全 文 ：园 　艺 　学 　报 　2006, 33 (2) : 433～436
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2005 - 06 - 01; 修回日期 : 2005 - 08 - 09
基金项目 : 香港理工大学与浙江大学合作项目3 通讯作者 Author for correspondence ( E2mail: qyxhero@ zju1edu1cn; bcyschan@ inet1poiyu1edu1hk)
羊蹄甲属 3种园艺树种分子鉴定及亲缘关系的 ISSR
分析
罗瑜萍 1 　龚　维 1 　邱英雄 13 　Yuk Sing Gibert Chan23
(1 浙江大学生命科学学院 , 杭州 310029; 2 香港理工大学应用生物与化学系 , 香港 )
摘 　要 : 利用 ISSR2PCR方法对香港羊蹄甲属 (B auhin ia) 中最常见 3种园艺树种 : 红花羊蹄甲 (B.
purpurea)、宫粉羊蹄甲 (B. variega te) 和洋紫荆 (B. blakeana) 的遗传变异进行了研究 , 从 74个 ISSR引
物中筛选出 9个多态性引物用于正式扩增 , 共扩增出 80条 DNA带 , 平均每个引物扩增的 DNA带的数目为
8188条 , 多态性条带数目为 55条 , 占总条带数的 6818%。其中 , 有 8个引物扩增出差异条带和特异条带 ,
并分别能准确地鉴定羊蹄甲属 3个园艺树种。本研究的结果表明 , ISSR - PCR的 DNA电泳谱带在检测香港
羊蹄甲 (B. blakeana) 品种的真实性方面非常有用。同时 , 通过对 3个种扩增条带的叠加性进行分析 , 证
实了洋紫荆杂交起源的父母本为红花羊蹄甲和宫粉羊蹄甲。
关键词 : 羊蹄甲属 ; 洋紫荆 ; 红花羊蹄甲 ; 宫粉羊蹄甲 ; ISSR; 指纹图谱
中图分类号 : S 68　　文献标识码 : A　　文章编号 : 05132353X (2006) 0220433204
D en tif ica tion of Three Spec ies in B auh in ia and Hybr id O r ig in of B auh in ia
b lakeana Using ISSR M arkers
Luo Yup ing1 , Gong W ei1 , Q iu Yingxiong13 , and Yuk Sing Gibert Chan23
(1Laboratory of System atic and Evolu tionary B otany and B iod iversity, College of L ife Sciences, Zhejiang U niversity, Hangzhou
310029, China; 2D epartm en t of A pplied B iology and Chem ica l Technology, the Hongkong Poly technic U niversity, Hung Hom ,
Hongkong, China)
Abstract: In this study, inter2simp le sequence repeat ( ISSR) was evaluated for its potential use in the
identification of B auh in ia purpurea, B. blakeana and B. variega te. Of the 74 ISSR p rimers subjected to
screening, 9 p roduced rep roducible, polymorphic and discrepant fragments. U sing these p rimers, 80 discerni2
ble DNA fragmentswere generated with 55 (6818% ) being polymorphic bands. The average number of DNA
bands amp lified by each p rimer was 8188. DNA p rofiles based on 8 p rimers have revealed potential diagnostic
fingerp rints which could contribute to the identification of 3 species in B auhin ia. Meanwhile, ISSR - PCR a2
nalysis revealed that the amp lified fragments respectively unique to B. purpurea and B. variega te showed addi2
tivity in B. blakeana. The molecular evidence indicated that B. blakeana was a hybrid origin from B. pur2
purea and B. variega te.
Key words: B auhin ia; B. blakeana; B. purpurea; B. variega te; ISSR; DNA fingerp rint
1　目的、材料与方法
洋紫荆 (B auh in ia blakeana)、红花羊蹄甲 (B. purpurea)、宫粉羊蹄甲 (B. variega te) 为苏木科
(Caesalp iniaceae) 羊蹄甲属 (B auh in ia) 植物 , 是热带和亚热带常见的园艺树种。虽然三者在开花时
间和花的形态上有区别 , 但在非开花期或苗期却很难以形态标准将其鉴别开来。近年来香港特区从内
地购买、引种香港洋紫荆苗木时 , 常混杂有红花羊蹄甲和宫粉羊蹄甲幼苗。大多数学者认为香港洋紫
荆杂交起源的父母本为红花羊蹄甲和宫粉羊蹄甲〔1～3〕。现利用 ISSR分析技术对洋紫荆、宫粉羊蹄甲、
园 　　艺 　　学 　　报 33卷
红花羊蹄甲进行研究 , 根据筛选出的分辨率高和重复性好的引物构建 3种羊蹄甲的 DNA指纹图谱 ,
以便为其苗期鉴定提供准确、快捷的方法 ; 同时通过对洋紫荆、红花羊蹄甲和宫粉羊蹄甲之间的遗传
关系分析 , 探讨香港洋紫荆的起源问题。
表 1　供试材料及其主要形态特征
Table 1　Plan t ma ter ia ls used for ISSR ana lysis in th is study and the ir m orpholog ica l characters
种
Species
样品编号
Specimen No.
