全 文 ：园 艺 学 报 , 一
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黄瓜抗炭疽病相关基因 标记的 转换
李淑菊 , 王 惠哲
’ , 霍振荣 , 管 炜
天津科润黄瓜研究所 天津
摘 要 将黄瓜抗炭疽病相关基因的一 个共显性
』
标记成功地转换成了简单实用的 标记
、
对 ’护 标记片段进行序列测定
,
根据序列特点设计 厂特异的 另 引物 , 引物长 一 。 结果表
明 , 弓物对 可以扩增出 和 两条
·
背
, ‘ 物又」 可以扩增出 和 两条
,
带 ,
分别为抗炭疽病的特征带和感炭疽病的特征带 将该两个标记命名为 和 , 两对
引物在 单株和抗感病材料验证中符合率高达 ‘ 以川于黄瓜炭疽病的分子鉴定 。
关键词 黄瓜 炭疽病抗性相关基因 标记 标记
中图分类号 文献标识码 文章编号 一 刁 一
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作者已经用 法筛选到了一个与黄瓜抗炭疽病基因连锁较为紧密的
。 中 标记 王惠哲 等 , , 并获得了该标记片段的序
列 。 由于 标记程序十分复杂 , 因此本研究试 图对黄瓜抗炭疽病基 因连锁的 标记实施
、 。 。 行 。 。 转换 , 以期获得简单
、
廉价 、 适合大量样品分析的有
效标记 。
材料与方法
供试材料为抗炭疽病母本 ‘ ’ 和感炭疽病父本 ‘ ’ 及其组 合 的 代分离群体 , 以及
‘ ’ 、 ‘ ’ 和 ‘ 新绿六 ’ 等 , 均由天津科润黄瓜研究所提供 。 炭疽病菌由南开大学元素所提供 。
收稿 日期 一 一 修回 日期 一 一
基金项 目 国家 ‘ ’ 计划项 目 黑龙江省自然科学基金项 日
通讯作者 , 〔, , ‘、〕 ℃ , 一 一 。 ,
园 艺 学 报 卷
几 聚合酶
、
等试剂均购自大连宝生物公司
基因组 八提取采用 小址提取法 将回收扩增后的 代 产物送北京三博远志生物公司进
行测序 。 根据测序结果设计合适的 引物 , 由上海生 工生物工程公司合成 。 一 扩增体
系为 总体积 林
, 内含 八模板 , 林 二
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,
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最后 ℃延伸 , 仪为基因公司的 一 型
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采用聚丙烯酞胺凝胶进行分离
结果与分析
标记片段序列的测定与分析
抗性标记片段的序列如图 所示 , 该片段的长度为 , 内含一 个 的 “ ’
’
重复序列
,
重复频率为 另一感病标记片段缺失 个 “ ’
’
重复序列
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图 与黄瓜抗炭疽病基因连锁的 标记片段的碱基序列
阴影部分为引物结合区域
,
下划线部分为贡岌片段
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引物的设计及 特异扩增
根据抗性片段的测序结果设计 两对 一 帅 的正向引物和反向引物
, 由于要考虑引物中
碱基的含量 , 设计引物的位置没有从片段的两个末端开始 , 而是向片段的中间靠拢了一部分 。 引物对
上游引物 气
『
件 叮 脚
一 ‘ 下游引物 气
‘ 引物对 仁游引物与引物对 相同 下游引物靠近序列端一点 , 下游引物 气
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图 为引物对 的 扩增结果 , 可以看出 , 原来的多态性仍然存在 , 且抗病亲本和 抗
病单株带型一致 , 分子量大小为 感病亲本与感病单株带型一致
,
大小为 。 表明该标记
仍然为一共显性标记
, 可以用于黄瓜炭疽病的分子鉴定
卜
该共显性的 标记是黄瓜炭疽病分子标
记研究中的第 个
, 因此将该标记命名为 标记
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图 引物对 的 扩增产物
杭病亲本 感病亲本 一 抗病单株 一 感病单株 一 护间类塑单株
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期 李淑菊等 黄瓜抗炭疽病相关从因 ’ 标 已的 转换
图 为引物对 的 扩增结果 , 可以看出 , 原来的多态性仍然存在 , 且抗病亲本和抗病
单株带型一致 , 分子量大小为 感病亲本与感病单株带型一致 , 大小为 帅 中间类型单株
同时具有该两个条带 。 表明该标记仍然为一共显性标记 , 可以用于黄瓜炭疽病的分子鉴定 。 因此将该
标记命名为 标记 。
入
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图 引物对 《 的 扩增产物
抗病亲本 感病亲本 一 抗病单株 一 感病单株 一 中间类型单株
「
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用引物对 对 个已知炭疽病抗性的黄瓜材料 表 进行检测 , 其结果与人工接种鉴定符
