全 文 ：园 　艺 　学 　报 　2007, 34 (3) : 591 - 596
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2006 - 11 - 16; 修回日期 : 2007 - 04 - 28
基金项目 : 辽宁省高等学校优秀人才支持计划项目 (RC204207)3 通讯作者 Author for correspondence ( E2mail: zhangz@ syau1edu1cn)
利用 RAPD和 SCAR标记鉴定草莓品种
王志刚 1, 2 , 张志宏 13 , 李　贺 1 , 高秀岩 1 , 杜国栋 1 , 谭昌华 1
(1 沈阳农业大学园艺学院 , 沈阳 110161; 2 辽宁省农业科学院花卉研究所 , 沈阳 110161)
摘 　要 : 利用 RAPD和 SCAR标记对 32份草莓材料进行了鉴定 , 结果表明 : 8个 RAPD引物共扩增出
85个标记 , 其中 71个为多态性标记 , 多态性比率为 8315%。25份草莓材料的 RAPD图谱差异较大 , 易于
区分。利用具有多态性的 RAPD标记 , 对 28份草莓试材的亲缘关系进行分析 , 初步鉴定出同名异物和同物
异名品种。两个 RAPD标记被转化为片段长度分别为 378 bp和 214 bp的显性 SCAR标记 , 其多态性与相应
RAPD标记一致。利用这两个 SCAR标记对草莓品种进行了初步鉴定。
关键词 : 草莓 ; 品种鉴定 ; RAPD; SCAR
中图分类号 : S 66814　　文献标识码 : A　　文章编号 : 05132353X (2007) 0320591206
Iden tif ica tion of Strawberry Cultivars by RAPD and SCAR M arkers
WANG Zhi2gang1, 2 , ZHANG Zhi2hong13 , L I He1 , GAO Xiu2yan1 , DU Guo2dong1 , and TAN Chang2hua1
( 1 College of Horticu lture, Shenyang A gricu ltura l U niversity, Shenyang 110161, China; 2 Institu te of F loriculture, L iaoning A cad2
em y of A gricu ltura l Sciences, Shenyang 110161, Ch ina)
Abstract: Thirty2two strawberry cultivars were tested by random ly amp lified polymorphic DNA (RAPD )
and sequence characterized amp lified region ( SCAR) markers. Results showed that 8 RAPD p rimers p roduced
85 bands, and 71 of them (8315% ) were polymorphic bands. Among the 32 strawberry materials, 25 materi2
als were easy to be distinguished by RAPD markers. The relationship of 28 materials was analyzed with RAPD
markers, and the synonym s and homonym s cultivars were screened p rimarily. Two dom inant SCAR markers
W S01 and W S02 with the length of 378 bp and 214 bp respectively were developed from RAPD markers and
showed the same p rofiles as the corresponding RAPD markers. This study laid a sound foundation for the iden2
tification of strawberry cultivar at molecular level.
Key words: Strawberry; Cultivar identification; RAPD; SCAR
近年来草莓栽培品种数量增加 , 同物异名和同名异物现象增多。这对草莓栽培品种鉴定提出了更
高的要求。以前主要是利用形态标记鉴定草莓品种 (Dale, 1996)。20世纪 90年代发展起来的分子标
记比形态标记具有多方面的优越性 , 已有涉及草莓品种专利权的案件开始采用随机扩增多态性 DNA
( random ly amp lified polymorphic DNA , RAPD ) 标记的结果作为证据 (Congiu et al. , 2000)。国内最近
的报道是将其应用于种间杂种的检测 (马鸿翔 等 , 2005)。通过 RAPD标记鉴定草莓栽培品种能够
获得与系谱信息较为一致的遗传相似性 (Hancock & Callow, 1994; Graham, et al. , 1996)。但也有研
究认为 RAPD标记对实验条件敏感 , 可重复性较差 (MacPherson et al. , 1993; Jones et al. , 1997)。为
