全 文 ：园 　艺 　学 　报 　2006, 33 (3) : 549～554
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2005 - 07 - 14; 修回日期 : 2005 - 11 - 14
基金项目 : 韩国科学技术厅资助项目 (98204022060125)3 通讯作者 Author for correspondence ( E2mail: hrcui@ zju1edu1cn)
白菜 EST2SSR信息分析与标记的建立
忻　雅 1, 3 　崔海瑞 13 　卢美贞 1 　姚艳玲 1 　金基强 1 　林容杓 2 　崔水莲 2
(1 浙江大学农业与生物技术学院原子核农业科学研究所 , 浙江杭州 310029; 2 忠南大学园艺系 , 大田 305764, 韩国 ;
3 杭州市农业科学研究院生物研究所 , 浙江杭州 310024)
摘 　要 : 数量迅速增加的 EST为开发新的 SSR标记提供了宝贵的资源。本研究对 4 584条白菜 EST进
行了搜索 , 共检索出 474个 SSR, 检出率为 1013% , 包括 40种重复基元。其中二核苷酸和三核苷酸重复单
元的 EST2SSR占主导地位 , 二者出现的频率基本相近 , 占总 SSR的近 83% ; 其它重复类型所占比例均不足
5%。GA和 GAA是二、三核苷酸中的优势重复类型 , 分别占二、三核苷酸重复类型的 7115%和 3715%。
设计了 15对 EST2SSR引物 , 在合适的 PCR反应体系下 , 以构建 EST的白菜自交系 A的 DNA为模板 , 对设
计的 EST2SSR引物进行筛选 , 发现 15对 EST2SSR引物都能扩增出产物。进一步用这些可扩增的引物对 28
个白菜品种进行 PCR扩增 , 发现 7对引物显示多态性 , 占引物总数的 4617%。此结果表明 , 根据 EST建立
EST2SSR标记是一条简便而又有效的途径。
关键词 : 白菜 ; EST; SSR信息 ; 标记
中图分类号 : S 63413　　文献标识码 : A　　文章编号 : 05132353X (2006) 0320549206
Da ta M in ing for SSRs in ESTs and EST2SSR M arker D evelopm en t in Ch i2
nese Cabbage
Xin Ya1, 3 , Cui Hairui13 , Lu Meizhen1 , Yao Yanling1 , J in J iqiang1 , L im Yongpyo2 , and Choi Suryun2
(1 Institu te of N uclear and A gricultural Sciences, College of A griculture and B iotechnology, Zhejiang U niversity, Hangzhou, Zhe2
jiang 310029, Ch ina; 2D epartm ent of Horticu lture, Chungnam N ational U niversity, Taejeon 3052764, Korea; 3B iotechnology
R esearch Institu te, Hangzhou A cadem y of A gricu ltura l Sciences, Hangzhou, Zhejiang 310024, China)
Abstract: Exp ressed sequence tags ( ESTs) , increased rap idly in number recently, are important re2
sources for development of new SSR markers. In this study, 4 584 ESTs of Chinese cabbage were screened and
474 SSR s including 40 kinds of repeat motifs were m ined out, accounting for 1013% of ESTs. D inucleotide
and trinucleotide repeats, with sim ilar frequency and accounting for 83% together in all SSR s, were dom i2
nant, while the frequency for other repeat type is below 5% each. GA and GAA are the most frequent motifs,
accounting fo 7115% and 3715% in dinucleotide and trinucleotide repeats respectively. 15 p rimer pairs for
EST2SSR s were designed. Under a suitable PCR system, p rimers were screened against genom ic DNA of in2
bred line A from which the cDNA library was constructed, and all the 15 p rimer pairs showed the amp lifica2
tion. Then all the p rimers available were subjected to PCR for DNA s from 28 Chinese cabbage varieties and 7
p rimer sets showed polymorphism s, accounting for 4617% of total p rimers tested. Results indicate that it is a
simp le and effective app roach to develop SSR markers based on ESTs.
