全 文 ：园 　艺 　学 　报 　2007, 34 (4) : 1059 - 1062
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2007 - 01 - 15; 修回日期 : 2007 - 04 - 28
基金项目 : 国家自然科学基金项目 ( 30471102) ; 山西省回国留学人员资助项目 ( 200689) ; 山西省农业科学院博士基金项目
( YBSJJ0604)3 通讯作者 Author for correspondence ( E2mail: zhwfen@ sina1com)
马铃薯总 RNA提取和鉴定方法的改进
白云凤 , 郭志华 , 白冬梅 , 王小琦 , 张维锋 3
(山西省农业科学院作物遗传研究所 , 太原 030031)
摘 　要 : 对植物总 RNA的提取和鉴定方法作了改进。以马铃薯叶片和茎为材料 , 分别用常规苯酚法和
改进法提取总 RNA, 通过甲醛变性胶和非变性胶及紫外光谱分析 , 表明用改进法提取的总 RNA与常规苯
酚法无明显差异 , RNA完整性良好 , 可以用普通琼脂糖凝胶代替甲醛变性胶电泳分析 RNA的完整性。RT
- PCR结果表明 , 以改进法提取的总 RNA可以用于分子克隆和基因表达分析等分子生物学实验。利用改进
法提取植物总 RNA, 能降低成本 , 节约时间 , 也避免了使用 DEPC和甲醛等试剂。
关键词 : 马铃薯 ; 总 RNA提取
中图分类号 : S 653　　文献标识码 : A　　文章编号 : 05132353X (2007) 0421059204
An Im proved M ethod for Extraction and Iden tif ica tion of Pota to RNA s
BA I Yun2feng, GUO Zhi2hua, BA IDong2mei, WANG Xiao2qi, and ZHANG W ei2feng3
(C rop Genetics Institu te, Shanxi A cadem y of A gricultural Sciences, Taiyuan 030031, Ch ina)
Abstract: An imp roved method of extracting and identifying total RNA s from potato leaf and stem was
put forward. The electrophoretic patterns and absorbance at 260 nm and 280 nm in a UV2V is spectrophotome2
ter revealed that the total RNA s of potato extracted by thismethod has good comp leteness and high purity. Fur2
thermore, the result of RT - PCR indicated that the RNA s p repared with this imp roved method could meet the
needs of most molecular biological experiment including gene cloning and exp ression analysis.
Key words: Potato; Total RNA s extraction
提取植物 RNA是进行分子克隆和基因表达分析的基础步骤之一。RNA化学性质活跃 , 容易被内
源和外源的 RNase降解 , 因此保证 RNA的完整性是提取 RNA的关键所在。目前常用的 RNA提取方
法有多种 , 如异硫氰酸胍法 ( Chomezynski & Sacchi, 1987 )、 SDS/酚抽提法 (夏兰芹和郭三堆 ,
2000)、苯酚法和氯化锂沉淀法 (王关林和方宏筠 , 1998)、皂土法 (张容 等 , 2006) 和一些改良的
方法 (崔素萍 等 , 2006) , 还有应用商品化的 Trizol试剂盒等。利用这些方法提取 RNA的成本均比
较昂贵 , 操作也繁琐 , 玻璃器皿需要 180℃烘烤 , 不耐高温的离心管、微量移液器吸头、实验用水均
需用 DEPC水处理。DEPC毒性较大 , 操作稍有不慎 , 极易伤害人体 , 污染环境。
由于 RNA易降解 , 提取后需要检测其完整性。一般采用凝胶电泳分离不同大小的片段 , 通过观
测泳道中 28S和 18S rRNA带型清晰程度和二者的相对亮度来确定 RNA的质量。常规电泳要求对溶液
和器皿进行高温或其他特殊处理 , 以去除 RNase, 电泳要用变性胶 , 而且需要在凝胶中加入甲醛 , 制
作比较麻烦。
作者以马铃薯为材料 , 对其 RNA的提取、鉴定方法作了一些改进 , 获得了较好结果 , 为简化植
物 RNA的提取步骤 , 降低成本 , 避免使用 DEPC和甲醛等试剂 , 作了有益的探索。
