全 文 :园 艺 学 报 2006, 33 (4) : 725~730
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2005 - 08 - 24; 修回日期 : 2006 - 01 - 18
基金项目 : 国家自然科学基金资助项目 (30260068)3 通讯作者 Author for correspondence ( E2mail: huyouli@pub1guangzhou1gd1cn)
果主要品种遗传多态性的 AFL P标记研究
雷新涛 1 王家保 2 徐雪荣 1 林顺权 33
(1 中国热带农业科学院南亚热带作物研究所 , 广东湛江 524091; 2 中国热带农业科学院热带生物技术研究所 , 海南海
口 571101; 3 华南农业大学园艺生物技术研究所 , 广东广州 510640)
摘 要 : 采用扩增片段长度多态性 AFLP标记对国内外 31个 果主要品种进行分类与亲缘关系研究。
结果表明 : 筛选出的 14对引物组合在 31份 果种质中共扩增出了 1 761条带 , 其中多态性带的比例为
97%。平均每对引物产生 12518条带和 12116条多态性带 , 总的多态性带率为 97% ; 基于 AFLP标记 , 以
0148的相似系数为阈值 , 所有供试 果材料被分为 7大组群 , 第一组群内以 0152为阈值 , 又可分为 6组。
与形态标记相比 , 基于 AFLP标记的 果分类体系更能反映 果品种间的亲缘关系。
关键词 : 果 ; 遗传多态性 ; AFLP
中图分类号 : S 66717 文献标识码 : A 文章编号 : 05132353X (2006) 0420725206
Studies on Genetic Polymorphism of Ma in Mango Cultivars via AFLP Markers
Lei Xintao1 , W ang J iabao2 , Xu Xuerong1 , and L in Shunquan33
(1 Southern Subtropical Crops Research Institu te, Chinese A cadem y of Tropical Agriculture Sciences, Zhanjiang, Guangdong 524091,
China; 2 Institute of Tropical B ioscience, Chinese Academ y of Tropical Agriculture Sciences, Haikou, Hainan 571101, China;
3 Institute of B iotechnology in Horticultural P lants, South China Agriculture U niversity, Guangzhou, Guangdong 510640, China)
Abstract: In this article, the classification and the relationship s of 31 main domestic and overseas mango
(M angifera ind ica L inn. ) cultivars were investigated via amp lified fragments length polymorphism (AFLP)
markers. The results showed that the 142pair2p rimer combination screened totally amp lified 1 761 bands from
the samp led mango cultivars, and 97% of all bands were polymorphic. For each pair of p rimers, there were
12518 bands and 12116 polymorphic bands and the polymorphic bands rate was 97%. Based on the AFLP
markers, all the materialswere divided into 7 group swith the threshold of 0148 of sim ilarity coefficient. A t the
same time, the first group was divided into 6 subgroup s with the threshold of 0152 of sim ilarity coefficient.
Compared with morphologic markers, the mango classification system based on AFLP markers could reflect re2
lationship among mango cultivars more efficiently.
Key words: Mango; Genetic polymorphism; AFLP
果 (M ang ifera ind ica L inn. ) 具有丰富的遗传多样性〔1〕。我国引种 果约 1 300多年〔2〕, 目前
约有 200个 果品种或品系〔3, 4〕, 对其分类和鉴定是 果生产和研究中的重要课题。传统的分类方法
因易受环境影响 , 且界定标准难以统一 , 同物异名、同名异物现象普遍〔5〕。人们期望建立一套科学
的 果种质资源的鉴定与分类体系 , 以指导 果选育种工作和种质资源的开发利用。
近几年人们对分子标记应用于 果种质资源方面的研究开始了有益的探索。徐碧玉等采用 6个随
机引物对海南岛主栽的 10个 果品种进行 RAPD研究 , 检测出不同品种的 RAPD标记〔5〕。Karihaloo
等利用 RAPD标记研究了印度 果的遗传多态性〔6〕。Honsho等介绍了 SSR标记在泰国 果品种识别
上的应用〔7〕。房经贵等研究了 AFLP标记在两个 果亲本 ( Keitt ×Tommy) 间杂交一代群体的多态性
水平与分离方式〔8, 9〕, 并在 果遗传图谱构建方面作了有益的尝试〔10〕。Eiadthong等应用 AFLP分析了
园 艺 学 报 33卷
果属几个种间的遗传关系〔11〕。Chunwongse等利用 A lphonso和 Palmer两个品种杂交群体进行了分子
作图的研究〔12〕, Khalil等也利用几种分子标记作了品种识别和遗传图谱构建方面的工作〔13〕。但至今
尚未有 AFLP分子标记应用于 果 , 尤其是我国 果指纹图谱构建、分类、鉴定及亲缘关系研究方面
的深入报道。本研究利用 AFLP技术 , 以 14对引物对 31份 果种质资源基因组 DNA进行分析 , 旨在
从分子水平上认识 果种质资源的遗传多样性及其遗传关系 , 为资源收集保存和有效利用提供依据。
1 材料与方法
供试 31份品种全部来源于中国热带农业科学院南亚热带作物研究所 果种质圃 (表 1)。
表 1 供试品种主要性状
Table 1 The ma in character iza tion s of tested cultivars
序号
No.