了得到更稳定的试验结果 , 简单重复序列 ( simp le sequence repeat, SSR) ( Szwec et al. , 1996)、扩增
片段长度多态性 ( amp lified fragment length polymorphism, AFLP) (M iros⁄aw et al. , 2002)、简单重复间
序列 ( inter2simp le sequence repeat, ISSR ) (A rnau et al. , 2003) 及酶切的扩增多态性序列 ( cleaved
园 　　艺 　　学 　　报 34卷
amp lified polymorphic sequence, CAPS) 等 ( Kunihisa et al. , 2003) 分子标记也陆续在草莓栽培品种鉴
定中应用。衍生于 RAPD标记的特征序列扩增区域 ( sequence characterized amp lified region, SCAR) 标
记采用一对特异长引物和严格的 PCR条件 , 可重复性好 (Paran & M ichelmore, 1993) , 在草莓基因定位
和分子标记辅助育种中已有应用 (A lbani et al. , 2004) , 但未见应用于草莓栽培品种鉴定的报道。
本研究对草莓 RAPD反应体系进行了优化 , 在此基础上 , 对一些草莓品种进行 RAPD鉴定 , 并将
部分 RAPD标记转化成 SCAR标记 , 以期为草莓栽培品种的分子鉴定奠定基础。
1　材料与方法
111　植物材料及 D NA提取
共选择 32份草莓 ( F ragria ×ananassa Duch. ) 品种为试材 , 27份有确切记载 , 来自沈阳农业大
学草莓资源圃 , 其名称和编号分别为 : 1号全明星、4号新明星、5号卡玛罗莎、6号童子一号、7号
弗杰尼亚、8号图得拉、9号早明亮、10号卢比、11号丰香、12号幸香、13号枥乙女、14号红脸
颊、16号宝交早生、17号春香、18号北辉、19号图腾、20号森嘎拉、21号哈尼、22号星都一号、
23号绿色种子、24号明磊、25号布兰登堡、26号爱莓、27号高斯克、28号芳玉、31号卡尔特一号
和 32号爱尔桑塔。其余 5份为取自其它地点的种苗 , 包括 : 取自山东的 29号和 30号丰香、取自沈
阳市于洪区高花镇和新民市法哈牛镇的 2号和 3号全明星和取自开原市三家子乡的 15号日本 99号。
DNA提取采用改进 CTAB法 (肖敏 等 , 2005)。从 011 g草莓幼叶提取的总 DNA溶解于 30μL
超纯水中备用。
112　RAPD分析
20μL反应体积中包括 015μL DNA, 1 ×PCR反应缓冲液 , 210 mmol·L - 1MgCl2 , 012 mmol·L - 1
dNTP (上海 Sangon公司 ) , 013μmol·L - 1引物和 1 U Taq DNA聚合酶 ( Promega公司 )。PCR反应在
EppendorfMastercycler Gradient基因扩增仪上进行。RAPD 引物序列参照 Operon公司、W ako公司及
Zhang等 (2003) 的方法 , 由大连 TaKaRa公司合成。反应程序 : 94℃预变性 30 s; 94℃变性 30 s, 40℃
退火 2 m in, 72℃延伸 3 m in, 45个循环 ; 最后 72℃延伸 7 m in。115%琼脂糖凝胶电泳检测 PCR反应产
物。对电泳条带进行统计 , 转换成 0、1矩阵 , 采用 UPGMA法 , 在 DPS统计分析软件中进行聚类分析。
113　RAPD标记转化为 SCAR标记
利用 Agarose Gel DNA Purification Kit ( TaKaRa公司 ) 对选取的 RAPD 谱带进行回收 , 然后与
pGEM 2T Easy载体 ( Promega公司 ) 连接并转化大肠杆菌 JM109。利用蓝白斑反应筛选阳性克隆。将
提取的带插入片段的质粒送上海生工生物工程公司测序。根据 RAPD标记序列 , 采用 Primer Prem ier
510软件设计 SCAR引物 , 估算适宜的退火温度及产物长度。
PCR反应体积为 20μL, 包括 015μL DNA模板 , 1 ×PCR反应缓冲液 , 210 mmol·L - 1 MgCl2 ,
012 mmol·L - 1 dNTP (上海 Sangon公司 ) , 正向和反向引物各 013μmol·L - 1和 1 U Taq DNA聚合酶
( Promega公司 )。反应程序为 : 95℃预变性 3 m in; 94℃变性 30 s, 每对引物在各自退火温度下退火 1
m in, 72℃延伸 2 m in, 35个循环 ; 72℃延伸 5 m in。115%琼脂糖凝胶电泳检测 PCR反应产物。
2　结果与分析
211　RAPD标记鉴定草莓栽培品种
从 48个 10～12碱基的 RAPD引物中筛选出了 8个扩增位点多、多态性和重复性好的引物。在 32
份草莓试材上 , 8个引物共扩增出 85个 RAPD标记 , 其中 71个为多态性标记 , 多态性比率为 8315%
(表 1)。
295
　3期 王志刚等 : 利用 RAPD和 SCAR标记鉴定草莓品种 　
表 1　RAPD引物在草莓品种上的扩增情况
Table 1　Results of RAPD ana lysis of strawberry cultivars w ith 8 pr im ers