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1　材料与方法
111　植物材料
取马铃薯中上部叶片或茎 , 立即用于提取 RNA或液氮速冻 , - 70℃保存。
112　RNA提取的常规方法
研钵、研杵、药匙等用锡箔纸包裹 , 于 180℃烘烤 3 h以上 ; 离心管、各种移液器吸头等用
DEPC - H2 O浸泡 , 37℃过夜 , 次日灭菌备用。
取 5～10 g材料 , 液氮研磨至粉末状 , 加入 65℃水浴预热的 RNA抽提 buffer 13 mL (50 mmol Tris
- HCl, pH 910, 100 mmol NaCl, 10 mmol EDTA , 015% SDS, 012% β - 巯基乙醇 ) 和水饱和酚 7
mL, 剧烈振荡 10 m in, 再加入氯仿 8 mL, 混匀 , 冰浴 10 m in; 10 000 r/m in, 4℃离心 20 m in; 取上
清液 , 氯仿抽提 , 加 1 /3体积的 8 mol/L L iCl, 4℃过夜 ; 10 000 r/m in, 4℃离心 20 m in; 留沉淀 , 乙
醇洗涤后 , 超净台上晾干 , 加 DEPC - ddH2 O溶解 RNA沉淀 ; 用 Rnase Inhibitor和 Dnase处理 RNA溶
液 , 酚仿抽提 , 无水乙醇沉淀 , 4℃预冷的 70%乙醇洗涤沉淀两次 , 在超净台上晾干 , 用 DEPC -
H2 O溶解 RNA沉淀。
113　RNA提取的改进方法
研钵、研杵、药匙、离心管、各种移液器吸头等无需 DEPC - H2 O 浸泡 , 直接高压蒸汽灭菌
(121℃, 20 m in) 备用。取 5～10 g植物材料 , 液氮研磨至粉末状 , 加入 RNA 抽提 buffer 13 mL
(65℃水浴预热 ) , 剧烈振荡 10 m in; 加水饱和酚 7 mL, 氯仿 8 mL, 充分混匀 , 冰浴 10 m in; 室温
10 000 r/m in离心 20 m in; 取上清液 , 加等体积氯仿 , 混匀 , 室温 10 000 r/m in离心 20 m in; 取上清
液 , 加 1 /10体积的 3 mol/L NaAc和等体积的异丙醇 , 混匀 , - 20℃沉淀 4 h; 室温 12 000 r/m in离心
20 m in, 留取沉淀 ; 4℃预冷的 70%乙醇洗涤沉淀两次 , 在超净台上晾干 , 用 ddH2 O溶解 RNA沉淀。
114　总 RNA的完整性及质量检测
变性胶电泳检测 : 称取 0172 g琼脂糖 , 加入 4312 mL DEPC - H2 O, 加热溶解 , 待冷却至 60℃左
右 , 加入 1018 mL甲醛和 6 mL 10 ×MOPS, 再加入少量 EB (015μg/mL) , 混匀后倒胶。取 3～6μL
RNA , 用 DEPC - H2 O补至 9μL, 依次加入 10 ×MOPS 4μL, 甲酰胺 20μL, 甲醛 7μL, 混匀 , 65℃
水浴 10 m in, 冰浴 5 m in, 离心将溶液收集至管底。加 4μL 10 ×Loading buffer上样 , 以 1 ×MOPS为
电泳缓冲液进行电泳 , 用 B ioRad凝胶成像系统拍照记录。
非变性凝胶电泳检测 : 制备 112%的琼脂糖凝胶 , 在 1 ×TAE缓冲液中电泳。电泳结束后 , 用
B ioRad凝胶成像系统拍照记录。
紫外分光光度计测定 : 取 5μL常规方法提取的 RNA样品用 DEPC - H2 O稀释 100倍 , 取 5μL改
进法提取的 RNA样品用 ddH2 O稀释 100倍 , 紫外分光光度计测定 A260和 A280 , 每个样品重复 3次。
115　RT - PCR对总 RNA的验证
由于提取 RNA的马铃薯植株上曾接种过马铃薯 X病毒 ( PVX) 并已发病 , 因此根据 PVX的已报
道序列 , 设计 RT - PCR引物。正向引物为 5′2atg tca gca cca gct agc ac23′, 反向引物为 5′2tta tgg tgg tgg
tag agt ga23′, 引物由三博公司合成。加入反向引物 , 采用 TaKaRa公司的 M 2MLV反转录酶进行反转
录 , 得到 cDNA。以该 cDNA为模板 , 进行 PCR扩增。扩增体系为 ddH2 O 35μL, 10 ×PCR buffer 5
μL, 10 mmol dNTP 1μL, 10μmol正向引物 2μL, 10μmol反向引物 2μL, EX Taq酶 ( 5 U /μL )
013μL, 反转录产物 5μL, 总体积 50μL。扩增程序为 95℃变性 5 m in; 94℃变性 45 s, 58℃复性 45
s, 72℃延伸 45 s, 循环 30次 ; 72℃延伸 6 m in。然后将扩增产物与 pMD182T vector连接 , 转化大肠杆
菌 , 挑选阳性克隆送三博公司测序。