采集地点
Locality
雄蕊数
No. of stamen
果实有无
Fruit
花瓣颜色
Color of petal
红花羊蹄甲 P1 香港理工大学 Hongkong Polytechnic Univ. 3 有 Yes 淡紫 Pale purp le
B. purpurea P2 香港筲箕湾 Hongkong Xiaoqiwan 3 有 Yes 粉红 Pink
P3 香港沙田 Hongkong Shatian 3 有 Yes 桃红 Pinkish
P4 香港理工大学 Hongkong Polytechnic Univ. 3 有 Yes 粉红 Pink
洋紫荆 B1 香港理工大学 Hongkong Polytechnic Univ. 5 无 No 紫红 Deep magenta
B. blakeana B2 香港理工大学 Hongkong Polytechnic Univ. 5 无 No 紫红 Deep magenta
B3 香港植物园 Hongkong Botanical Park 5 无 No 紫红 Deep magenta
B4 香港筲箕湾 Hongkong Xiaoqiwan 5 无 No 紫红 Deep magenta
宫粉羊蹄甲 V1 香港沙田 Hongkong Shatian 5 有 Yes 白 W hite
B. variegate V2 香港沙田 Hongkong Shatian 6 有 Yes 白 W hite
供试 3种羊蹄甲采自香港 (表 1)。采集植株的幼嫩叶片 , 用硅胶充分干燥 , 取 011 g, 用 Fast2
p rep (B io101, USA) 粉碎 , 采用改良 CTAB法〔10〕提取总 DNA, 110 %琼脂糖电泳检测 DNA质量 ,
根据紫外吸收法估计 DNA的浓度和纯度。 ISSR反应体系经过优化确定为 : 25μL体系中含约 60 ng
模板 DNA , 1125 U Taq酶 , 115 mmol·L - 1 MgCl2 , 0125 mmol·L - 1 dNTPs, 013μmol·L - 1引物。
PCR扩增条件 : 94℃预变性 5 m in; 94℃变性 1 m in, 52℃复性 45 s, 72℃延伸 2 m in, 45个循环 ; 最
后 72℃延伸 5 m in。PCR产物在含有 EB的 2 %琼脂糖凝胶中电泳 , 以 100 bp Marker ( GeneRuler100
ladder, Fermentas UAB , Inc. ) 作为标准分子量对照 , EPSON (Japan) 紫外自动成像仪照相。用 FR2
980电泳图象分析系统 (复日科技 ) 计算扩增片段的分子量 , 扩增位点的命名由所用引物和条带分子
量来确定。电泳图谱的每条带 (DNA片段 ) 均为 1个分子标记 (Marker) , 代表 1个引物的结合位
点。根据各分子标记的迁移率及其有无统计所有的二元数据 , 有带 (显性 ) 记作 1, 无带 (隐性 )
记为 0, 强带和弱带均赋值 , 根据 0, 1矩阵建立 3个种的 DNA指纹图谱。采用 RAPD istance软件计
算所有个体的 Neipis遗传距离 , 利用 NTSYSpc21180版软件的 UPGMA ( unweighted pair2group method
with arithmetic averages) 构建所有个体的遗传关系树状图 , 分析 3个种的遗传关系。
2　结果与分析
211　引物筛选和 ISSR - PCR扩增结果
ISSR引物是根据加拿大 B ritish Columbia大学公布的序列设计 , 由上海生工生物工程技术服务有
限公司合成。从 74个引物中筛选出 9个扩增条带较多、信号强、背景清晰的引物用于 ISSR - PCR反
应。结果显示 : 9个引物对所有样品进行 PCR扩增 , 共扩增得到 80条 DNA条带 , 其中多态性条带
55条 , 占总条带数的 6818% ; 平均每个引物扩增的 DNA带的数目为 8188条 , 对红花羊蹄甲、洋紫
荆和宫粉羊蹄甲扩增得到的条带分别为 54、62和 52条 ; 红花羊蹄甲与洋紫荆共有的条带为 18条 ,
占总条带数的 2215% , 宫粉羊蹄甲和洋紫荆共有的条带为 14条 , 占总条带数的 1715% (表 2)。图 1
示部分引物扩增所得的 DNA电泳图谱。
212　羊蹄甲属 3种植物的 D NA指纹图谱
ISSR分析的结果表明 , 8个引物扩增得到的 DNA指纹图谱均检测到种间差异性的特征条带 (表
2)。例如引物 UBC811在红花羊蹄甲中扩增出分子量为 1 360、426、365 bp的特征条带 , 在宫粉羊蹄
甲中扩增出分子量为 1 130、767、529 bp的特征条带 , 而在洋紫荆中则扩增出上述的 6条谱带 , 因
434
　2期 罗瑜萍等 : 羊蹄甲属 3种园艺树种分子鉴定及亲缘关系的 ISSR分析 　
此 , 引物 UBC811能将红花羊蹄甲、宫粉羊蹄甲和
洋紫 荆 三 者 区 分 开 来。同 样 引 物 UBC815、
UBC817、UBC818、UBC835、UBC848、UBC855和
UBC856也能单独区分 3种羊蹄甲。因此 , 可以利
用上述 8个引物扩增的 3种羊蹄甲植物的 DNA电
泳谱带作为种间鉴定的指纹图谱。引物 UBC866在
对红花羊蹄甲的基因组 DNA进行扩增时 , 并没有
扩增出宫粉羊蹄甲和洋紫荆的 3 条共有条带
(UBC86621550、UBC8662888、UBC8662676) , 因此 ,
图 1　用引物 UBC811 ( A)、UBC848 ( B) 和 UBC866 ( C) 对
红花羊蹄甲、洋紫荆和宫粉羊蹄甲进行 ISSR2PCR分析
供试个体代码见表 1, M表示 marker, 箭头
所指为特异性条带。
Fig. 1　ISSR2PCR profiles of B. purpurea, B. blakeana and B. variegate
w ith pr im er UBC811 ( A) , UBC848 ( B) and UBC866 ( C)
No. stands for individual code listed in Table 1, M indicates DNA
marker. The arrow indicates the specific bands.