品种名
Cultivar name
来源
O rigin
成熟果皮颜色
Peel color
胚性
Embryo
系谱
Parents
1 Banganapalli 印度 India 浅黄 Buff 单胚 Mono ?
2
台农 1号 Tainong 1
中国台湾
Taiwan, China
橙黄 O range2like yellow
单胚 Poly
品种园开放授粉实生选育 Seedlings
screening via Open pollination
3
桂热 10号 Guire 10
广西 Guangxi
黄 Yellow
多胚 Poly
黄象牙实生选育 Seedlings screening
from Yellow Ivory
4 Carabao 菲律宾 Philipp ines 金黄 Golden yellow 多胚 Poly 原始种 O riginal cultivar
5 Nan Klang W an 泰国 Thailand 金黄 Golden yellow 多胚 Poly ?
6 泰国 506 Thailand 506 泰国 Thailand 柠檬黄 Lemon2like yellow 多胚 Poly ?
7 紫花 Zhihua 广西 Guangxi 金黄 Golden yellow 单胚 Mono 母本为小青皮 Marther is Okrong
8
Keitt
佛罗里达 Florida
向阳面淡红 Sun2exposed
side is L ight red
单胚 Mono
印度 Mulgoba实生后代 Seedling of
Mulgoba
9 粤西 1号 Yuexi 1 广东 Guangdong 橙黄 O range2like yellow 单胚 Mono Carabao实生后代 Seedling of Carabao
10 斯里兰卡 811 Sri Lanka 811 斯里兰卡 Sri Lanka 黄绿 Yellow green 多胚 Poly ?
11
龙井大 Longjing Damang
海南 Hainan
柠檬黄 Lemon2like yellow
多胚 Poly
印度 后代 Seedling of Indian2de2
rived mango
12
红象牙 Red Ivory
广西 Guangxi
橙黄 O range2like yellow
单胚 Mono
象牙实生后代芽变 Bud mutation of
seedling from Ivory
13 小菲 Xiaofei 菲律宾 Philipp ines 金黄 Golden yellow 多胚 Poly 吕宋类品种 Var. like Carabao
14 泰国 504 Thailand 504 泰国 Thailand 黄 Yellow 多胚 Poly ?
15 Spooner 印度 India 黄 Yellow ? ?
16
R2E2
澳大利亚 Australia
向阳面桔红 Sun2exposed
side is red
多胚 Poly
Kent开放授粉后代 Seedling of Kent
via open pollination
17
串 Chuanmang
广西 Guangxi
黄 Yellow
多胚 Poly
象牙 22 (白象牙变异 ) 单株芽变
Bud mutation of Ivory 22
18 鹦鹉 Parrot mango 广西 Guangxi 柠檬黄 Lemon2like yellow 多胚 Poly ?
19 Irwin 佛罗里达 Florida 鲜红 Vermeil 单胚 Mono Lippens实生后代 Seedling of Lippens
20 金煌 Chun Hwang 中国台湾 Taiwan,China 橙黄 O range2like yellow 多胚 Poly 白象牙 ×Keitt W hite cross Keitt
21 Kent 佛罗里达 Florida 深红 Scarlet 单胚 Mono Brooks实生后代 Seedling of Brooks
22 海豹 Haibao 海南 Hainan 黄 Yellow 多胚 Poly 白象牙的实生变异 Seedling ofWhite
23 Haden 佛罗里达 Florida 绯红 B right red 单胚 Mono Mulgoba实生后代 Seedling ofMulgoba
24 Dashehari 印度 India 黄 Yellow 单胚 mono ?
25 秋 Neelum 印度 India 深黄 Deep ly Yellow 单胚 Mono Dashehari后代 Seedling of Dashehari
26 桂香 Guixiang 广西 Guangxi 黄绿 Yellow green 单胚 Mono 鹰嘴 ×秋 后代 Golck cross Neelum
27 Ono 缅甸 Burma 橙红 O range2like red 多胚 Poly ?
28
白象牙 W hite
泰国 Thailand
黄绿有淡红晕 Yellow green
covered with light red
单胚 Mono
?
