全 文 ：广 西 植 物 Guihaia Apr． 2015，35(2):239 － 243 http:/ / journal． gxzw． gxib． cn
DOI:10． 11931 /guihaia． gxzw201309005
荆赞革，裴徐梨，唐征，等． 青花菜 Ogu不育胞质分子鉴定和序列分析［J］． 广西植物，2015，35(2):239 －243
Jing ZG，Pei XL，Tang Z，et al． Molecular identification of Ogu cytoplasmic male sterile and sequence analysis in broccoli (Brassica oleracea var． italica)
［J］． Guihaia，2015，35(2):239 －243
青花菜 Ogu不育胞质分子鉴定和序列分析
荆赞革1，裴徐梨2，唐 征1* ，刘 庆1，张小玲1，罗天宽1，朱世杨1
(1． 浙南作物育种重点实验室，温州科技职业学院，浙江 温州 325006;2． 作物遗传与
种质创新国家重点实验室，南京农业大学 园艺学院，南京 210095 )
摘 要:雄性不育是农作物利用杂种优势、进行轮回选择和群体改良的重要手段，在农作物生产中具有巨大
的利用价值。该研究为了鉴定青花菜细胞质雄性不育材料的不育胞质类型，以期今后为青花菜种质资源的收
集、利用及分子标记辅助育种提供新的不育标记。根据 GenBank中 orf138 基因保守序列设计特异引物，对 20
个青花菜种质资源基因组 DNA进行 PCＲ扩增。结果表明:特异引物 P1 /P2在 12个青花菜雄性不育基因型中
均扩增出 392 bp的片段，在 8个可育基因型中未扩增出条带，与田间育性鉴定结果相符。获得青花菜 Ogu胞
质雄性不育的特异基因 orf138序列，GenBank中的登录号为 HQ149728;用 Blastn在 GenBank中进行同源性比
对分析，发现 12 个不育材料的特异片段与已报道的萝卜 Ogu CMS所具有的 Ogu orf138基因(Genbank登录号:
Z18896． 1)同源度高达 100%。序列同源比对发现 orf138基因存在变异位点。研究结果可为青花菜雄性不育
细胞质的分子鉴定、进一步阐明胞质雄性不育败育机理，以及指导青花菜新型不育系的创建和杂种优势高效
利用提供理论依据。
关键词:青花菜;细胞质雄性不育;分子鉴定;序列分析
中图分类号:Q943． 1;S65 文献标识码:A 文章编号:1000-3142(2015)02-0239-05
Molecular identification of Ogu cytoplasmic male
sterile and sequence analysis in broccoli
(Brassica oleracea var． italica)
JING Zan-Ge1，PEI Xu-Li2，TANG Zheng1* ，LIU Qing1，
ZHANG Xiao-Ling1，LUO Tian-Kuan1，ZHU Shi-Yang1
(1． Zhenan Key Laboratory of Crop Breeding，Wenzhou Vocational College of Science and Technology，
Wenzhou 325006，China;2． State Key Laboratory of Crop Genetics and Germplasm
Enhancement，Nanjing Agricultural University，Nanjing 210059，China )
Abstract:Cytoplasmic male sterility (CMS)is an important tool forheterosis utilization，recurrent selection and popula-
tion improvement in crops，and has great utility value in crop production． In order to identify the cytoplasmic male sterile
(CMS)types and obtain the sterility-related sequences in broccoli(Brassica oleracea var． italica)，to provide a new Ogu
marker and reference for broccoli germplasm collection，utilization and molecular marker assisting selection，specific
