNA全长为 1 225 bp, 有一个 945 bp完整的读码框 , 5′非翻译区为 63 bp,
3′非翻译区为 217 bp, 并带有 29 bp的 Poly+ (A)。该 cDNA推导编码 314个氨基酸 (图 2)。
图 2　Pyp2ACO cD NA全长与推导氨基酸序列
ATG为起始密码子 ; TGA 为终止密码子 ; 单下划线部分为非血红素二价铁离子依赖型氧化 /
加氧酶类的保守氨基酸残基 ; 双下划线部分为 CO2激活剂可能的作用位点。
F ig. 2　Nucleotide and deduced am ino ac id sequences of the com plete cD NA of Pyp2ACO
ATG : Start codon, TGA : Stop codon; Underlined residues indicate am ino acids
which are conserved for non2heme iron (Ⅱ) dependent fam ily of oxygenases and oxidases;
Double underlined residue denotes putative active site of carbon dioxide as activator.
为验证拼接分析的准确性 , 以 cDNA为模板和 P092F /P102R为引物进行扩增 , 获得了长度为 942
bp的序列 , 与拼接的编码区序列完全一致 , 说明 Pyp2ACO 拼接结果正确。此 Pyp2ACO 登录于 Gen2
Bank数据库中 , 登录号为 EF451060。Pyp2ACO编码区与西洋梨 (Lelièvre et al. , 1997)、苹果 (Dong
et al. , 1992b; Ross et al. , 1992)、美味猕猴桃 (MacD iarm id & Gardner, 1993)、柿 (Nakano et al. ,
2003) 和杏 (Mbéguié2A2Mbéguiéet al. , 1999) 等果树 ACC氧化酶基因 cDNA的同源性分别为 9813%
(X87097 )、 9811% ( X61390, M81794 )、 8215% ( M97961 )、 8012% ( AB073009 ) 和 7816%
(AF026793)。为便于表达载体的构建对该序列酶切位点进行了分析 , 结果是在编码区第 446～447核
苷酸间存在一个 B am H Ⅰ酶切位点。
213　砂梨 ACC氧化酶氨基酸序列分析
Pyp2ACO编码的氨基酸与西洋梨 (Lelièvre et al. , 1997)、苹果 (Dong et al. , 1992b; Ross et al. ,
1992)、美味猕猴桃 (MacD iarm id & Gardner, 1993)、柿 (Nakano et al. , 2003)、桃 (Callahan et al. ,
1992; 1993)、杏 (Mbéguié2A2Mbéguiéet al. , 1999) 等 6种果树 ACC氧化酶的同源性分别为 9718%
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　6期 乔玉山等 : 砂梨果实 ACC氧化酶 cDNA克隆及其反义表达载体构建 　
( X87097 )、 9718% ( M81794, X61390 )、 7910% ( M97961 )、 7714% ( AB073009 )、 7515%
(AF319166) 和 7510% (AF026793)。
植物 ACC氧化酶属于非血红素二价铁离子依赖型氧化 /加氧酶类 , 其催化反应需要 Fe2 +作为辅助
因子和抗坏血酸作为共底物 , 这类酶有 12个氨基酸是保守的 , 即 P5、A27、G32、H39、H177、D179、
L195、Q196、G218、H234、R244、S246 ( Tang et al. , 1993) , 其中 H177、D179和 H234是酶活性所必需的 , 是
Fe2 +辅助因子可能的结合位点 ( Shaw et al. , 1996)。Pyp2ACO编码的氨基酸相应位置上均存在这些保
守和必需的氨基酸 (图 2)。
另外 , CO2也是 ACC氧化酶的激活剂 (Dong et al. , 1992a; Zhou et al. , 2002 ) , 根据 Lay等
(1996) 的假说 , 该氨基酸序列第 299位精氨酸 R可能是 CO2的作用位点。
214　砂梨 ACC氧化酶 cD NA反义表达载体的构建
以 P112F /P122R为引物 , 从 Pyp2ACO克隆载体中扩增出编码区序列连接至 pMD218 T Simp le载体
再进行测序 , 将测序正确的用 B am HⅠ和 SacⅠ切下插入 pYPX145相应克隆位点成功构建表达载体
pPyp2ACO , 经 B am HⅠ和 SacⅠ双酶切鉴定 (图 3) 和测序确定构建是正确的。由于插入片段的中部
含有一个 B am HⅠ酶切位点 , 故采用 B am HⅠ和 SacⅠ不完全酶切获得预期 ±1 000 bp和 ±500 bp两个
条带 (图 3) , 前者是双酶切得到的完整插入片段 , 而后者是插入片段中间又被 B am HⅠ切开而产生
的两个小片段 , 进一步说明双酶切鉴定结果正确。该表达载体含有双 35S (Double 35S, D35S) 启动
子控制的反向表达目的基因、35S增强启动子 (即 35SΩ ) 控制的 Km筛选标记基因、来自烟草的细
胞核骨架结合单元 ( nuclear scaffold2associated region) 即 SAR序列和 GUS报告基因 (图 1)。
将 pPyp2ACO导入根癌农杆菌菌株 LBA4404成功构建了植物遗传转化载体 , 经 PCR鉴定是正确
的 (图 4)。
图 3　双元表达载体 pPyp2ACO酶切鉴定图
F ig. 3　D iagram of pPyp2ACO d igested w ith restr iction enzym e 图 4　L BA4404的 PCR检测F ig. 4　PCR iden tif ica tion for L BA4404
3　讨论
苹果和西洋梨利用反义表达转基因技术分别获得成功 (Dandekar et al. , 2004; Gao et al. , 2007) ,
使其成为选育耐贮藏果树新品种有效的途径之一 ( Petri & Burgos, 2005)。砂梨是我国南方地区主要
的梨种类 , 该系统果实存在不耐贮藏、货架期短的问题。通过传统杂交育种选育耐贮藏砂梨品种存在
一定困难 , 而通过反义表达的转基因技术实现这一目标应该可行。鉴于此 , 作者克隆了砂梨 ACC氧
化酶基因 cDNA全长 , 并成功构建了其反义表达载体 , 为耐贮藏砂梨新品系的选育奠定了基础。
作者曾在番茄 ACC氧化酶和 ACC合酶融合反义表达载体的构建过程中 , 对 pYPX145载体进行了
改造 , 即为了增强外源基因的表达、克服位置效应和缓解基因沉默等 , 在目的基因表达单元的两侧各
引入了一个 SAR序列 (熊爱生 等 , 2003) , 但实践表明这会因 T2DNA区存在过多冗余而造成遗传转
化中的整合障碍。鉴于此 , 本研究在构建载体时仅在目的基因表达单元的启动子外侧引入一个 SAR
序列 , 以期达到稳定表达与高效整合的有效平衡。
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