29 Bambaroo 泰国 Thailand 黄带红晕 Yellow covered red 多胚 Poly ?
30 马切苏 Macheso 缅甸 Burma 金黄 Golden yellow 多胚 Poly ?
31
Zill
佛罗里达 Florida
向阳面深红 Sun2exposed
side is deep ly red
单胚 Mono
Haden实生后代
Seedling of Haden
注 : ? 号表示目前没有资料或有争议。
Note: ? indicated that we had not any related information at p resent or there were disputes on them.
627
4期 雷新涛等 : 果主要品种遗传多态性的 AFLP标记研究
DNA提取参照程运江等〔14〕的方法 , 并针对 果叶片富含多糖、酚类物质的特点加以改良。主要
改动如下 : 在 CTAB提取液中加入β - 巯基乙醇和蛋白酶 K, 首次沉淀 DNA之前氯仿异戊醇抽提两
次 , 沉淀后再用氯仿异戊醇抽提 1次 , 但不用酚氯仿异戊醇。
AFLP分析试剂盒购自北京鼎国生物技术有限责任公司 , 并按说明书进行。
根据分子量内标 , 用 Genescan311对胶图上的条带进行分子量计算 , 获得与条带一一对应的分子
量表文件 , 再用 B inthere软件将 Genescan311得到的分子量表文件转换成文本文件 , 再用 Excel将上
述文本文件转换成 0, 1矩阵表 , 其中有分子量 (有带 ) 的转换为 1, 没有分子量 (没有带 ) 的转换
为 0, 然后用 N tsys2111计算相似系数并绘制聚类图。
2 结果与分析
211 引物筛选和 AFL P扩增结果
用供试品种中的 2号台农 1号、4号 Carabao、
8号 Keitt、21号 Kent对 EcoR I和 M se I的 64对引
物组合进行筛选 , 筛选出其中带型完整、清晰、多
态性丰富的引物组合共 14对。利用筛选到的 14对
引物组合对 31份 果品种进行 AFLP扩增 , 结果
如表 2所示。不同引物组合扩增出的总带数和多态
性带数差异较大。14对引物组合在 31份 果种质
中共扩增出了 1 761条带 , 其中多态性带比率为
97% , 平均每对引物产生 12518条带和 12116条多
态性带。可见 , AFLP检测 果种质资源分子标记
多态性的效率很高。图 1显示了 E2ACC /M2CTC引
物组合对 31份 果品种 AFLP扩增的结果。
表 2 14对引物组合的扩增结果
Table 2 Am plif ied results of 14 pa irs of pr im ers com b ina tion
引物组合
Primers
combination
总带数
Total bands
number
多态性带数
Number of
polymorphic bands
多态性带率
Rate of polymorphic
bands( % )
E2ACC /M2CAC 112 109 97
E2AAC /M2CAT 128 125 98
E2AAG/M2CAC 92 91 99
E2AAG/M2CAT 138 137 99
E2ACA /M2CAC 108 105 97
E2ACA /M2CAG 146 131 90
E2ACA /M2CAT 119 119 100
E2ACA /M2CTA 118 114 97
E2ACT/M2CAC 143 141 99
E2ACC /M2CTC 130 126 97
E2ACC /M2CTG 112 105 94
E2AGC /M2CAG 133 121 91
E2AGC /M2CTA 149 146 98
E2AGC /M2CTC 133 133 100
合计 /平均
Total/Average
1 761
1 703
97
图 1 E2ACC /M 2CTC引物组合对 31份 果品种 AFL P扩增的结果
F ig. 1 AFL P am plif ied results of 31 mango cultivars v ia E2ACC /M 2CTC pr im ers com b ina tion
727
园 艺 学 报 33卷
212 基于 AFL P标记的 果种质资源分类
以 31份 果种质的 1 761个位点的谱带数据为原始矩阵 , 计算两两种质间的相似系数 , 最大为
016265, 最小为 012549。聚类分析如图 2显示 , 以 0148的相似系数为阈值 , 所有供试 果材料被分
为 7大组群。第一组群内以 0152为阈值 , 又可分为 6组。品种 Banganapalli自成 1组 ; 台农 1号、
Carabao、粤西 1号、小菲、海豹为第 2小组 , 以 Carabao为代表种 , 海豹形果形 , 果实青熟时黄绿 ,
完熟时黄色或金黄色 ; Nan Klang W an、白象牙、串 、金煌为第 3组 , 为象牙类品种 ; Spooner、 Ir2
win、Zill为第 4小组 ; 桂热 10号、R2E2、Neelum、桂香、Bambaroo、紫花、Ono为第 5小组 ; 泰国
506独自分在第 6组。 Keitt、 kent、斯里兰卡 811、鹦鹉 、马切苏成为第二组群。而龙井大 、
Dashehari、Haden、泰国 504、红象牙各自成为一组。
图 2 31份 果品种基于 AFL P标记的聚类图
序号代表材料见表 1。
F ig. 2 The cluster f igure of 31 mango cultivars ba sed on AFL P markers
The material code see Table 1.