primers P1 /P2 were designed to amplify twenty broccoli germplasm genomic DNA according to the conserved sequences
of orf138 gene． A 392 bp specific fragment was detected in twelve infertile broccoli genotypes by PCＲ amplification，
收稿日期:2014-02-16 修回日期:2014-05-09
基金项目:浙江省自然科学基金(LY12C15009);浙江省农业新品种选育重大科技专项(2012C12903-3-3);浙江省重大科技项目(2010C12004);
温州科技局项目(N20090016)。
作者简介:荆赞革(1983-)，男，河南人，硕士，助理研究员，研究方向为蔬菜遗传育种与生物技术，(E-mail)jingzange@ aliyun． com。
* 通讯作者:唐征，副教授，主要从事蔬菜遗传育种与生物技术，(E-mail)tzeng05@ 163． com。
eight fertile genotypes with no band，harmonized with morphology in field． The sequencing and comparison showed the
sequence (Genbank accession code:HQ149728)as high as 100% homologous to the reported orf138(Genbank accession
code:Z18896． 1)in radish． Sequence homology comparison detected orf138 gene contained some variation sites． In this
study，the molecular identification of broccoli CMS，was helpful to further elucidate the mechanism of CMS abortion，to
guide creation new CMS lines，and to provide a theoretical basis for heterosis efficient utilization．
Key words:broccoli;CMS;molecular identification;sequence analysis
十字花科有较强的杂种优势，生产上应用的品
种大多是一代杂种。由于采用人工剥蕾杂交和利用
自交不亲和性生产一代杂种种子，存在成本高，种子
质量不稳定等缺点，为此国内外蔬菜育种工作者都
在积极开展雄性不育材料的研究。我国自 70 年代
就开始进行十字花科蔬菜雄性不育系的选育研究，
主要是对大白菜(施展等，2012)、萝卜(陈黎明等，
2009)、甘蓝(陈烨丽等，2009)等不育系进行了深入
研究，已配制出很多强优势组合在生产上进行大面
积推广，很好地推动了蔬菜产业的发展。
植物细胞质雄性不育具有转育方便、不育性易
于保持等优点，在杂种优势利用中应用广泛。目前
已发现和培育出多种细胞质雄性不育类型(王巍敏
等，2008)。传统的恢保关系基于不育表型性状为
判定依据来判断是否为不育胞质，鉴定周期长，劳工
劳力，且不育类型难以明确，具有一定的局限性，一
定程度上限制了不育系的应用。利用分子标记技术
进行不育胞质类型鉴定省时省力且快速准确，可以
快速准确地鉴定不育类型(程计华，2007)。细胞质
雄性不育的不育基因主要分布在线粒体基因组中，
前人已开展了大量工作对细胞质雄性不育基因进行
了鉴定，如在十字花科蔬菜作物大白菜(张德双等，
2007)、不结球白菜(陈龙正等，2010)、菜薹(周国
林，2011)和花椰菜(王春国等，2006)、甘蓝(李建斌
等，2009)等已有利用各种分子标记技术研究细胞
质雄性不育基因的报道，但在青花菜上的研究却相
对较少(朱玉英等，2006)。本研究采用 Ogu 不育胞
质特异引物对青花菜细胞质雄性不育材料进行分子
鉴定，对于明确不育类型，阐明胞质雄性不育败育机
理、指导青花菜新型不育系的创建和杂种优势高效
利用提供一定的理论依据。
1 材料与方法
1． 1 供试材料和育性鉴定
以本研究所保存的 20 份青花菜种质资源为材
料，种植于温州科技职业学院试验田，常规田间管理。
每个材料选用 10个盛花期单株，选择初开放的花，进
行育性鉴定。供试材料编号及相关信息见表 1。
