全 文 ：园 　艺 　学 　报 　2007, 34 (4) : 999 - 1002
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2006 - 11 - 15; 修回日期 : 2007 - 03 - 22
基金项目 : 国家自然科学基金项目 (30671441) ; 国家转基因植物专项项目 (JY042B202)3 通讯作者 Author for correspondence ( E2mail: rschan@ cau1edu1cn)
苹果 M xIrt1基因的克隆与原核表达
王　忆 , 戚金亮 , 许雪峰 , 李天忠 , 孔　瑾 , 韩振海 3
(中国农业大学农学与生物技术学院 , 北京市果树逆境生理与分子生物学实验室 , 北京 100094)
摘 　要 : 根据植物 IRT ( Iron Regulated Transporter) 家族的功能保守区设计引物 , 通过 RACE法从缺铁
胁迫处理的小金海棠根系 cDNA 文库中克隆得到了 Fe2 +转运蛋白基因 cDNA 全长 , 将其命名为 M xIrt1
(M alus x iaojinensis Iron regulated transporter 1)。将 M xIrt1 cDNA片段与 pET30a构建原核表达载体 pE Irt, 转
化大肠杆菌 BL21。SDS - PAGE电泳检测结果表明 , 以 30℃、015 mmol·L - 1 IPTG诱导该基因表达效果最
好 , 诱导产物为一个 40 kD的蛋白。为进一步纯化和鉴定目的蛋白提供了试验基础。
关键词 : 苹果 ; 小金海棠 ; Fe2 +转运蛋白 ; 基因克隆 ; 原核表达
中图分类号 : S 66111　　文献标识码 : A　　文章编号 : 05132353X (2007) 0420999204
C lon ing and Prokaryotic Expression of Apple M xIrt1 Gene
WANG Yi, Q I J in2liang, XU Xue2feng, L I Tian2zhong, KONG J in, and HAN Zhen2hai3
( Fru it S tress Physiology and M olecu lar B iology L aboratory of Fru it Tree, College of A griculture and B iotechnology, China A gri2
cu ltura l U niversity, B eijing 100094, China)
Abstract: A Full length cDNA of M xIrt1 gene from the iron2stressed root cDNA library of M alus x iao2
jinensis Chent et J iang was cloned using the RACE method with p rimers designed based on the conserved do2
main sequences of p lant IRT gene fam ilies. The recombinant p rokaryotic exp ression vector pE Irt was construc2
ted using vector pET30a. Restriction endonuclease analysis, PCR amp lifying and sequencing confirmed that
the construction was correct and had no base mutant. The p rokaryotic exp ression analysis was carried out
through transformation of E1coli (BL21). The SDS - PAGE electrophoresis analysis showed that the best ex2
p ression was induced by 30℃ and 015 mmol·L - 1 IPTG, under which a 40 kD recombinant p rotein was p ro2
duced. These results will p rovide a foundation for further purifying and identifying objective p rotein.