3 讨论
本研究在筛选引物时选择了亲缘关系不同的 4个品种 , 台农 1号、Carabao、Keitt和 Kent, 其中
台农 1号与 Carabao、Keitt与 Kent两两亲缘关系较近 , 但前两个品种与后两个之间亲缘关系较远。而
筛选引物时 , 在显示条带清晰、完整及多态性程度上 4品种之间没有表现出差异 , 这说明在进行 果
种内种质资源多样性引物筛选时 , 选择的品种亲缘关系的远近并不影响引物筛选的结果。
关于 果的亲缘关系及分类 , 国际上通常根据叶脉对数、树皮、果形、果色、果实风味、种胚数等
性状将其分为印度组系和印支组系 , 也有根据起源地分为菲律宾品种群、印度支那品种群、印度品种群
和西印度品种群。有的学者根据果实性状、花轴颜色、花序的侧枝、绒毛、分枝和种胚数将其分为穆尔
戈巴系 (Mulgoba)、阿方索系 (A lphonso)、桑德沙系 ( Sandershan) 和坎布地豆纳系 (Cambodiana) ,
827
4期 雷新涛等 : 果主要品种遗传多态性的 AFLP标记研究
我国常简单地将其分为单胚品种和多胚品种〔15〕。这些分类方法各有特点 , 但也存在明显的局限性 , 迄
今为止尚未形成一个完善的分类体系。分子标记的研究为这个问题的解决提供了新的思路。
本研究表明 果品种间的亲缘关系与胚性无关 , 如 5号品种 Nan Klang W an是多胚品种 , 但却与
单胚的 28号品种白象牙聚在一起 , 单胚品种紫花也与多胚品种 Ono聚在一类。同一起源地的品种并
不能完全聚在一类 , 如同起源于泰国的品种泰国 504、506、Nan Klang W an、白象牙、Bambaroo, 在
聚类图上只有 Nan Klang W an和白象牙聚在一起 , 其它品种相隔较远 , 泰国 504还自成一组 , 亲缘关
系相去甚远。亲缘关系与果皮颜色关系也不密切 , 同为红 类型的品种 Keitt、Kent、R2E2、 Irwin、
Haden、Zill并没有全聚在一起 , 只有 Keitt与 Kent、 Irwin与 Zill两两聚为一类 , Haden自成一类 , 显
示亲缘关系较远。
本研究表明 , 基于 AFLP标记的 果分类体系更能反映 果品种间的亲缘关系。在第一组群第 2
小组 , 粤西 1号、小菲都是 Carabao的后代 , 而台农 1号虽然是台湾凤山园艺分所 果种质圃 45个品
种开放授粉后实生选育 , 但其无论树形、叶形、果形、果色都与 Carabao较相似。串 是象牙 22的
单株变异 , 象牙 22又是白象牙的变异 , 而金煌则是白象牙与 Keitt的杂交种 , 所以串 与金煌亲缘关
系较近 , 被聚为一类。 Irwin是 L ippens的实生后代 , 而 L ippens由 Haden实生选育 , Zill也是 Haden
的实生后代 , 所以 Irwin和 Zill聚为一类。桂香 由鹰嘴和秋 (Neelum ) 杂交而来 , 故与 Neelum聚
为一类。这些结果都证明基于 AFLP标记的 果分类体系更能反映 果品种间的亲缘关系。
本研究结果为我国 果资源的收集保存和有效利用提供了一定的基础。目前我们正在进一步搜集
种质 , 下一步将对中国热带农业科学院南亚热带作物研究所 果种质圃搜集整理的 100多份种质进行
遗传多态性研究。
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收稿日期 : 2005 - 11 - 08; 修回日期 : 2006 - 04 - 20
基金项目 : 国家自然科学基金重点项目 (30230250)
CO2与养分交互作用对番茄幼苗养分利用的影响
李 娟 周健民 (中国科学院南京土壤研究所 , 土壤与农业可持续发展国家重点实验室 , 江苏南京 210008)
Effect of Carbon D iox ide Enr ichm en t In teraction s w ith Nutr ien t Concen tra2
tion on Nutr ien t Use Eff ic iency of the Toma to Seedlings
L i Juan and Zhou J ianm in ( The S ta te Key Laboratory of Soil and Susta inable A griculture, Insititu te of Soil Science, the
