全 文 ：园 艺 学 报 2006, 33 (1) : 140～142
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2005 - 06 - 30; 修回日期 : 2005 - 07 - 28
基金项目 : 国家 ‘863’计划项目 (2002AA207012、2001AA241121) ; 农业部蔬菜遗传与生理重点开放实验室资助项目
黄瓜果实苦味 B t基因的 AFL P分子标记
顾兴芳 1 张素勤 1, 2 张圣平 1
(1 中国农业科学院蔬菜花卉研究所 , 北京 100081; 2 西北农林科技大学园艺学院 , 杨凌 712100)
摘 要 : 运用 AFLP技术 , 采用集群分析法 (BSA) 进行与黄瓜果实苦味基因连锁的分子标记的研究 ,
找到了与苦味基因连锁的两个显性 AFLP标记 : E23M662101和 E25M652213。这两个标记与 B t基因的遗传
距离分别为 5 cM和 4 cM , 分别位于 B t基因的两侧。该标记可用于无苦味黄瓜的分子标记辅助育种。
关键词 : 黄瓜 ; 果实苦味 B t基因 ; AFLP标记
中图分类号 : S 64212 文献标识码 : A 文章编号 : 05132353X (2006) 0120140203
The AFL P M arkers L inked w ith the B itter Fru it Gene ( B t) in Cucum ber
Gu Xingfang1 , Zhang Suqin1, 2 , and Zhang Shengp ing1
(1 Institu te of V egetables and F low ers, Ch inese A cadem y of A gricultural Sciences, B eijing 100081, Ch ina; 2 College of Horticul2
ture, N orthw est Sci2Tech U niversity of A gricu lture and Forestry, Yang ling 712100, China)
Abstract: AFLP biotechnology was app lied to identify the markers linked to B t gene based on BSA meth2
od. Two dom inant AFLP markers E23M662101 and E25M652213 were screened firstly in home and abroad.
The bitter fruit F2 p lants possessed 101 bp and 213 bp fragments, but the bitterfree F2 p lants not. The genetic
distance of E23M662101 and E25M652213 was 5 cM and 4 cM respectively, and two markerswere two sides of
B t gene. The AFLP markers can be used for marker2assisted selection.
Key words: Cucumber; B t gene; AFLP marker
1 目的、材料与方法
目前检测黄瓜苦味的方法多为感观品尝和化学检测。化学检测虽可检测大批材料但较为繁琐 , 其
结果也不够准确 ; 感观品尝仅适于少量材料的检测 , 并且无法进行精确定级〔1〕。本研究中采用集群
分析法 ( bucked segregant analysis, BSA ) 和高通量的 AFLP ( amp lified fragment length polymorphism )
分析技术 , 筛选与黄瓜苦味紧密连锁的 AFLP标记 , 可在苗期或直接用种子进行鉴定 , 简工节本 , 大
大缩短育种进程 , 为分子标记辅助育种和基因克隆奠定基础。
供试黄瓜材料 931和 932来自中国农业科学院蔬菜花卉研究所 , 931含果实苦味显性 B t基因 , 是
从荷兰温室品种与国内杂交种杂交后代自交分离选育出的纯合自交系 , 932含其隐性无苦味 bt基因 ,
是从国内华北型杂交种中自交分离而成的纯合自交系 , 以 931为母本 , 932为父本配制 F1 , 自交获得
F2 群体。
AFLP引物、接头由上海生工生物工程公司合成 ; Taq DNA polymerase购自 Shanghai Promega公
司 ; M seⅠ和 EcoRⅠ购自 NEW ENGLAND B ioLabs公司 ; dNTP购自 TOYOBO公司 ; T4 DNA L igase、
Agarose Gel DNA Purification Kit Ver 210购自宝生物工程 (大连 ) 有限公司 ; pBR322 DNA /M sp Mark2
ers、克隆试剂盒购自北京天为时代科技有限公司。
试验于 2003～2004年在中国农业科学院蔬菜花卉研究所试验温室及农业部 “蔬菜遗传与生理重
点开放实验室 ”完成。将亲本、F1 和 F2 播种于温室中 , 亲本和 F1 各 30株 , F2 129株。苗期常规管
1期 顾兴芳等 : 黄瓜果实苦味 B t基因的 AFLP分子标记
理 , 定植后前期夜温控制在 12℃以下 , 后期昼温高于 32℃, 整个生长期控水 , 并增施氮肥 , 诱使苦
味基因充分表达。采用口尝的方法鉴定果实中是否含有苦味素 , 每株从根瓜开始直到拉秧 , 由 3位苦