引物
Primer
序列
Sequences(5′→3′)
扩增带数
Number of amp lification bands
多态性带数
Number of polymorphic bands
多态性带比率
Percentage of polymorphic bands ( % )
OPA204 AATCGGGCTG 11 8 7217
OPF202 GAGGATCCCT 13 8 6115
OPO204 AAGTCCGCTC 13 13 10010
WAA52 CTTGTCATGTGT 10 9 9010
WAE03 GTGAACGAAGAC 9 7 7718
WAE06 TCCCCTGAACGT 10 8 8010
RA1225 CAACAAAGACCT 10 10 10010
RA12280 CTCCCTAACCAT 9 8 8819
合计 Total 85 71 8315
32份供试草莓材料中 27份材料的电泳图谱差异较大 , 易于区分。来自不同地点的 3份全明星材
料的谱带一致 , 新明星与全明星之间在一些弱带上有差异。卡玛罗莎和童子一号带型基本一致 , 只是
在用引物 WAE06扩增的产物中有两条明显不同的带。红脸颊和日本 99号的带型基本一致 , 只有一些
难以辨认的弱带有差异。3份丰香试材的谱带存在明显差异 , 引物 RA1225、OPO204和 WAA52都可
以将其区分开。
212　草莓品种的聚类分析
对除 2号、3号全明星和 29号、30号丰香以外 28个草莓品种的 RAPD标记进行聚类分析。结果
表明 , 全明星和新明星、卡玛罗莎和童子一号、红脸颊和日本 99号等 3对品种遗传距离都在 0116以
下 , 其中全明星和新明星遗传距离最近 (图 1)。
图 1　草莓品种 RAPD标记聚类分析树状图
F ig. 1　D endrogram of cluster ana lysis on RAPD markers in strawberry cultivars
213　草莓品种的 SCAR标记分析
对 18个多态性好、亮度高的 RAPD标记的电泳谱带进行回收、克隆和测序 , 获得了 5个 RAPD
标记的核酸序列 , 分别是 WAE032588, WAE062325, OPO2042454, WAA522315, WAE062626 (表 2)。
395
园 　　艺 　　学 　　报 34卷
表 2　根据 RAPD标记序列设计的草莓 SCAR引物
Table 2　SCAR prim ers for strawberr ies designed accord ing to the sequences of RAPD markers
SCAR引物对
SCAR p rimer
paris
序列
Sequences (5′→3′)
对应的 RAPD标记
Corresponding
RAPD markers
退火温度
Annealing
temperature (℃)
SCAR标记长度
Size of expected
p roduct ( bp)
4A /4S CTCAAGAGTTTATCCGATGTG WAE032588 5211 490
CTCAAAGACTTTCGAGGAGG
25A /25S ATGTCGGTTTCCTTGTCG WAE062325 5214 252
GGAGGCTTACCAGGTGTTT
29A /29S CCCCGTCTCACTCCTCTT OPO2042454 5115 378
CAATACCATGGGCGAGAA
32A /32S ACTAACTGTCACCGAATG WAA522315 4316 214
CTGGGATTTAGATAACAAG
3621A /3621S TTCTGGTCAGGCCATCTTT WAE062626 5211 318
GGTTTGCGGTAGGTGTAGTAAC
3622A /3622S GGTCAGGCCATCTTTTACTT WAE062626 5312 563
AAGGCCGCATAGGCTTCG
设计了 6对 SCAR引物 , 结果 25A /25S、29A /29S和 32A /32S扩增出预期大小的片段。其中后二
者得到了特异性非常好的 SCAR谱带 , 长度分别为 378 bp和 214 bp , 其多态性与相应 RAPD标记多态
性一致 , 可以用于草莓品种鉴定 (图 2, 图 3) , 将其分别命名为 W S01和 W S02。
根据 W S01和 W S02的显 ( + ) 隐 ( - ) 情况可以将 32份草莓试材分为 4组 : 春香、明磊和布
兰登堡为 W S01 +W S02 + ; 3份全明星、新明星、早明亮、丰香、幸香、宝交、图腾、星都一号和芳
玉为 W S01 +W S02 - ; 卢比、哈尼、绿色种子、高斯克和爱尔桑塔为 W S01 - W S02 + ; 卡玛罗莎、童
子一号、弗杰尼亚、图得拉、枥乙女、红脸颊、日本 99号、北辉、森嘎拉、爱莓、两份山东丰香和
卡尔特一号为 W S01 - W S02 - 。
图 2　W S01 SCAR标记
M: DNA marker; 泳道 1～32分别为 32份草莓试材的 PCR反应结果。
F ig. 2　W S01 SCAR marker
M: DNA marker; Lane 1 - 32 indicate the results of PCR reactions carried out on the 32 strawberry materials, respectively.