合率高达 。 图 为部分验证材料的 扩增结果 。
表 标记验证所用黄瓜材料
编号
七侧
品种 抗
、
感性
‘
、旧 、
编号 品种
抗
、
感性
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编号
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品种
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感性 编号 品种
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注 表示抗病
,
表示感病
,
表示 书间类纲
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图 引物对 对部分验证材料的
、 抗病亲本 感病亲本 一
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扩增产物
一 , 抗病材料
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自类型材料
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讨论
标记具有稳定
、 迅速
、
简便
、
低成本等特点 , 适合于样品的大量分析 标记一般是
由
、
等标记转换而来 王彩虹 等 , 娄群峰 等 , 李红双 等 , 张桂华
等 , , 但通常转换的成功率很低 。 标记片段通常在 一 范围 , 常常给引物设计造
成一定困难 , 因此 目前只有少数 标记成功地转换成了以 为基础的 标记 王彩虹 等 ,
娄群峰 等 , 张桂华 等 , 。
本试验中 , 由于所得到的共显性 标记的两条带之间存在两个 “ ” 重复序列的插人或缺
失 , 所以给 引物的设计以及 扩增带来了很大困难 。 在本研究中
, 根据该 标 记的序
列特点 , 没有将 特异引物正好设计在片段的末端 , 而是向片段内移动了一段距离 , 从而保证了
引物中一定的 碱基含量 , 使得扩增时的退火温度不致于降得很低 , 在很大程度上避免了非特异性
扩增 。 然而
,
当引物的设计不是从 片段的两个末端位置开始时 , 就可能造成 标记筛选结
果与 分析不完全吻合。
在设计 引物时 , 必须首先保证在 扩增后仍然能够保持原来的多态性 。 因此在两个插
人缺失重复序列之外设计了两对引物 , 但略显不足的是 , 扩增产物仍然只有两个 “ ” 重复
序列 个碱基 的差别 , 在琼脂糖凝胶上勉强能分开抗病和感病株 , 但不能区分开中间类型 , 必须
用变性聚丙烯酞胺凝胶电泳进行分离 。 不过这样设计后仍然保持了标记原来的共显性特点 , 一次检测
就可区分纯合抗病单株
、
纯合感病单株和杂合感病单株 , 对于材料的抗病性检测带来了很大便利 。〕
引物对 比引物对 扩增片段大
,
便于观察 , 因此建议在大量样品的快速筛选时以其作
为标记的引物 。
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李红双 李景富 许向阳 番茄抗根结线虫病基因的 从勺 和 凌标记 植物病理学报
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娄群峰 , 陈劲枫
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陈 龙
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, 罗向东 黄瓜全雌性基因连锁的 和 宝分子标记 园艺学报
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, 王 斌 苹果柱型基因 幼 的 个 标记的 丈转换 园艺学报
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卜惠哲
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李淑菊
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管 炜 与黄瓜抗炭疽病相关基因连锁的 , 标记的筛选 园艺学报
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张桂华
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韩毅科
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孙小红 , 李淑菊
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魏爱民
,
杜胜利 与黄瓜抗黑星病 从因连锁的分子标记研究 中国农业 科学
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