Key words: App le; M alus x iaojinensis; Fe2 + 2transporter; Gene cloning; Prokaryotic exp ression
1986年 Romheld和 Marschner首先提出高等植物在长期适应缺铁胁迫过程中逐渐形成两种适应性
机理。在缺铁胁迫的条件下 , 机理 I型植物可通过激活 H + 2ATPase使土壤酸化 ( Guerinot & Yi,
1994) , 并通过特异的根部还原酶将 Fe3 +还原成 Fe2 +之后通过 Fe2 +转运蛋白 ( transporter) 跨膜转运
入植物根部。
人们首先从拟南芥中克隆到 Fe2 +转运蛋白基因 ( Eide et al. , 1996) , 之后又陆续在番茄、水稻
等植物中克隆到同源基因 (Mori, 1997; Eckhardt et al. , 2001)。果树 , 由于其生长周期长 , 遗传背
景复杂等原因 , 使得在基因研究方面相对滞后。小金海棠是苹果属植物中的一种铁高效基因型 (Han
et al. , 1994)。本研究的目的是克隆小金海棠 Fe2 +转运蛋白基因 , 为研究果树铁转运机理以及应用功
能基因奠定基础。
园 　　艺 　　学 　　报 34卷
1　材料与方法
所用材料为苹果砧木小金海棠 (M alus x iaojinensis Cheng et J iang) , 经组织培养生根后 , 在营养液
中生长。工程菌 E1coli, DH5α, BL21及质粒 pET230a ( + ) 由本实验室保存。克隆载体 pGEM 2T、
回收试剂盒及各种限制性内切酶、DNA聚合酶、 IPTG、X2gal等均为大连宝生物公司产品。引物合成
及测序均由上海生工生物工程技术服务有限公司提供。
根据 GenBank中公布的 Fe2 + 转运蛋白基因家族的功能保守区域设计一对常规 PCR 引物 P1:
CAGCTTCTCCGTTATCGTGT和 P2: AACTTCAAGCCCATTTAGCC, 以提取的小金海棠缺铁胁迫处理的
根系 cDNA文库的λDNA为模板进行扩增、测序后 , 根据 cDNA片段序列 , 分别设计 3′和 5′端引物
P3: TTGAAGTTCGGGTAAATCGG, P4: ACACGATAACGGAGAAGCAG; 并设计载体上的筛选扩增引
物 P5: ATACGACTCACTATAGGGCCAATT, P6: CTCGGGAAGCGCGCCATTGTGT。使用 P3、P5及 P4、
P6分别对扩增条带进行 3′和 5′端的 RACE扩增 , 拼读出 cDNA全长并进行常规 PCR扩增得到小金海
棠 Fe2 +转运蛋白基因全长 cDNA。PCR产物回收后与 pGEM 2T连接转化 DH5α, 得到重组子并进行质
粒测序。
挑取阳性克隆 , 利用引物 P7: GCGCGGATCCATGGCTGCCACCAAGTCAC和 P8: GCGACTCGAGAGC2
CCACTTTGCCAATAC扩增并引入 B am HⅠ及 XhoⅠ位点。双酶切扩增片段及载体 pET230a后进行连接 ,
得到重组子 , 命名为 pE Irt。将其与 pET230a ( + ) 分别并转化 BL21菌株 , 对转化子进行测序。挑取
pE Irt阳性克隆及 pET230a ( + ) 接种于 LB液体培养基中 ( Km 50 mg·mL - 1 ) , 37℃振荡培养过夜。
以 1∶100的比例接种于 20 mL LB液体培养基中 , 30℃及 37℃分别培养至 OD600为 015时加入 IPTG浓度
至 015 mmol·L - 1及 110 mmol·L - 1。诱导 0～7 h, 每小时取 1 mL菌液进行离心收集。沉淀用 100μL
1 ×SDS加样缓冲液重悬后煮沸 5 m in, 经 12 000 r·m in - 1离心 1 m in, 取 25μL上清液进行 SDS -
PAGE电泳检测。凝胶用考马斯亮蓝 R2250染色并脱色至背景清晰。
2　结果与分析
211　M xIrt1基因的克隆与序列比较
以提取的小金海棠缺铁胁迫处理的根系 cDNA文库的λDNA为模板 , 扩增出 490 bp的单一特异
性条带 (图 1)。
回收纯化 PCR产物后经测序并进行序列同源性比较表明 , 该 cDNA片段与番茄和豌豆的该家族
基因分别具有 86%和 84%的氨基酸序列同源性 , 证明该扩增产物是 Fe2 +转运蛋白家族基因片段 , 为
进一步通过 RACE法克隆其 cDNA全长序列提供了前提条件 (图 2)。
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　4期 王 　忆等 : 苹果 M xIrt1基因的克隆与原核表达 　