表 2　洋紫荆、宫粉羊蹄甲和红花羊蹄甲的 D NA指纹图谱比较
Table 2　Com par ison of D NA f ingerpr in ts of
B. blakeana, B. va riega te and B. pu rpu rea
序号
Code
标记编号
No1of marker 红花羊蹄甲B. purpurea 洋紫荆B. blakeana 宫粉羊蹄甲B. variegate
1 UBC81121360 + + -
2 UBC81121130 - + +
3 UBC8112767 - + +
4 UBC8112426 + + -
5 UBC8112365 + + -
6 UBC81521867 - + +
7 UBC81521455 + + -
8 UBC81521253 + + -
9 UBC81721140 + - +
10 UBC8172901 - + +
11 UBC8172595 + + -
12 UBC8172386 + + -
13 UBC81821194 - + +
14 UBC8182949 - - +
15 UBC8182858 + - +
16 UBC8182712 - - +
17 UBC8182463 - + +
18 UBC8182401 + + -
19 UBC8182342 - - +
20 UBC8182261 - - +
21 UBC83521908 - - +
22 UBC83521351 + + -
23 UBC8352984 + + -
24 UBC8352808 + + -
25 UBC8352716 - + +
26 UBC8352469 + + -
27 UBC8352351 + + -
28 UBC8352307 - + +
29 UBC84821568 + + -
30 UBC8482880 - + +
31 UBC8482842 + + -
32 UBC8482645 + + -
33 UBC8482418 - + +
34 UBC85521877 + - -
35 UBC85521766 + + -
36 UBC85521124 - + +
37 UBC85521039 + + -
38 UBC8552953 + + -
39 UBC85621257 + + -
40 UBC85621079 - + +
41 UBC8562821 + + -
42 UBC8562726 - + +
43 UBC8562391 + + -
44 UBC86621550 - + +
45 UBC8662888 - + +
46 UBC8662676 - + +
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园 　　艺 　　学 　　报 33卷
该引物只能将红花羊蹄甲与宫粉羊蹄甲、洋紫荆
区分开来 , 而不能区分宫粉羊蹄甲与洋紫荆。
213　羊蹄甲属 3种植物的亲缘关系分析
在以 上 的 9 个 引 物 中 , 引 物 UBC811、
UBC815、UBC848和 UBC856在对红花羊蹄甲和
宫粉羊蹄甲的基因组 DNA进行扩增时 , 所扩增出
的两个种间的差异条带在洋紫荆的电泳图谱中都
表现了严格的叠加 (表 2) , 从而证实了洋紫荆为
红花羊蹄甲和宫粉羊蹄甲的杂交后代。图 2可以
看出 , 3个种的所有样本在树状图上聚为 3支 ,
分别为红花羊蹄甲、洋紫荆和宫粉羊蹄甲。由此
说明 , 这 3个种在 DNA水平出现了一定程度的遗
传分化。本研究结果表明 , 取自于不同地点的洋
紫荆个体间 (表 1) 的遗传距离为 0, 这与洋紫
荆只能进行营养繁殖的繁育特点是一致的。红花
羊蹄甲和宫粉羊蹄甲异花传粉的繁育机制则使得
图 2　洋紫荆、红花羊蹄甲和宫粉羊蹄甲间的 ISSR遗传
关系树状图 ( UPGM A)
F ig. 2　D endrogram for B. blakeana, B. pu rpu rea, and
B. va riega te ba sed on ISSR markers ( UPGM A)
种内个体间产生了一定程度的遗传变异 , 红花羊蹄甲和宫粉羊蹄甲的种内遗传变异为进一步选育优良
的园艺品种提供了基础。此外 , 由树状图可知 , 洋紫荆与红花羊蹄甲的遗传距离较近 , 与 Lau等〔3〕认
为洋紫荆与宫粉羊蹄甲亲缘关系更近的结论并不一致 , 这可能是由于选用的不同引物对羊蹄甲基因组
DNA不同区域进行扩增所致。为了进一步确定洋紫荆的父母本 , 本实验室正在利用 cpDNA2RFLP分
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