Key words: Chinese cabbage; EST; SSR information; Marker development
简单重复序列 ( Simp le sequence repeat, SSR) 也叫微卫星 (M icrosatellites)。与其它分子标记技
术相比 , SSR标记具有多态信息含量高、共显性遗传、技术简单、重复性好、特异性强等特点〔1〕, 已
被广泛应用于植物遗传研究和育种实践中。根据建立 SSR标记的序列性质不同 , SSR标记可分为基
因组 SSR ( Genom ic SSR, gSSR ) 和表达序列标签 SSR ( Exp ressed sequence tag SSR, EST2SSR ) 等。
园 　　艺 　　学 　　报 33卷
与 gSSR标记相比 , 从 EST数据库中获得 SSR建立 EST2SSR标记更经济 ; 而且 EST2SSR标记来源于
DNA的转录区域 , 比 gSSR标记通用性更高〔2〕。
EST是指通过从 cDNA文库中随机挑取的克隆进行大规模测序所获得的 cDNA的 5’或 3’端序
列 , 长度一般为 150～500 bp〔3〕。近年来大量快速增长的 EST数据已成为 SSR的重要来源 , 各种植物
中约有 1% ～5%的 EST含有可用于建立标记的 SSR〔4〕。白菜中目前常用的分子标记主要有 RFLP、
RAPD和 AFLP等 , 尽管获得了一些白菜 EST, 我们也建立了一批白菜 EST2PCR标记〔5〕, 但还没有利
用其建立多态性 EST2SSR标记的报道。本研究利用现有的白菜 EST资源 , 对其进行 SSR搜寻和分析 ,
建立了 EST2SSR标记 , 并对其多态性进行分析和评价。
1　材料与方法
111　材料和模板 D NA的提取
所用材料中 11个大白菜品种为自交系 A、自交系 B (韩国忠南大学提供 ) ; 热优 2号、早熟 5
号、10383新、26新 (浙江大学园艺系提供 ) ; 山东四号、蚕白菜、长梗白菜、丰抗 70、丰抗 80
(购自杭州市种子公司 )。18个白菜品种为 GG1、605、38A (浙江大学园艺系提供 ) ; 矮蒲头、红明
青、杭州油冬儿、上海青、苏州青、高华青梗、四月蔓、香港菜心、矮抗青、黄芽 14、绿宝 2号、
矮箕青、上海青菜抗热 605、五月慢、热优 2号青梗 (购自杭州市种子公司 )。把这些种子发芽后取
幼嫩叶片洗净、晾干 , 液氮中碾磨 , 采用改良的 CTAB法提取少量 DNA〔6〕。
112　 EST来源
本研究所用的无冗余 EST共计 4 584条 , 其中 3 011 条是 NCB I的 dbEST数据库 ( http: / /
www1ncbi1nlm1nih1gov/p rojects/dbEST) 2002年 7月前所登记的 , 分别来自白菜的根、花芽、黄化
苗 ; 另外 1 573条由韩国忠南大学园艺系对自交系 A叶片 cDNA测序获得〔7〕。
113　白菜 EST中 SSR信息分析
去除重复 EST和载体序列 , 利用 RepeatMasker ( http: / / repeatmasker1org /cgi - bin / W EBRepeat2
Masker) 程序结合人工搜寻 SSR。搜索 SSR的长度为 : 单核苷酸在 18个以上 , 其它 SSR的核苷酸在
12个以上 , 即二、三、四、五和六核苷酸的最少重复次数分别为 6次、5次、4次、4次、3次以上
(重复 )。对二、三、四、五和六核苷酸重复基元分为完全重复、不完全重复 , 并对搜索出的 SSR的
频率与长度进行统计和分析。
114　EST2SSR引物设计与合成
利用软件 Primer 3 ( http: / / frodo. wi. m it. edu /cgi2bin /p rimer3 /p rimer3_www. cgi) 设计了 15对白菜
EST2SSR引物 , 由上海生工生物技术公司合成 (表 1)。引物设计时考虑的主要参数有 : 引物长度一
般控制在 20～22 bp, GC含量在 40% ～70%之间 , 理论退火温度 ( Tm) 在 59～61℃之间 , 预期产物
长度控制在 150～300 bp之间。
115　PCR体系的建立与合适退火温度的确定
PCR反应体系 (25μL) 包括 PCR缓冲液 (10 mmol/L Tris2HCl, 40 mmol/L KCl, 0108% NP240,
pH 910)、215 mmol/L MgCl2、1 U Taq聚合酶、200μmol/L dNTP、上下游引物各 014μmol/L、60～
100 ng模板 DNA。所用的试剂均购自上海生工生物技术公司。整个反应过程在 PCR Exp ress296 (Hy2
baid) 仪器上进行 , 循环条件是 : 94℃预变性 4 m in, 35个循环 ( 94℃变性 45 s, 合适温度退火 1
m in, 72℃延伸 115 m in) , 72℃延伸 7 m in。各引物对的最适退火温度通过梯度 PCR试验确定。
116　琼脂糖凝胶电泳分离