　　根据 3′和 5′RACE测序结果拼读出的小金海棠 Fe2 +转运蛋白基因的 cDNA全长序列为 1 398 bp,
命名该基因为 M xIrt1 ( GenBank登陆号 : 193886)。
对该序列进行分析表明 , 该序列含有一个编码 364个氨基酸的完整阅读框架 , 且起始密码子上游
有一终止密码。由此证明 5′RACE扩增产物序列是完整的 5′末端序列 , 也由此证明拼读出的序列就是
小金海棠 Fe2 + -转运蛋白基因的 cDNA全长序列。
根据 3′和 5′RACE序列拼读出的全长序列 , 设计引物并扩增出 M xIrt1 cDNA完整编码区构建入克
隆载体 pGEM 2T。
212　M xIrt1基因原核表达载体 pE Irt的构建
PCR扩增 M xIrt1 cDNA后 , 得到约 1 100 bp包含启动子及去除 TAA终止子的基因片段。将其与
pET230a ( + ) 质粒分别用 B am HⅠ和 X hoⅠ双酶切 , T4连接酶连接 , 构建重组质粒 pE Irt (图 3)。
图 3　pE Irt质粒的构建策略
F ig. 3　Con struction of pla sm id pE Irt
对其进行酶切鉴定和测序 (图 4) , 证实重组质粒的外源基因插入正确 , 并与其后载体上 6个
H is2Tag正确融合。
图 4　pE Irt酶切鉴定
F ig. 4　Restr iction enzym e iden tif ica tion of pE Irt
1. DNA marker; 2. pE Irt/B am HⅠ + X hoⅠ; 3. pET/ B am HⅠ + XhoⅠ; 4. M xIrt1 PCR; 5. pE Irt p lasm id.
213　M xIrt1基因的原核表达与 SD S - PAGE分析
对 pE Irt进行原核表达发现 , 1 mmol·L - 1 IPTG进行诱导时 , 37℃诱导 6 h以上均未出现特异条
带。改变诱导温度 , 30℃诱导 6 h可以看到目的蛋白大小处 (约 40 kD ) 出现微弱蛋白表达量的增
加。改变诱导物 IPTG浓度至 015 mmol·L - 1 , 30℃下 , 1 h后即可以见到相应蛋白条带大量表达 (图
5) , 随着诱导时间的增加 , 表达产物条带愈加明显。菌液上清液中未见到有目的蛋白表达。
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图 5　M xIrt1基因原核表达 SD S - PAGE电泳
015 mmol·L - 1 IPTG诱导。
F ig. 5　SD S - PAGE ana lysis of the expression of M xIrt1 gene in pET30a vector
Induced by 015 mmol·L - 1 IPTG.
原核表达选用的载体 pET230a ( + ) , 是一种适合植物基因在原核生物中高效表达的质粒载体 ,
外源基因在插入时确保读码框与载体读码框相一致 , 并与载体中自带的 6个 H is2Tag相融合。H is2Tag
融合在 M xIrt1的 C端 , 尽量避免由于外源蛋白的表达影响 M xIrt1蛋白的结构。通过调整 IPTG浓度及
诱导时间、诱导温度 , 预期分子量 40 kD左右的蛋白条带深度有所增加。而用空质粒转化的 BL21菌
体和含有转化子但未经诱导的菌体在该蛋白条带处均未出现此条带 , 因此可以基本确定这一蛋白条带
为表达的融合蛋白。目前 , 应用原核表达获得目的蛋白是比较常规的、大量获得蛋白的有效途径
(Baneyx, 1999)。但由于该蛋白推测为膜蛋白 , 软件分析含有约 7个跨膜结构域 , 因此蛋白表达大多
会以包涵体存在于沉淀当中 , 对今后进一步纯化回收提出了更高要求。由于试验中已使 M xIrt1基因
与 H is2Tag标签融合 , 就可以进一步采用亲和层析通过 N i柱的方法纯化得到蛋白 , 制备抗血清 , 极大
方便了下一步工作的开展 , 如直观地检测基因调控效果、表达情况等。
有报道表明 , 在拟南芥中 IRT家族在调控铁吸收和转运过程中 , 存在两级调控机制 , 即转录水平
和转录后水平 , 尤其在 Zn、Cd过量的情况下发现两者趋势并不相同 (Connolly et al. , 2002)。因此 ,
在苹果中研究 M xIrt1基因 , 其蛋白的获得对于研究基因表达调控是必不可少的。当然 , 对于蛋白提
取难度大的问题 , 也可以选取 M xIrt1基因 3、4跨膜结构之间的一段可变区 , 约 50个氨基酸直接进行
原核表达 , 利用这一段非跨膜区表达蛋白 , 既可避免膜蛋白难提取的问题 , 又因分子量小而易于操
作 , 且同样可以制备抗血清对 M xIrt1进行进一步研究。
References
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Romheld V, Marschner H. 1986. Evidence for a specific up take system for iron phytosidorphore in roots of grasses. Plant Physiol. , 80: 175 - 180.
2001