Chinese A cadem y of Sciences, N an jing, J iangsu 210008, Ch ina)
关键词 : 番茄 ; CO2浓度 ; 养分利用率
中图分类号 : S 64112 文献标识码 : A 文章编号 : 05132353X (2006) 0420730201
以番茄 (Lycopersicon esculen tum M ill. ) ‘合作 906’为材料进行溶液培养试验 , 设 2个因子 : CO2和营养液浓度 ;
CO2浓度设正常 (360μL /L) 和倍增 (720μL /L) 2个水平 ; 营养液浓度设基本营养液 (日本山崎番茄营养液 ) , 微
量元素采用阿农营养液配方的 1 /2、1 /4、1 /8、1 /164个水平 , 完全试验方案 8个处理 , 3次重复。pH为 610 ±012, 3
d更换 1次营养液。
移植到 112 L盆 (2株 /盒 ) 中 , 植株在 CO2生长箱 (VS23DMC) 中培养 , 全天施放 CO2 , 白天 25℃, 晚上 15℃,
光照为 14 h /d, 光照强度 11 000 lx, 相对湿度 60%。46 d时收获 , 根、茎、叶经蒸馏水冲洗吸干水分后 , 放入纸袋
105℃杀青 , 75℃烘至恒重。C、N分析仪 (Vario MAX CN) 测定 C、N, ICP2AES ( Thermoelement, USA ) 测定 P、K。
用 SPSS软件统计分析。多重比较采用 DuncanpisMultip le Range Test, 两因素方差分析。
结果表明 , CO2浓度升高提高了番茄对 4种元素的同化或吸收量 , 在根、茎、叶中 C、N、K的吸收量均增加 , 而
植株地上部器官中 P的吸收量提高 , 根中则下降 , CO2浓度的增加可能促进了 P从根部向地上部的转运。在同一 CO2
浓度条件下 , 各器官对 C、N、P、K的吸收量随营养液浓度的增加而增加。
番茄幼苗 C、N、P、K的利用率也显著受到 CO2浓度与营养液浓度交互作用的影响。从表 1中可以看出 , CO2浓
度的增加能显著提高高浓度营养液中番茄植株的碳同化率 , 而在低浓度营养液中其影响不显著 ; 高浓度营养液处理中
P元素利用率显著降低。随营养液浓度的提高植株对 N、K元素的利用能力降低 , 而且 CO2浓度的提高显著降低了所
有营养液处理中番茄 N、K的利用率。
表 1 CO 2对番茄幼苗养分利用的影响
Table 1 CO2 effects on nutr ien t use eff ic iency of toma to seedling
CO2浓度
CO2 concentration
(μL /L)
营养液浓度
Nutrition solution
concentration
大量元素 Macronutrient ( g / mg)
碳
Carbon
氮
N itrogen
磷
Phosphorus
钾
Potassium
720 1 /2 2134 ±0102 a 2815 ±110 f 16311 ±418 c 3818 ±012 f
1 /4 2134 ±0102 a 3212 ±112 e 20712 ±214 b 4018 ±014 e
1 /8 2128 ±0101 b 3812 ±110 d 23011 ±616 a 4413 ±012 d
1 /16 2130 ±0100 b 4310 ±012 b 23919 ±617 a 4412 ±111 d
360 1 /2 2130 ±0101 b 3016 ±114 e 21314 ±816 b 4814 ±017 b
1 /4 2130 ±0101 b 4112 ±016 c 21013 ±514 b 4513 ±013 c
1 /8 2129 ±0101 b 4315 ±018 b 21219 ±318 b 4716 ±013 b
1 /16 2130 ±0101 b 4618 ±112 a 20514 ±612 b 5310 ±013 a
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