扩增后的产物加入含有溴酚蓝的上样缓冲液 , 然后通过 310%的琼脂糖凝胶 (含 EB 015μg /mL )
电泳分离 , 检测扩增产物的可用性和多态性。所用的电泳缓冲液为 TBE, 在约 90 V的电压下电泳至
溴酚蓝即将出胶时 , 用 Gis22008凝胶图像系统 (上海天能公司 ) 进行观察、拍照和分析。
055
　3期 忻 　雅等 : 白菜 EST2SSR信息分析与标记的建立 　
表 1　对 15个白菜 EST2SSR设计的引物
Table 1　Pr im ers designed to 15 EST2SSRs of Ch inese cabbage
引物编号
Primer code
重复基元
Repeat motif
来源 EST编号
EST code
预期产物大小
Expected p roduct
size ( bp)
Tm (℃) GC ( % ) 序列 (5’→ 3’)Sequences (5’→ 3’)
EST2SSRP001 (CTG) 24 Num61124002B05 244 59188 45100 AGCTCGTTGGTTCATTTGCT
59152 55100 GCAACCACAGTTACAGCAGC
EST2SSRP002 ( TC) 17 Num51124002A09 213 60108 50100 ACGATGAATCCAGTCAAGGC
59183 45100 TAAAACCCTGTTCGTTTGGG
EST2SSRP003 ( TC) 14 Num1811211002A09 212 60102 50100 TTTCTCCGCCAAGTAGTGCT
60107 50100 GACGGTTACGGAATCGAGAA
EST2SSRP004 (CAT) 7 Num1219002B11 199 60172 45100 TGCTTGCAGAAAGACGAACA
59185 45100 TTGAGCGTAGGCAGGAAAAT
EST2SSRP005 (CATA) 17 Num17112092D06 293 60161 60100 CACGCCTAGCACTGTCTCCT
59193 55100 GGACTCGATGTAGGGGTTGA
EST2SSTP006 ( TTC) 20 Num41117002F11 246 60119 60100 GGCTCCTCGGTTATAGCCTC
59196 50100 ACCAGCTTCCATCCATAACG
EST2SSRP007 ( GA) 38 Num61124002A12 251 59189 50100 TGGATTAAGACCATCCCGAG
59189 55100 AGAAGGAGCTCTTGTGAGCG
EST2SSRP008 ( GA) 22 Num16112092B11 220 60173 55100 AGATTACTGGAGAAGCCGCC
59189 55100 AGAAGGAGCTCTTGTGAGCG
EST2SSRP009 ( GAA) 11 Num 2011211002B03 169 61100 31182 CCAAAACCAATTTTAAATGCGA
59197 60100 GGTGGCAGAGGAGAGCATAG
EST2SSRP010 ( TC) 16 Num1911211002E08 300 60103 45100 AAACCCCCTCAAAATGTTCC
60113 50100 AAGAAACAGCAGAGAGGGCA
EST2SSRP011 ( TTTC) 22 Num1101208002G07 164 60119 50100 CCATATCTTCGGGCTTAGCA
59160 45100 AGCTGATCGAAAGAAAACGC
EST2SSRP012 ( TCTCC) 23 Num31117002H11 275 60100 45100 TTGTTGCTCGAAGCAATGTC
60112 45100 GAAATGCTTGGCCTTGTTGT
EST2SSRP013 ( GAT) 27 Num812012F01 245 58113 45100 TCTTGATGATGACATGGCTG
57112 45100 TTCCTTGTTCTTCTTCCTCG
EST2SSRP014 (CCA) 16 Num1911211002E01 154 59179 45100 CATAAACCCGAACCCAGAAA
59158 50100 AGCATCTTTTCTCCTCGTGC
EST2SSRP015 ( TCCG) 22 BG5444281E2312 183 59155 55100 GAGTCCACGTGGGTTTTCTC
59195 55100 GAGGCAGTCGAAGAAGATGG
2　结果与分析
211　白菜的 EST2SSR发生频率与特点
对来自 NCB I数据库 3 011条和来自韩国忠南
大学 1 573条的共计 4 584条白菜 EST进行了 SSR
搜索 , 结果 (表 2 ) 含 SSR的 EST共计 434条 ,
占总数的 915% ; 含有 474个 SSR, 占全部 EST
总数的 10134%。从发生频率来看 , 二核苷酸和
