全 文 ：园 　艺 　学 　报 　2006, 33 (3) : 561～565
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2005 - 08 - 05; 修回日期 : 2006 - 02 - 18
基金项目 : 国家 ‘863’计划资助项目 (2003AA207120) ; 国家自然科学基金资助项目 (30370981, 30471188, 30400298)3 通讯作者 Author for correspondence ( E2mail: wangxw@mail1caas1net1cn)
青花菜快速碱化因子 RAL F的克隆与序列分析
张国裕 1, 2 　康俊根 2 　张延国 2 　娄　平 2 　程智慧 1 　王晓武 23
(1 西北农林科技大学园艺学院 , 陕西杨凌 712100; 2 中国农业科学院蔬菜花卉研究所 , 北京 100081)
摘 　要 : 以一个与甘蓝显性核不育相关的差异表达片段序列为信息探针 , 在 NCB I与 TA IR网站数据库中
进行同源 EST序列搜索 , 经人工拼接、RT - PCR克隆与序列分析验证 , 获得了青花菜快速碱化因子 RALF
(Rap id A lkalinization Factors) 基因的 cDNA全长序列 , 命名为 B oRALFL1 ( GenBank序列登录号 DQ059310)。
该 cDNA全长 240 bp, 编码 79个氨基酸 , 与电子克隆获得的序列完全相同。序列分析表明 , 编码蛋白存在前
导信号肽与多个磷酸化位点 , 与同源基因 RALFL8核酸序列在 88 bp上有 82%的一致性 , 推导的氨基酸序列在
74个氨基酸上存在 56%的一致性 , 不同植物间氨基酸序列 N -端差异大 , C -端具有较高的保守性。
关键词 : 青花菜 ; 快速碱化因子 (RALF) ; 基因克隆 ; RT2PCR
中图分类号 : S 635　　文献标识码 : A　　文章编号 : 05132353X (2006) 0320561205
C lon ing and Sequence Ana lyz ing of a Gene ( RAL F ) from Broccoli
Zhang Guoyu1, 2 , Kang Jungen2 , Zhang Yanguo2 , Lou Ping2 , Cheng Zhihui1 , and W ang Xiaowu23
( 1 College of Horticulture, N orthw est A & F U niversity, Yang ling, Shananxi 712100, China; 2 Institu te of V egetables and Flow ers,
Chinese A cadem y of A gricultural Sciences, B eijing 100081, Ch ina)
Abstract: A differential TDF ( Transcrip t Derived Fragments) in a cDNA2AFLP analysis of buds from
male sterile and fertile lines of cabbage was used as a querying p robe to blast the GenBank ( http: / /
www1ncbi1nlm1nih1gov/BLAST) and A rabidopsis ( http: / /www1arabidop sis1org /B lAST) database. Based
on the assembled homologous cDNA sequences, a 490 bp cDNA was amp lified and cloned by RT - PCR. Ho2
mologous analysis shows that the amp lified cDNA has 82% identity on the nucleotide acid sequence, and 56%
identity on the am ino acids pep tide with A rabidopsis gene RAL FL8. W e designated the gene as B oRAL FL1
( GenBank accession number DQ059310). W e p redicted a 240 bp ORF in B oRAL FL1 and a 79 am ino acids
pep tide was coded by this cDNA. Further analysis shows that the pepetide is possibly a p rep rotein with a signal
pepetide and multi2phosphorylation sites, and the C2term inal am ino acids of the pepetide are highly conserved
among different p lant species.