表 1 供试所用青花菜种质资源
Table 1 Broccoli Brassica oleracea var． italica
accessions used in this study
编号
Code
名称
Accession
熟性 (d)
Maturity
来源
Origin
育性
Fertility
1 哈木Hamu 65 ～ 70
日本
Japan
可育
Fertility
2 绿玉Lüyu 90
中国
China
不育
Infertility
3
美秀 F1
Meixiu F1
65 台湾Taiwan
不育
Infertility
4 绿玉Lüyu 80
中国
China
可育
Fertility
5 皇冠Huaguan 80
中国
China
可育
Fertility
6 蒙特绿Mantuolü 60
荷兰
Holland
可育
Fertility
7 珠绿Zhulü 60
日本
Japan
可育
Fertility
8 玉冠Yuguan 65
日本
Japan
可育
Fertility
9 蒙特瑞Mengterui 50
荷兰
Holland
可育
Fertility
10 优秀Youxiu 90 ～ 95
日本
Japan
不育
Infertility
11 竞秀Jingxiu 90 ～ 95
韩国
Korea
不育
Infertility
12
美好 F1
Meihao F1
65 ～ 70 台湾Taiwan
不育
Infertility
13
绿珍 F1
Lüzhen F1
80 台湾Taiwan
不育
Infertility
14 绿贝Lübei 70
墨西哥
Mexico
不育
Infertility
15 奇丽Qili 85 ～ 90
中国
China
可育
Fertility
16 绿鑫Lüxin 70 ～ 75
日本
Japan
不育
Infertility
17 高拱王Gaogongwang 85 ～ 90
日本
Japan
不育
Infertility
18 蓝带Landai 60
日本
Japan
不育
Infertility
19 玉皇Yuhuang 68
日本
Japan
可育
Fertility
20 蓝帝Landi 90 ～ 95
日本
Japan
不育
Infertility
1． 2 基因组 DNA提取
以青花菜幼嫩叶片为材料，采用改良 CTAB法
232 广 西 植 物 35 卷
图 1 特异引物 P1 /P2扩增结果 1-20 同表 1;L． DL2000 分子标记。
Fig． 1 Electrophoresis profile of PCＲ products with P1 /P2 primer combination
1-20 correspond to the code in Table 1;L． DL2000 marker．
提取基因组 DNA(荆赞革等，2010)，1． 0%琼脂糖凝
胶电泳检测提取质量后，稀释成浓度为 20 ng·μL-1
的工作液，低温冰箱保存备用。
1． 3 特异引物设计
根据萝卜 Ogura 细胞质雄性不育相关的 orfl38
基因开放阅读框保守区序列，使用 Primer 3． 0 软件
设计特异引物 P1 (5-TTGTCCACTTTTTGTCATA-
ATCTCA-3)和 P2(5-TTTCTCGGT CCATTTTCCAC-
3)。引物由上海华大基因有限公司合成。
1． 4 特异引物 PCＲ扩增和电泳检测
采用特异引物 P1 /P2，对所选材料进行 PCＲ 扩
增。PCＲ反应体系为 16 μL，含样品基因组 DNA15
～ 20 ng，引物各 0． 4 μmol·L-1，dNTPs 0． 2 mmol·
L-1，Mg2 + 1． 5 mmol·L-1，Taq 聚合酶0． 65 U。反应
程序为 94 ℃预变性 5 min，94 ℃ 40 s、56 ℃ 50 s、72
℃ 60 s，35 个循环，72 ℃延伸 10 min，10 ℃保存。
电泳检测:PCＲ反应液混入 1 /4 体积 2%溴酚蓝，进
行琼脂糖凝胶电泳，EB 染色，凝胶成像仪上进行观
察并拍照分析。
1． 5 特异条带回收并测序
目的片段回收按照宝生物工程(大连)有限公
司的 Agarose Gel DNA Purification Kit Ver． 2． 0 试剂
盒的使用说明进行。回收产物纯化后，进行 TA 克
隆。DNA测序由上海华大基因有限公司完成。
1． 6 序列生物信息学分析
采用 DNASTAＲ 软件对特异 DNA 片段片段的
测序结果进行分析。同源性比对使用 BLASTn(ht-
tp:/ /www． ncbi． nlm． nih． Gov /blast)程序进行。使