三核苷酸重复类型占主导地位 , 二者出现的频率
基本相近 , 共占总 SSR的近 83% ; 其它重复类型
所占比例均不足 5% , 按频率高低依次是六核苷
酸重复、单核苷酸重复、五核苷酸重复和四核苷
酸重复。
共观察到 40种重复基元 (不包括类似于转
座子或逆转子中可见到的复杂重复 )。有 2种单
核苷酸重复基元 A /T和 G/C, 但以前者占绝对优
势 (18∶3)。四、五、六核苷酸重复基元出现的
表 2　白菜 EST中 SSR的出现频率
Table 2　Frequency of SSRs occurred in ESTs of Ch inese cabbage
重复类型
Repeat types
基元种数
Number of
motif type
SSR数
SSR
Number
占全部
SSR比例
Proportion in
all SSR s( % )
出现频率
Frequency
( % )
单核苷酸 2 21 　4143 0146
Mononucleotide
二核苷酸 4 200 42119 4136
D inucleotide
三核苷酸 10 192 40151 4119
Trinucleotide
四核苷酸 7 13 　2174 0128
Tetranucleotide
五核苷酸 6 17 　3159 0137
Pentanucleotide
六核苷酸 10 23 　4185 0150
Hexanucleotide
其它 O ther - 　8 　1169 0117
总计 Total 40 474 100100 10134
155
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类型分别为 GAAA、 TCCG、CAAA、CCCA、CA2
TA、 TTGC、 CTTT, TCTCC /GGAGA、 GAAAA、
TAAAA、 TTTAA、 GTTTG、 GAGAA 和 ATGGTG/
CACCAT、 GGAGAA /TTCTCC、 TAAAAA、 CCAT2
CA、 CAAGAA、 TCTCCC、 TGGGGG、 GAACAA、
CAGAGA、CCCCCT, 尽管它们占总重复基元类型
总数的一半以上 , 但各自出现频率都很低 , 而且
各自所占比例相近。二核苷酸和三核苷酸重复基
元约占重复基元总数的 35% , 各重复基元出现频
率及在二苷酸和三核苷酸重复中所占比例见表 3。
从二至六核苷酸重复基元的重复特性来看 ,
白菜 EST2SSR分完全重复、不完全重复两类 , 分
别为 227和 218个 (表 4)。总体上完全重复多于
不完全重复 , 但随各重复基元的核苷酸数目增加 ,
不完全重复所占比例有增大的趋势。白菜 EST中
二至六核苷酸 SSR的平均长度约为 4411 bp, 但
不同 SSR 的长度却有很大差异 , 最短为 12 bp,
而最长的达到了 183 bp, 总体上不完全重复 SSR
的平均长度大于完全重复 SSR的长度。
212　EST2SSR引物筛选
以白菜自交系 A的 DNA为模板 , 对设计的
15对引物进行扩增 , 均对自交系 A产生扩增产物
(表 5)。
为明确所设计引物对其它白菜品种的可用性 ,
以对自交系 A均能扩增的 15对引物用于其它 28
个白菜材料的测试 , 结果为 11对引物在全部 28
个材料中都有扩增产物 , 2对引物在 27个材料中
有扩增 , 另 2对引物在 25个材料中有扩增。引物
表 3　白菜 EST中二核苷酸和三核苷酸重复基元
Table 3　D inucleotide and tr inucleotide repea t m otifs
in ESTs of Ch inese cabbage
重复类型
Repeat types
重复基元
Repeat motif
数量
Number
发生频率
Frequency
( % )
所占比例
Proportion
( % )
二核苷酸 GA /TC 143 3112 71150
D inucleotide AT 49 1107 24150
GT/AC 　5 0111 2150
GC 　3 0107 1150
三核苷酸 GAA / TTC 72 1157 37150
Trinucleotide TCC /AGG 38 0183 19179
CAT 26 0157 13154
CCA /TGG 19 0141 9190
TTG/AAC 16 0135 8133
CGG/CCG 　9 0120 4169
CGA 　5 0111 2160
CTG 　4 0109 2108
TCT 　2 0104 1104
GAT 　1 0102 0152
表 4　白菜 EST中 SSR的重复长度和性质
Table 4　The repea t length and a ttr ibute of SSRs
in Ch inese cabbage ESTs
重复类型
Repeat types
长度 Length ( bp)
变化范围
Variation
平均长度
Average
重复性质 Repeat attribute
完全重复