味敏感者品尝。
AFLP分析 DNA 用量少 , 采用快速少量 DNA 提取方法。选取果实有苦味和无苦味的 F2 单株
DNA , 组成苦味组和无苦味组 , 每组内以单株为单位进行 AFLP分析。在 Vos等〔2〕的 AFLP分析基础
上优化。黄瓜基因组的酶切采用 M seⅠ和 EcoRⅠ内切酶 , 选择性扩增结束后加入 6μL的载样缓冲液 ,
95℃变性 5 m in后迅速置于冰上 , 在 6%的变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳分离 , 银染法进行染色。
分子标记筛选及验证 : 先用两个亲本筛选引物 , 然后分别以 6株苦味组和不苦组单株 DNA为模
板 , 用两亲本间产生多态性的引物进行果实苦味基因标记的筛选 , 只要组内 5株单株带型一致 , 即初
步认为该标记与果实苦味基因连锁 , 接着用该引物对整个 F2 群体和群体之外的黄瓜材料进行验证 ,
统计条带的分离情况 , 计算标记与苦味基因间的连锁距离。
目标条带的回收纯化、克隆与测序 : 从聚丙烯酰胺凝胶上挖下目标条带 , 放入 115 mL的离心管
中 , 用 30～50μL超纯水常温浸泡 24 h, 接着 95℃水浴锅里煮 30 m in, 5 000 r/m in离心 3 m in, 取上
清液 3μL做模板 , 采用选扩体系和程序进行扩增。目的片段的纯化、与载体的连接和转化参照
TaKaRa的 Agarose Gel DNA Purification Kit Ver 210和北京天为时代克隆试剂盒说明书进行。任意挑选两
个目的片段的白色单菌落克隆各 10个 , 进行 LB液体培养基 (100μg/mL氨苄青霉素 ) 摇荡菌液过夜培
养 , 同时用灭菌枪头蘸取少许对应的克隆菌液放入 PCR扩增体系中进行扩增。PCR产物经 1%琼脂糖凝
胶电泳检测 , 挑选与插入片段大小一致的克隆 , 送上海生工生物工程技术服务有限公司测序。
2 结果分析与讨论
211 黄瓜果实苦味的遗传分析
129株 F2 单株中苦味的 100株 , 不苦的 29株 , 经适合性测验符合 3∶1的分离比例 (X2c = 01313 <
X20105, 1 = 3184) , 说明黄瓜果实苦味是由单基因控制 , 苦味相对不苦为显性 , 进一步证实了原有研究结
果〔3〕的正确性。
212 黄瓜果实苦味基因分子标记的筛选
筛选了 272对引物组合 , 选出在双亲产生多
态性的 34对引物组合 , 对苦味组和不苦组的各 6
株单株进行检验 , 获得了两个显性标记 : E23M662
101和 E25M652213。这两个标记与黄瓜果实苦味 B t
基因共分离 , 其碱基序列为 , E23: 5pi2GACTGCG2
TACCAATTCTA23pi; M66: 5pi2GATGAGTCCTGAGTA2
AGAT23pi; E25: 5pi2GACTGCGTACCAATTCTG23pi;
M65: 5pi2GATGAGTCCTGAGTAAGAG23pi。
213 分子标记的验证
用 E23M662101和 E25M652213对组外其它 F2
单株进行验证 , 在 129株 F2 单株中均有 7株发生
了交换 , 并且 E23M662101和 E25M652213两标记
在相同的两株上同时发生了交换 , 此结果表明这
两个标记是连锁的。经 JO INMAP 310 计算 ,
E23M662101和 E25M652213与苦味基因的遗传距
离分别为 5 cM和 4 cM , 并且分别位于苦味基因
的两侧。经适合性测验 , E23M662101和 E25M652 图 1 E23M 662101在部分 F2 单株中的验证931: 苦味亲本 ; 932: 不苦亲本 ; 1～10: 苦味单株 ;11～20: 不苦单株 ; M: marker; 箭头指示标记带。F ig. 1 Ver if ica tion of pr im er E23M 662101 in F2 Plan ts931: bitter parent; 932: non2bitter parent; 1 - 10: bitter p lants;11 - 20: non2bitter p lants; M: marker; arrow indicatesthe marker band.
141
园 艺 学 报 33卷
参考文献 :
1 顾兴芳 , 方秀娟 , 张孟玉 , 张天明. 黄瓜苦味研究进展. 园艺学报 , 2000, 27 (增刊 ) : 504～508
Gu X F, Fang X J, ZhangM Y, Zhang T M. Review of the advances in research on the bitterness of cucumber. Acta Horticulturae Sinica,
2000, 27 ( supp l. ) : 504～508 ( in Chinese)
2 Vos P, Hogers R, B leekerM. AFLP: a new technique for DNA fingerp rinting. Nucl. Acids Res. , 1995, 23: 4407～4414
3 顾兴芳 , 张圣平 , 国艳梅. 黄瓜苦味遗传分析. 园艺学报 , 2004, 31 (5) : 613～616
Gu X F, Zhang S P, Guo Y M. Inheritance of bitterness in cucumber. Acta Horticulturae Sinica, 2004, 31 (5) : 613～616 ( in Chinese)
241