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　4期 白云凤等 : 马铃薯总 RNA提取和鉴定方法的改进 　
2　结果与分析
211　总 RNA的完整性及其纯度
分别取常规方法和改进方法提取的马铃薯总 RNA进行变性胶电泳检测 (图 1, A) 和普通琼脂糖
非变性凝胶检测 (图 1, B)。结果表明 , 所有泳道中的 28S和 18S rRNA带型清晰 , 说明这两种方法
提取的总 RNA质量均比较好 , 二者间无明显差异 , 甲醛变性胶和普通的非变性琼脂糖凝胶均可用于
检测 RNA的完整性。
图 1　马铃薯总 RNA的凝胶电泳图
A. 总 RNA甲醛变性胶电泳图 ; B. 总 RNA普通琼脂糖非变性胶电泳图 ;
泳道 1: 常规方法提取的总 RNA; 泳道 2: 改进法提取的总 RNA。
F ig. 1　Electrophoretogram of tota l RNA extracted from pota to
A. Formaldehyde denaturalization gel electrophoretogram of total RNA; B. Agarose gel electrophoretogram of total RNA;
Lane 1: RNA extracted by common method; Lane 2: RNA extracted by modified method.
用紫外分光光度计测定 RNA的纯度 , 常规方法提取的 RNA的 A260 /A280为 1189, 改进法提取的
RNA的 A260 /A280为 1181, 说明这两种方法提取的 RNA纯度无明显差异。
212　RT - PCR验证提取的 RNA
根据马铃薯植株上接种的马铃薯 X病毒 ( PVX) 已报道的序列设计引物 , 进行 RT - PCR, 常规方
法和改良法提取的 RNA均得到了约 720 bp的目标带 (图 2)。
回收目标带 , 与 pMD182T vector连接测序。测序结果表明 RT - PCR产物的长度均为 728 bp, 二者
的同源性高达 100%。
图 2　RT - PCR产物电泳检测
泳道 1: 模板为改进法提取的 RNA; 泳道 2: 模板为常规方法提取的 RNA; M: 100 bp ladder。
F ig. 2　Electrophoretogram of RT - PCR product
Lane 1: RNA extracted by modified method; Lane 2: RNA extracted by common method; M: 100 bp ladder.
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将该序列与 GeneBank公布的 PVX的 cp基因序列作比对 (图 3) , 序列同源性高达 88198% , 说
明扩增产物确为 PVX的 cp基因 , 也进一步表明用改进法提取的 RNA序列完整 , 无降解 , 可用于后续
的分子生物学实验。
图 3　RT - PCR产物与 GenBank公布的 PVX cp基因的核酸序列同源树
刻度表示核酸序列之间的同源程度。
F ig. 3　Nucle ic ac id hom ology tree for the RT - PCR product and cp reg ion of som e isola tes of PVX
The scale p resent the degree of nucleic acid identity between different sequences.
3　讨论
在 RNA提取和鉴定过程中 , 外源性 RNase主要来自所用的器皿、缓冲液和移液器等。因此 , 作
者在 RNA提取过程中 , 配制的缓冲液分成小份保存 , 一次用一份。移液器、移液器吸头盒和玻璃器
皿专用 , 移液器吸头和离心管均使用一次性的。RNA电泳装置用清洁剂清洗后用流水冲洗 , 之后加
入 3%的 H2 O2浸泡 10 m in, 再用乙醇清洗晾干后使用。整个操作过程均戴一次性 PE手套 , 尽量避免
接触其它物件。试验结果表明 , 通过采用上述预防措施可以避免由外源性 RNase污染引起的 RNA降
解。
本试验所采用的改进法省去了对器皿的高温烘烤或 DEPC处理 , 试验用水不必 DEPC处理 , 只要
高温灭菌即可。提取过程均在常温下进行 , 用普通高速离心机代替冷冻高速离心机。对提取出的总
RNA进行质量检测 , 表明序列完整 , 无降解 , 可以用于分子克隆和基因表达分析等分子生物学实验。
本试验用普通琼脂糖凝胶代替甲醛变性胶 , 完全可以满足 RNA 完整性鉴定的要求。利用改进法提取
RNA , 能降低成本 , 节约时间 , 也避免了使用 DEPC和甲醛等试剂。
References
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