495
　3期 王志刚等 : 利用 RAPD和 SCAR标记鉴定草莓品种 　
图 3　W S02 SCAR标记
M: DNA marker; 泳道 1～32分别为 32份草莓试材的 PCR反应结果。
F ig. 3　W S02 SCAR marker
M: DNA marker; Lane 1 - 32 indicate the results of PCR reactions carried out on the 32 strawberry materials, respectively.
3　讨论
311　RAPD标记的可重复性及鉴定草莓品种的可行性
RAPD标记的可重复性一直倍受争议。针对 RAPD标记对反应条件敏感等特点 , 采用标准的试剂
和反应程序可以解决这一问题 (Rothuizen & van WoHeren, 1994) , 实践证明在同一实验室采用相同
的反应流程可以得到很好的重复 (汪小全 等 , 1996)。而不同的实验室之间还要在描述实验条件和
结果时注意标准化 , 以便比较 (Lowe et al. , 1996)。本研究中 , 分别在 Eppendorf公司的 Mastercycler
Gradient和 TECHNE公司的 TC2512基因扩增仪上进行重复扩增 , 结果中等以上亮度的谱带重复性很
好 , 弱带和大于 2 000 bp的谱带重复性不好 (数据未列出 )。另外有学者提出将包括形态学标记在内
的几种不同标记相结合能够比单独应用一种标记提供更准确的结果 ( Schut et al. , 1997)。本研究结
合 RAPD标记聚类分析和形态学调查的结果 , 初步认为卡玛罗莎和童子一号 , 红脸颊和日本 99号两
对品种可能是同物异名的品种 , 而来自山东的两份丰香材料可能是混杂的品种 , 与丰香为同名异物。
新明星是全明星的芽变品种 , 人们通常认为芽变是点突变 , 遗传差异很小 , 不易检测 , 但已有证据表
明一些果树的芽变品种是由于转座元件插入基因位点后形成的 ( Kobayashi et al. , 2004) , 可能是多位
点突变 , 相对单位点突变较易于检测。
312　草莓 RAPD标记转化为 SCAR标记的策略
与前人将 SCAR标记用于草莓特定基因的定位和分子标记辅助育种不同 , 本研究是将 SCAR标记
用于草莓品种鉴定 , 因而采取了新的筛选策略。如果在 RAPD鉴定中供试的品种很全 , 就有可能产生
可信的单个品种特异的 RAPD标记 , 可以选择这样的标记转化成 SCAR标记 , 这对于需要确定某一植
株是否为某一特定品种非常有用。如果供试品种不多或者需要同时进行多个品种的鉴定 , 可以选择在
一组品种内特异的 RAPD标记进行转化 , 利用多个 SCAR标记的组合和多重 PCR技术鉴定品种。本
研究选择了后一种策略 , 对 18个 RAPD标记进行了 SCAR转化 , 最后得到了两个特异性非常好的
595
园 　　艺 　　学 　　报 34卷
SCAR标记 , 其多态性与相应 RAPD标记多态性一致。但是 , 对于众多的草莓品种而言 , 两个 SCAR
标记是远远不够的 , 因此有待于在今后的工作中开发出更多 SCAR标记。
References
A lbaniM C, Battey N H, W ilkinson M J. 2004. The development of ISSR2derived SCAR markers around the seasonal flowering locus ( SFL) in
F ragaria vesca. Theoretical and App lied Genetics, 109 (3) : 571 - 579.
A rnau G, lallemand J, BourgoinM. 2003. Fast and reliable strawberry cultivar identification using inter simp le sequence repeat ( ISSR) amp lifica2
tion. Euphytica, 129 (1) : 69 - 79.
Congiu L, Chicca M, Cella R. 2000. The use of random amp lified polymorphic DNA (RAPD) markers to identify strawberry varieties: a forensic
app lication. Molecular Ecology, 9 (2) : 229 - 232.
Dale A. 1996. A key and vegetative descrip tion of thirty2two common strawberry varieties grown in North America. Advances in Strawberry Re2
search, 15 (1) : 1 - 12.
Graham J, McN icol R J, McN icol J W. 1996. A comparison of methods for the estimation of genetic diversity in strawberry cultivars. Theoretical
and App lied Genetics, 93 (3) : 402 - 406.