Key words: B roccoli; B rassica oleracea L. var. ita lica Plancn; RAL F; Gene cloning; RT - PCR
RAL F (Rap id A lkalinization Factors) 即快速碱化因子 , 最早是由 Pearce等〔1〕从烟草叶片中分离出
来的一类多肽激素类物质。此后 , 编码 RAL F的表达序列标签 ESTs ( Exp ressed Sequence Tags) 又陆续
在 9个科 16种植物中得到鉴定。各物种的序列标签标明 , RAL F属于多基因家族 , 其成熟蛋白是由约
50个氨基酸组成的多肽 , 前体蛋白为分泌型蛋白。前体蛋白 N - 端同源性较低 , 但加工位点序列具
有极高的保守性 , 前导信号肽在到达作用位点后被剪切 , 加工形成有功能的成熟蛋白。RAL F可快速
碱化悬浮培养细胞培养基 , 迅速激活有丝分裂原活化蛋白 (MAP) 激酶 , 可逆性的调控番茄与拟南
芥种子萌发期间根生长和根毛形成。RALF在高等植物不同组织中的广泛存在和其成熟蛋白在进化上
的保守性 , 暗示了它可能在植物生长发育或防御功能中起着非常重要的作用 , 但具体作用尚不清
楚〔2, 3〕。
园 　　艺 　　学 　　报 33卷
作者曾得到一个与甘蓝显性核不育相关的差异表达片段 TDF ( Transcrip t Derived Fragments)〔4〕。
本研究以此 TDF序列为信息探针 , 采用电子克隆的策略〔5〕, 获得了青花菜 RAL F基因 cDNA全长序
列 , 并利用 RT - PCR的方法进行克隆验证 , 继而对该 cDNA序列及其推导的蛋白质序列进行分析 ,
初步推测其功能 , 为进一步研究其在甘蓝显性核不育小孢子发育过程中的作用奠定基础。
1　材料与方法
111　材料与试剂
试验所用青花菜 (B rassica oleracea L. var. ita lica Plancn) 材料为自交系 B102144。克隆载体 pMD
182T Vector和胶回收纯化试剂盒为日本 TaKaRa公司产品 ; T4 DNA 连接酶为日本 ToYoBo公司产品 ;
宿主菌 E1coli TOP10、Taq DNA 聚合酶和 DNA Marker购自北京天为时代科技有限公司 ; 逆转录试剂
盒和 Trizol试剂为美国 Invitrogen产品。
112　方法
11211　总 RNA的提取及反转录合成单链 cDNA　花药 RNA的提取采用 TR Izol试剂盒〔4〕的方法进行 ,
取 011 g青花菜花药组织 , 液氮迅速研磨后加入 1 mL Trizol试剂充分摇匀 , 最后溶于 20μL DEPC水
中。 cDNA的合成按反转录试剂盒说明书进行。
11212　引物的设计合成与 PCR扩增 　根据电子克隆所得的完整 cDNA序列 , 设计合成特异引物 (由
上海生工生物工程公司合成 ) : 正向引物 : 5piACAGAGCAGATACCAAATACAAT 3pi; 反向引物 :
5piCAATCAGTTACAAACCAATACAG 3pi。以供试青花菜 cDNA 为模板扩增特异片段。 PCR 反应体系 :
cDNA模板 015μL, 10 ×PCR缓冲溶液 2μL, 特异引物 (5 pmol/μL) 014μL, 10 mmol/L dNTPs 116
μL, Taq酶 (215 U /μL) 014μL, 加水到总体积 20μL。程序为 94℃预变性 3 m in, 94℃变性 30 s,
45℃复性 45 s, 72℃延伸 30 s。共 35个循环 , 72℃延伸 10 m in。反应完毕后取 8μL于 110%的琼脂
糖凝胶上进行电泳分析。
11213　重组、克隆和 DNA序列分析 　琼脂糖凝胶电泳回收 PCR产物 , 克隆到 pMD 182T载体上 , 按
照说明书进行操作 , 通过蓝白菌落挑选阳性克隆 , 委托北京三博远志生物技术有限责任公司进行
DNA序列测定。利用 DNA star软件对 B oRAL FL1基因的核苷酸与蛋白序列进行分析。
2　结果与分析
211　青花菜 B oRAL FL 1的 cD NA克隆
以一个与甘蓝显性核不育相关的差异表达片段 ( TDFs Transcrip t Derived Fragments) 序列为信息