用 DNAMAN 对数据库中部分 orf138 基因序列进行
相似性分析。
2 结果与分析
2． 1 特异引物 PCＲ扩增
特异引物 P1 /P2 对 20 份青花菜种质资源进行
扩增(图 1)。从图 1 可以看出，orf138 特异引物
PCＲ扩增产物在供试材料间存在差异。优秀、竞秀
等 11 份不育种质中可扩增出 392 bp 左右的条带，
且大小相同;而其余 9 份可育材料中无扩增产物。
分子检测结果于田间育性鉴定结果相符。
2． 2 序列分析
使用 DNASTAＲ软件对回收片段的测序结果进
行分析，结果显示特异片段的核苷酸序列长度均为
392 bp(图 2)。该序列中 A、T、C 和 G 的数目分别
为 156 个、94 个、47 个和 95 个，A + T = 63． 78%，G
+ C = 36． 22%。该序列已提交 Genbank，登录号
为 HQ149728。
测序结果在 NCBI 中使用 Blastn 在线程序进行
同源性比对，结果表明与萝卜 Ogu orf138 基因同源
性高达 100%，E值为 0(图 2)。与青花菜 Ogura 细
胞质雄性不育系线粒体基因同源性达到 99%(登录
号:EU604643)。扩增结果与田间育性鉴定结果完
全一致，表明在本试验中 12 个青花菜不育材料均采
用了 Ogu胞质为不育源。
采用 DNAMAN 软件与 NCBI 数据库中登陆的
部分萝卜 orf138 基因氨基酸序列进行相似比较，发
现所选序列间存在差异，共检测到 5 个氨基酸突
3322 期 荆赞革等:青花菜 Ogu不育胞质分子鉴定和序列分析
图 2 青花菜、萝卜 orf138基因核苷酸序列同源性比较 (Genbank 登录号:Z18896． 1)
Fig． 2 Homologous comparison on sequence of orf138 gene nucleotide in brocco1i and radish (Genbank accession code:Z18896． 1)
变位点和 1 个 13 个氨基酸长度的缺失(图 3)。
3 讨论与结论
细胞质雄性不育广泛存在于高等植物中，由线
粒体 DNA的变异，如线粒体 DNA 重组而改变表达
模式以及不充分的或偏离的 ＲNA 编辑等，引起不
育。目前已鉴定和分离出一些与 CMS 相关的线粒
体基因，如 Ogu CMS 的 orf138 基因、Pol CMS 的
orf224 基因、Nap CMS 的 orf222 基因以及芥菜 CMS
的 orf220 基因等。
Ogura 不育是由线粒体基因 orf138 引起的
(Krishnasamy et al．，1993;Yamagishi et al．，2001)，
该基因编码一个约 16 kD的线粒体膜蛋白。在核恢
复基因存在时，恢复基因对其进行调控，恢复育性
(Grelon et al．，1994)。十字花科线粒体基因变异水
平较低(Hiesel et al．，1994)，orf138 编码区在线粒体
中是比较保守的区域，本试验测序结果表明 11 份
Ogura胞质材料在基因编码区未存在差异。同 NC-
BI数据库已登录的基因序列进行比对，发现编码区
碱基存在突变，且这些变异没有改变雄性不育的表
型性状。通过点突变，改变不育基因和蛋白序列，进
一步研究其关键作用位点。
青花菜 CMS主要是由原生质体融合(Yarrow et
al．，1990)或远缘杂交获得。将 Ogu 胞质转育到青
花菜中，得到 Ogu 细胞质雄性不育系，且易于转育
成不同熟性、不同品质的不育系，成为目前应用最为
广泛的青花菜不育源，在优势育种上应用广泛。
本研究针对 orf138 基因设计特异引物，对青花
菜不育类型进行鉴定，结果显示所选用的不育材料
均选用了 Ogu 不育胞质。研究成果为鉴定青花菜
Ogu不育胞质提供了简便、快速、可信的方法，利用
分子标记辅助育种技术加速雄性不育系的选育，有
助于我国青花菜杂交优势育种的发展。
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图 3 青花菜、萝卜 orf138基因氨基酸序列同源性比较
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Characterization of the Chinese cabbage hau cytoplasmic male-
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白菜 hau胞质雄性不育系的鉴定及不育相关基因结构分析)
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