全 文 ：园 　艺 　学 　报 　2007, 34 (1) : 131 - 134
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2006 - 08 - 31; 修回日期 : 2006 - 12 - 06
基金项目 : 重庆市自然科学基金项目 (2006BB1262) ; 甘肃省自然科学基金项目 (ZS0212A2520332N) ; 重庆师范大学基金项目 (06XLB014)
芸芥体细胞胚胎发生的组织细胞学研究
张　涛 1, 2
(1 重庆师范大学生命科学学院 , 重庆 400047; 2 甘肃省农业科学院 , 兰州 730070)
摘 　要 : 以芸芥子叶为外植体 , 在 MS + 2, 42D 110 mg·L - 1培养基上培养 2周后可诱导体细胞胚胎的
发生。胚性愈伤组织在 MS + 2, 42D 012 mg·L - 1培养基上大量增殖 , 体细胞胚胎在 N6培养基上成熟后 , 可
在附加 011 mg·L - 1 IBA的 1 /2MS培养基上生长。切片观察表明 : 芸芥体细胞胚胎为单细胞发生方式 , 与合
子胚形成过程相似。芸芥胚性细胞具有细胞小、胞质浓、核大、核仁明显 , 排列紧密的特点 , 首先由单个
细胞分裂形成 2 -细胞原胚 , 2 -细胞原胚分裂成 3 - 细胞原胚或 4 - 细胞原胚 , 3 - 细胞原胚或 4 - 细胞原
胚继续分裂形成多细胞原胚 , 进一步发育成一个成熟的体细胞胚胎。
关键词 : 芸芥 ; 体细胞胚胎 ; 组织细胞学
中图分类号 : S 63　　文献标识码 : A　　文章编号 : 05132353X (2007) 0120131204
H istolog ica l Stud ies of Soma tic Em bryogenesis in E ruca sa tiva M ill.
ZHANG Tao1, 2
(1 College of L ife Sciences, Chongqing N orm al U niversity, Chongqing 400047, Ch ina; 2 Gansu A cadem y of A gricu ltura l Sciences,
Lanzhou 730070, China)
Abstract: Somatic embryos were induced from cotyledon exp lants cultured on Murashige and Skoog
(MS) medium supp lemented with 110 mg·L - 1 2, 42D after two weeks of culture. Embryogenic callus p rolif2
erated p rofusely on MS medium containing 012 mg·L - 1 2, 42D. Somatic embryos matured on N6 medium and
developed into p lantlets by culturing the mature somatic embryos on 1 /2MS medium containing 011 mg·L - 1
indole232butyric acid. Section and m icroscop ic observation of different developmental stages revealed that so2
matic embryogenesis was sim ilar to that of the zygotic embryo. It originated from a single embryogenic cell,
which had bigger nuclei, thick cytop lasm, clear nucleoli and denser order. The embryogenic cell first divided
into two2celled stage p roembryo, then three2or four2celled stage p roembryo. Three2 or four2celled stage p ro2
embryo developed into multicellular p roembryo, then developed into mature somatic embryo.
Key words: E ruca sa tiva; Somatic embryos; H istological
芸芥 ( E ruca sa tiva M ill. ) 泛指十字花科芝麻菜属所有种 , 是意大利、法国等欧洲国家的一种食
用蔬菜 (B ianco, 1994) , 具有适应性强、抗旱、耐瘠薄、抗病、耐盐碱等优良性能 , 也是迄今为止
人们发现的最为抗旱、耐瘠薄的十字花科油料作物。芸芥硫苷水解产物所含的 4 - 甲基硫代丁基异硫
氰酸盐具有一定的抗癌作用 (Bonnessen et al. , 2001)。此外 , 芸芥中富含的长链脂肪酸 (C22 ) 在一
些品种中高达 47% , 可作为十字花科油料植物长链脂肪酸遗传育种研究的重要基因资源 ( Kumar &
Tsunoda, 1980)。
作者以芸芥子叶为外植体 , 建立了芸芥高效体细胞胚胎发生及植株再生体系 , 同时开展了发根农
杆菌介导的芸芥遗传转化研究 (张涛 , 2005; Zhang et al. , 2005) , 以期为植物体细胞胚胎的发生机
理和发育特点提供证据。
园 　　艺 　　学 　　报 34卷
1　材料与方法
111　芸芥体细胞胚胎的诱导
以 ‘青城芸芥 ’5 d龄无菌苗子叶为外植体 (015 cm ×015 cm ) , 接种于附加 110 mg·L - 1 2, 42D
的 MS培养基上 , 诱导芸芥体细胞胚胎发生 , 24 d后将产生的大量愈伤组织转入附加 012 mg·L - 1