探针在 http: / /www1ncbi1nlm1nih1gov/BLAST与 http: / /www1arabidop sis1org/B lAST的数据库中进行
同源序列检索 , 得到与之同源的基因序列或 EST片段。将检出的与信息探针序列同源性较高或部分
重叠的 EST序列拼接组装为重叠群 , 再以此重叠群序列重复以上检索过程 , 反复进行序列的拼接和
比对 , 直至重叠群不能继续延伸〔5〕, 得到长 490 bp的青花菜 B oRAL FL1基因的 cDNA可靠序列 , 并受
信息探针的完全支持。经 DNA star软件分析 , 发现其具有完整的开放阅读框架 (ORF) , 编码 79个氨
基酸。
以此序列为模版设计特异引物进行目的片段的 RT - PCR扩增 , 1%琼脂糖凝胶电泳分析的结果显
示 , 得到与预计大小相符的约 490 bp的特异条带 (图 1)。用 pMD 182T载体克隆后测序 , 与电子克
隆序列一致 (图 2)。经 DNA star软件进行开放阅读框架 (ORF) 的搜索以及与相似性较高的拟南芥
基因 RAL FL8、RAL FL9比对分析 , 确定了起始密码子在第 133位 , 终止密码子在第 370位 , 长度为
240 bp的开放阅读框。ATG上游 - 3位核苷酸为 A, + 4位为 G, 是一个典型的 Kozak结构 , 这一结
构对于蛋白质合成的 40S起始复合物正确识别启始密码子具有重要的作用 , 并且在同一读码框中 , 起
始位点上游存在多个终止子序列 ,有明显的转录翻译起始序列的特点 ,因此推定得到了青花菜B oRAL FL1
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　3期 张国裕等 : 青花菜快速碱化因子 RALF的克隆与序列分析 　
cDNA完整序列 , GenBank登录号为 DQ059310。
212　B oRAL FL 1的基因组序列
以青花菜 DNA ( 50 ng) 为模版 , 利用设计
的特异引物进行基因组 B oRAL FL1序列的扩增 ,
得到的特异片段与 RT - PCR获得的产物大小相同
(图 1) , 克隆测序后发现序列一致 , 表明此基因
不存在内含子 , 与同源性较高的拟南芥 RAL F基
因 RAL FL8和 RAL FL9的结构相似。
213　B oRAL FL 1序列同源性分析
对 B oRAL FL1核酸序列的同源性分析表明 :
B oRAL FL1与同科植物拟南芥 RAL FL8核酸序列在
253与 340 间的 88 bp 上有 82%的一致性 ; 与
RAL FL9序列在 120与 186间的 67 bp上有 85%的
一致性 ; 与其它高等植物 RAL F基因核酸序列一
致性较低。经全序列比对 , B oRAL FL1与 RAL FL8
图 1　青花菜 BoRALFL1 RT - PCR与基因组 PCR产物琼脂糖电泳分析
1. DNA 标准分子量 ; 2. RT - PCR产物 ; 3. 基因组 PCR产物。
F ig. 1　 Iden tif ica tion of the RT - PCR and PCR product by
agrose gel electrophoresis
1. DNA molecular mass marker; 2. RT - PCR p roduct;
3. PCR p roduct of the genome.
图 2　青花菜 B oRAL FL 1的 cD NA序列及推导的氨基酸序列
下划线示启动子 , 虚线处示引物结合区 , 3 示终止密码子 , 方框示起始区上游终止序列。
F ig. 2　The nucleotide ac id sequence and deduced am ino ac id sequence for B oRAL FL 1
Initial codon is underlined; Regions underscored with a dashed line correspond to sequences used for PCR p rimers; Stop codon
is indicated by asterisk ( 3 ) ; A stop codon up stream was boxed.