Hancock J F, Callow P A. 1994. Random ly amp lified polymorphic DNA s in the cultivated strawberry, F ragaria ananassa. Journal of the American
Society for Horticultural Science, 119 (4) : 862 - 864.
Jones C J, Edwards K J, Castaglione S, W infield M O, Sala F, van de W iel C, B redemeijer G, Vosman B, MatthesM, Daly A, B rettschneider R,
Bettini P, BuiattiM, Maestri E, Malcevschi A, Marmiroli N, Aert R, Volckaert G, Rueda J, L inacero R, Vazquez A, Karp A. 1997. Repro2
ducibility testing of RAPD, AFLP and SSR markers in p lants by a network of European laboratories. Molecular B reeding, 3 (5) : 381 - 390.
Kobayashi S, Goto2Yamamoto N, H irochika H. 2004. Retrotransposon2induced mutations in grape skin color. Science, 304 (5673) : 982.
Kunihisa M, Fukino N, Matsumoto S. 2003. Development of cleavage amp lified polymorphic sequence (CAPS) markers for identification of straw2
berry cultivars. Euphytica, 134 (2) : 209 - 215.
Lowe A J, Hanotte O, Guarino L. 1996. Standardization of molecular genetic techniques for the characterization of germp lasm collections: the case
of random amp lified polymorphic DNA (RAPD). Plant Genet Resource News, 107 (1) : 50 - 54.
Ma Hong2xiang, Chen Pei2du, Yu Gui2hong, Ren L i2juan. 2005. GISH and RAPD detecting the interspecific hybrids from the cross of F ragaria
nilgerrensis Schlecht. ×F. ananassa Duch. Journal of Plant Genetic Resources, 6 (3) : 256 - 261. ( in Chinese)
马鸿翔 , 陈佩度 , 余桂红 , 任丽娟. 2005. 利用 GISH和 RAPD检测黄毛草莓 ×凤梨草莓种间杂种. 植物遗传资源学报 , 6 (3) : 256 - 261.
MacPherson J M, Eckstein P E, Scoles G J, Gajadhar A. 1993. Variability of the random amp lified polymorphic DNA assay among thermal cy2
clers, and effects of p rimer and DNA concentration. Molecular and Cellular Probes, 7 (2) : 289 - 293.
M iros⁄aw T, Piotr D, Jerzy A. 2002. Simp lified AFLP p rocedure as a tool for identification of strawberry cultivars and advanced breeding lines.
Euphytica, 125 (2) : 273 - 280.
Paran I, M ichelmore R W. 1993. Development of reliable PCR2based markers linked to downy m ildew resistance genes in lecture. Theoretical and
App lied Genetics, 85 (8) : 985 - 993.
Rothuizen J, van Wolferen M. 1994. Random ly amp lified DNA polymorphism s in dogs are rep roduceible and disp layMendelian transm ission. Ani2
mal Genetics, 25 (1) : 13 - 18.
Schut J W , Q i X, Stam P. 1997. A ssociation between relationship measures based on AFLP markers, pedigree data and morphologyical traits in
barley. Theoretical and App lied Genetics, 95 (7) : 1161 - 1168.
Szewc M F, Kresvich A S, B liek SM. 1996. Identification of polymorphic, conserved simp le sequence repeats ( SSR s) in cultivated B rassica spe2
cies. Theoretical and App lied Genetics, 93 (4) : 534 - 538.
W ang Xiao2quan, Zou Yu2p ing, Zhang Da2m ing, Zhang Zhi2xian, Hong De2yuan. 1996. Problem s in the use of RAPD to the study of genetics di2
versity and systematics. Acta Botanica Sinica, 38 (12) : 954 - 962. ( in Chinese)
汪小全 , 邹喻苹 , 张大明 , 张志宪 , 洪德元. 1996. RAPD应用于遗传多样性和系统学研究中的问题. 植物学报 , 38 (12) : 954 - 962.
Xiao M in, Zhang Zhi2hong, Dai Hong2yan, Yang Hong2yi, L i He. 2005. Enhancing the stability of detection of strawberry vein banding virus by
PCR. Journal of Fruit Science, 22 (5) : 483 - 487. ( in Chinese)
肖　敏 , 张志宏 , 代红艳 , 杨洪一 , 李　贺. 2005. PCR检测草莓镶脉病毒的稳定性研究. 果树学报 , 22 (5) : 483 - 487.
Zhang Z, Fukino N, Mochizuki T, Matsumoto S. 2003. Single2copy RAPD marker loci undetectable in octop loid strawberry. Journal of Horticul2
tural Science & B iotechnology, 78 (5) : 689 - 694.
695