2, 42D的 MS培养基上继代培养 , 30 d后将产生的淡黄色颗粒状愈伤组织转入 N6培养基上诱导体细胞
胚胎成熟 , 成熟体细胞胚胎在附加 011 mg·L - 1 IBA的 1 /2MS培养基上进一步生长。
112　石蜡切片制样与观察
于外植体接种后 0、2、4、8、12、16、20、24 d, 胚性愈伤组织转移至 N6培养基后 0、2、4、8、
12、16、20、24、28、32、36、42 d分期取样 , FAA固定 24 h, 爱氏苏木精染色 , 常规石蜡切片 , 切
片厚度 7～8μm, 脱蜡封片后 , 在 O lympus光学显微镜下观察、照相。
113　体细胞胚胎的发育过程观察
在体细胞胚胎诱导及成熟培养过程中 , 取球形、心形、鱼雷形和子叶形时期体细胞胚胎在体视显
微镜下观察并照相。
2　结果与分析
211　体细胞胚胎发生的组织细胞学观察
芸芥从愈伤组织产生体细胞胚胎 , 首先是由非胚性愈伤组织转变为胚性愈伤组织。非胚性愈伤组
织呈松软状 , 细胞形态大而不规则。胚性愈伤组织结构比较致密 , 细胞小 , 排列紧密。石蜡切片观察
发现 , 芸芥体胚起源于愈伤组织中的胚性细胞 , 胚性细胞与周围细胞有明显的区别 , 其细胞核较大 ,
核仁大而明显 , 细胞质较为浓厚且染色较深 , 有较厚的细胞壁与周围的体细胞隔离 (图 1, A ) , 说
图 1 　芸芥体细胞胚胎发生的组织细胞学研究
A～D. 在 MS附加 110 mg·L - 1 2, 42D的培养基上培养 (A. 12 d, 胚性细胞 ; B. 16 d, 二细胞原胚 ;
C. 20 d, 多细胞原胚 ; D. 24 d, 球形胚 ) ; E～H. 在 N6培养基上培养 ( E. 16 d, 心形胚 ; F. 24 d,
不同发育阶段的体细胞胚胎 ; G. 20 d, 鱼雷期体胚和具胚柄的体胚 ; H. 28 d, 球形胚和子叶期胚 )。
F ig. 1　H istolog ica l study of E. sa tiva soma tic em byogenesis
A - D. On MS medium with 110 mg·L - 1 2, 42D (A. Embryogenic cells cultured for 12 days; B. Two2celled stage p roembryo cultured for
16 days; C. Multicellular p roembryo cultured for 20 days; D. Globular embryo cultured for 24 days) . E - H. On N6medium ( E. Heart2
shaped embryo cultured for 16 days; F. Somatic embryos at different stages cultured for 24 days; G. Torpedo2shaped embryo and
heart2shaped embryo with suspensor cultured for 20 days; H. Globular and cotyledonary embryos cultured for 28 days) .
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　1期 张 　涛 : 芸芥体细胞胚胎发生的组织细胞学研究 　
明此时细胞正处于代谢旺盛时期。
培养 16 d时 , 在愈伤组织表层可见细胞核己分裂但细胞质未分裂的情况 (图 1, B )。胚性细胞
首先不均等分裂形成上、下两个细胞 , 即顶细胞和基细胞 , 2 - 细胞原胚随后分裂形成 3 - 细胞原胚
或 4 -细胞原胚 , 并继续分裂形成多细胞胚 (图 1, C)。
图 1, D为在 MS附加 110 mg·L - 1 2, 42D的培养基上培养 24 d的球形胚。图 1, E、F是在 N6培
养基上培养形成的心形胚和体细胞胚胎。
在胚性细胞分裂时 , 它周围的细胞逐渐退化解体 , 使胚性细胞与周围细胞具有明显的区别 , 但胚
性细胞团不可能与周围组织在生理上完全隔离开 , 体胚的发生、发育必须从周围组织中吸收营养和其
它重要物质 , 因此 , 在观察中发现体胚有类似胚柄的结构 (图 1, G)。此外 , 可看到体细胞胚胎进
一步发育后与外植体组织基本无直接联系 (图 1, F、H) , 很容易与外植体脱离开 , 在适宜的条件下
长成一个独立的植株。还发现愈伤组织的内部也有一些分生组织的细胞团 , 这些细胞团可能是经胚性
细胞分裂、分化和进一步发育 , 与原愈伤组织脱离联系形成的早期体胚 , 这说明除了愈伤组织外层细
胞可形成体胚外 , 内层细胞也可形成体细胞胚 , 即存在内部发生和外部发生两种方式。
212　体细胞胚胎的发育过程
芸芥子叶外植体在培养 3 d后开始膨大变厚 , 叶面变形拱起 , 十多天后在边缘出现大量愈伤组织
(图 2, A)。组织细胞学观察表明 , 虽然在附加 110 mg·L - 1 2, 42D的 MS诱导培养基上芸芥子叶外植
体可形成胚性愈伤组织 , 但大部分体胚的发育停止在球形胚阶段。当将形成的体细胞胚胎转移至不含
2, 42D的 N6培养基上可进一步发育。
图 2 　芸芥体细胞胚胎的发生及植株再生
A. 在 MS附加 110 mg·L - 1 2, 42D的培养基上培养 2周的胚性愈伤组织 ; B. 球形胚 ; C. 心形胚 ; D. 鱼雷胚 ; E. 早期子叶形胚 ;
F. 子叶形胚 ; G. 萌发体胚 ; H. 不同发育阶段的体细胞胚胎 ; I～K. 畸形体细胞胚 ; L. 开花的再生植株。
F ig. 2　Soma tic em bryogenesis and plan t regenera tion of E. sa tiva
A. Embryogenic callus cultured on MS medium with 110 mg·L - 1 2, 42D for 2 weeks; B. Globular embryo; C. Heart2shaped embryo;