一致率最高 , 为 5612%。玉米中克隆到的 RAL F基因序列与其它植物序列一致性较低 , 与同是单子叶
植物的水稻的一致率最高 , 也才达到 1313%。番茄、白杨、小麦、大麦、松等植物之间的核酸序列
保守性较高 , 一致率均在 50%以上。
214　B oRAL FL 1编码氨基酸的功能分析与同源性比较
B oRAL FL1编码 79个氨基酸 , 相对分子量为 81724 kD , 等电点 p I = 7180。经 SOSU I预测 4～25
氨基酸为高度疏水的跨膜螺旋结构域 ; Signal P 310预测结果表明存在 N - 端信号肽 , 可信值为
01983, 在第 28位上丝氨酸 ( Ser) 至第 29位的精氨酸 (A rg) 处为最可能的前体蛋白剪切位点。
Subloc V 110分析显示该蛋白为分泌型蛋白。Prosite数据库序列模体分析结果表明在 6～8、51～53氨
基酸处为两个蛋白激酶 ( PKC) 磷酸化位点 , 24～27氨基酸处为酪蛋白激酶 2磷酸化位点 , 53～60
氨基酸处为酪氨酸激酶 ( TYR) 磷酸化位点。这些特征表明 B oRAL FL1基因编码的蛋白与前人研究的
快速碱化因子 ( RAL F )蛋白相似〔1, 6〕,可能也是由前体分泌蛋白经前导信号肽的剪切形成的有功能
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园 　　艺 　　学 　　报 33卷
的成熟多肽。存在的多个磷酸化位点可能与其前
体蛋白的加工和作为多肽激素的信号传导功能有
重要的关系。
经氨基酸序列同源检索 , B oRAL FL1与同科植
物拟南芥快速碱化因子 RAL FL8编码氨基酸序列
在 74个氨基酸上有 56%的一致性 , 与 RAL FL9在
81个氨基酸上有 48%的一致性。不同高等植物
RAL F前导信号肽的序列一致性较差 , 功能蛋白的
氨基酸序列一致性较高 , 特别是在成熟蛋白中能
形成与功能高度相关的二硫键的 4个 Cys - 残基
在各序列中高度保守。氨基酸序列的系统进化树
(图 3) 表明 : 氨基酸的序列进化与植物的进化保
持了一致 , 同科植物在进化树上处于同一分支 ,
B oRAL FL1、RAL FL8与 RAL FL9具有更近的亲缘关系。
3　讨论
Haruta等〔6〕对 15种高等植物的 RALF氨基酸
序列进行分析 , 发现成熟 RALF蛋白氨基酸序列
内部与其上游各有一个双精氨酸模体结构。该结
构在动物与酵母中是多肽激素前体进行加工的专
一 ser蛋白酶水解位点〔7〕, 预测可能是 RAL F前体
蛋白加工酶和成熟蛋白降解酶的结合位点。但此
结构在拟南芥 RAL FL8、RAL FL9与本研究获得的
B oRAL FL 1基因中不存在 ,在高等植物中也并未发
图 3　青花菜 B oRAL FL 1基因氨基酸序列与其它植物
氨基酸序列系统进化树
F ig. 3　Phylogenetic tree of aa sequence of broccoliB oRAL FL 1
gene w ith other reported genes
白杨 Poplar ( PtdRALF12AY172330, PtdRALF12AY172331) ; 棉花
Cotton (Cotton2RALF) ; 紫苜蓿 Medicago (Medicago2RALF) ; 豌豆
Pea ( Pea2RALF) ; 马铃薯 Potato (potato2RALF) ; 烟草 Tobacco
( TobRALF2AF407278) ; 冰叶菊 Ice p lant ( Ice p lant2RALF) ; 柳杉
China cedar (Cryp tomeria2RALF) ; 松 Pine ( Pine2RALF) ; 大豆
Soybean ( Soybean2RALF) ; 玉米 Maize (Maize2RALF) ; 高粱
Sorghum ( Sorghum2RALF) ; 大麦 Barley (Barley2RALF) ; 水稻
R ice (R ice2RALF) ; 小麦 W heat (W heat2RALF) ; 拟南芥
A rabidopsis thaliana (AT1G615631 RALFL8, AT1G6156611
RALFL9) ; 青花菜 B roccoli (BoRALFL1)
现加工所需的 ser蛋白酶 , 表明预测的剪切模式尚需进一步研究探讨。B oRAL FL1 C -端氨基酸序列存
在所有 RAL F共有的 4个保守 Cys -残基〔2〕, 对其功能与结构的保持有重要作用。
RALF是一类多肽激素 , 不同植物间核酸序列的差异可能暗示了它们是整个 RAL F多基因家族中