D. Torpedo2shaped embryo; E. Cotyledonary embryo in early stage; F. Cotyledonary embryo; G. Germ inated somatic embryo;
H. Somatic embryos at various stages; I - K. Abnormal somatic embryos; L. Flowering regenerated p lantlet.
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园 　　艺 　　学 　　报 34卷
芸芥体细胞胚胎首先由单个胚性细胞分裂形成 2 -细胞原胚 , 2 -细胞原胚分裂成 3 -细胞原胚或
4 -细胞原胚 , 3 -细胞原胚或 4 -细胞原胚继续分裂形成多细胞原胚 , 并进一步发育成一个成熟的体
细胞胚胎。与其它双子叶植物一样都经历了球形胚、心形胚、鱼雷形胚和子叶形胚 4个明显的过程
(图 2, B～G)。由于细胞分化的不同步性 , 芸芥体细胞胚胎发生的同步化程度相对较低 , 所以在一
个愈伤组织团块中可以观察到体胚发育的各个时期 , 往往是既有子叶胚、也有球形胚或鱼雷形胚
(图 2, H)。此外 , 在观察中还可以看到一些如子叶不发育、多子叶及子叶肥大等发育不正常的体胚
(图 2, I～K) , 这些畸形胚转入萌发培养基后一般不能发育为正常植株。
成熟体胚可以在 1 /2MS附加 011 mg·L - 1 IBA的培养基上生根 , 并能在适当条件下长成植株 , 最
终开花结实 (图 2, L)。
3　讨论
组织学研究表明芸芥子叶外植体体细胞胚胎的形成是通过间接发生方式 , 这些能产生体细胞胚的
胚性细胞具有核大、质浓、染色深、细胞排列紧密等特点 , 且跟周围的细胞有一个很明显的界限 , 在
显微镜下能够很容易跟周围细胞区分开来。Zee和 W u (1980) 在芹菜中发现 , 在多细胞原胚阶段体
胚周围有一层细胞构成 “边缘细胞层 ”, 后来这层细胞逐渐退化解体 , 在体胚与周围组织间形成缝
隙。Steward等 (1958) 指出 , 胚性细胞与其周围组织之间生理上的隔离是其进行体胚发生的先决条
件。在本研究中也观察到芸芥胚性细胞在开始分裂时形成较清晰的细胞界限 , 在多细胞阶段体胚边缘
具有较厚的细胞壁与其它细胞隔开。
关于植物体细胞胚胎是起源于单细胞还是多细胞的问题一直存在不同的看法 , 一般认为体细胞胚
胎起源于单细胞或胚性细胞。Button和 Botha (1975) 用果胶酶处理柑橘的愈伤组织 , 使细胞解离 ,
再用微孔筛过滤 , 除去未完全解离的细胞团后培养单个细胞 , 最后得到体胚 , 由此证明体胚来源于单
个细胞。但也不能完全排除由多细胞构成体胚的可能性 , 如 Steward等 (1958) 在胡萝卜中就观察到
在悬浮培养的细胞团中出现了一些由一圈形成层状细胞包围的小细胞团 , 与合子胚发育的球形胚阶段
很相似 , 并由此可分化出体细胞胚胎。Halperin (1964) 指出体细胞胚胎可能由胚性细胞复合体的全
部或一部分细胞构成 , 这些胚性细胞团或胚性细胞复合体原来有可能是由单个细胞多次连续分裂生成
的 , 只不过在产生体胚前经历了一个无序的分裂形成胚性细胞复合体的过程 , 但仍然可以认为体细胞
胚胎起源于单细胞。我们的研究认为 , 芸芥体细胞胚胎的发生起源于单个细胞 , 这为单细胞起源的体
胚发生方式提供了又一个例证 , 并表明这种起源方式具有一定的普遍性。
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