的不同成员 , 进化过程中形成的功能专化性可能造成了成员间的序列差异。
目前 , 对 RAL F的试验研究还比较肤浅。RAL FL8的组织表达特异性的研究表明 , 它是花药高丰
度表达的。B oRAL FL1与 RAL FL8相似性很高 , 而且克隆探针来源于与核不育基因相关的 cDNA2AFLP,
可以推测 B oRAL FL1与小孢子的发育有关。对 B oRAL FL1基因的克隆为进一步通过反义 RNA或 RNA i
技术研究其在小孢子发育中的具体功能〔8〕, 通过克隆其启动子调控序列融合 GFP或 GUS基因 , 研究
其时空表达的特异性〔9〕奠定了基础。
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　3期 张国裕等 : 青花菜快速碱化因子 RALF的克隆与序列分析 　
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收稿日期 : 2005 - 12 - 01; 修回日期 : 2006 - 04 - 19
基金项目 : 四川农作物育种攻关项目 (2001208203211)
番茄与茄子嫁接接合部愈伤组织的 RAPD分析
陈 　红 　王永清　 (四川农业大学林学园艺学院 , 四川 雅安 625014)
RAPD Ana lysis of T issues of Grafting Un ion in Toma to and Eggplan t
Chen Hong and W ang Yongqing　 (College of Forestry and Horticu lture, S ichuan A gricu ltura l U niversity, Yapian, S ichuan
625014, Ch ina)
关键词 : 番茄 ; 茄子 ; 嫁接接合部 ; 遗传分析 ; RAPD
中图分类号 : S 64112; S 64111　　文献标识码 : 　　A文章编号 : 05132353X (2006) 0320565201
采用劈接法进行 ‘粉红番茄 ’的自体嫁接以及与 ‘早茄二号 ’的异种嫁接 , 嫁接后 10～14 d, 从每个嫁接单株
上切取与嫁接面长度一致的接合部茎段 , 适当切除其嫁接面周围的砧木和接穗部分 , 对所剩部分以及其砧木腋芽的叶
片和接穗的叶片以改良 CATB法进行 DNA的提取。
从 18个能扩增出砧木和接穗 DNA特征带的引物中选择 6个扩增带清晰且较多的引物用于番茄自体嫁接以及番茄
与茄子异种嫁接单株的 RAPD分析。在番茄同种自体嫁接中 , 有 3个引物扩增出了嫁接接合部愈伤组织的特征带。用
引物 SBS - K4进行 DNA扩增 , 在嫁接接合部 ( GU ) 发现 2条 DNA特征带 (箭头所示 ) , 其大小分别为 900 bp 和 1
500～2 000 bp (图 1, A)。在番茄作砧木 ( St)、茄子作接穗 ( Sc) 的异种嫁接中 , 发现有 4个引物扩增出了嫁接接
合部 ( GU) 愈伤组织的特征带 (约 400 bp, 700～800 bp和 400 bp)。以引物 SBS - I16为例 , 在嫁接接合部有 1条强特
征带和 1条弱特征带被检测到 , 其大小分别是 300～400 bp和 700～800 bp (图 1, B) , 而同样的引物在供体砧木和接
穗中没有扩征出此两条特征带。此外 , 用引物 SBS - I18也扩增出了 1条接合部愈伤组织特征带 , 其大小为 400 bp, 但
与供体砧木和接穗对比 , 在嫁接接合部也发现 1条约 600 bp的供体砧木的特征带丢失。
在本研究中 , 番茄自体嫁接与番茄与茄子的异种嫁接的接合部均出现了特征带 , 表明嫁接接合部愈伤组织细胞间
的相互作用导致了一定的遗传变异。
图 1　番茄同种自体嫁接 ( A)、番茄与茄子异种嫁接 ( B) 接合部的 RAPD分析
M: 标准分子量 ; T: 番茄 ; GU: 嫁接接合部 ; St: 砧木 (番茄 ) ; Sc: 接穗 (茄子 )。
F ig. 1　RAPD ana lysis of hom o2graft un ion of toma to ( A) and hetero2graft un ion of toma to and eggplan t ( B).
M: Molecular marker; T: Tomato; GU: Graft union; St: Stock ( tomato) ; Sc: Scion ( eggp lant) .
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