Perfect
不完全重复
Imperfect
总计
Total
二核苷酸 12～79 2714 116 84 200
D inucleotide
三核苷酸 16～183 5512 88 104 192
Trinucleotide
四核苷酸 21～176 7118 　8 　5 13
Tetranucleotide
五核苷酸 26～152 4017 12 　5 17
Pentanucleotide
六核苷酸 18～174 8217 　3 20 23
Hexanucleotide
合计 Total 12～183 4411 227 218 445
的有效扩增率为 9811% 〔 (28 ×11 + 27 ×2 + 25 ×2) / (28 ×15) 〕。
表 5　15对 EST2SSR引物在 28个白菜不同品种中的扩增情况及其多态性
Table 5　Am plif ica tion s and polym orph ism s showed in 28 d ifferen t var ieties of Ch inese cabbage by 15 pa irs of EST2SSR pr im er
引物编号
Primer code
扩增情况
Amp lifications
多态性
Polymorphism
引物编号
Primer code
扩增情况
Amp lifications
多态性
Polymorphism
EST2SSRP01 AB (25) P EST2SSRP09 AB (27) NP
EST2SSRP02 AB (28) P EST2SSRP10 AB (28) NP
EST2SSRP03 AB (28) NP EST2SSRP11 AB (28) NP
EST2SSRP04 AB (28) P EST2SSRP12 AB (28) NP
EST2SSRP05 AB (25) P EST2SSRP13 AB (28) P
EST2SSRP06 AB (27) P EST2SSRP14 A (28) NP
EST2SSRP07 AB (28) NP EST2SSRP15 AB (28) P
EST2SSRP08 AB (28) NP
　　注 : A. 预期大小片段 ; AB. 同时出现预期大小片段和非预期大小片段 ; P. 有多态性 ; NP. 无多态性。括号内数字为 28个参试
品种中有扩增产物的品种数。
Note: A. Expected size fragment; AB. Appearance of both expected size fragment and unexpected size fragment ( s) ; P. Polymorphism;
NP. None polymorphism. Figures in bracket rep resenting the number of varieties showed amp lification in 28 varieties tested1
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213　EST2SSR标记的多态性
利用以上筛选出的可用白菜 EST2SSR引物 ,
对不同的白菜品种进行了多态性试验。15对 EST2
SSR引物有 7对在 28个白菜品种间揭示出多态性
(表 5) , 占筛选引物总数的 4617%。图 1为引物
EST2SSRP004在不同白菜品种间的多态性扩增情
况。由此不难看出 , 从 EST数据库中建立多态性
EST2SSR标记是可行的。
3　讨论
311　白菜 EST2SSRs的特点
本试验共对 4 584个白菜 EST进行了搜索 ,
图 1　引物 EST2SSR P004在不同白菜品种间的多态性扩增
(从左至右分别为自交系 A、自交系 B、热优 2号、早熟 5号、
605、38A、黄芽 14、矮蒲头、红明青、杭州油冬儿、
上海青、苏州青 )
F ig. 1　Polym orph ism s showed in d ifferen t var ieties of
Ch inese cabbage by EST2SSR pr im er P004
(Left to right: L ine A, L ine B , Reyou 2, Zaoshu 5, 605, 38A,
Huangya 14, A iputou, Hongm ingqing, Hangzhou Youdonger,
Shanghaiqing, Suzhouqing)
发现 474个 SSR, 占 EST序列总数的 10134%。这个比率远高于其他物种 EST数据库中筛选的 SSR比
率 , 如甘蔗的 219%〔8〕、水稻的 417%〔4〕、普通小麦的 514%〔9〕, 这种差异可能是物种间的真实 SSR
信息差异或搜寻 SSR时所用长度最低标准不同造成的。
当 4种不同的碱基随机组合时 , 若 EST2SSR数目足够大且无偏倚性 , 将可能分别产生 2、4、10、
33、102和 350种单、二、三、四、五、六核苷酸基本重复基元类型〔10〕。对白菜 EST2SSR的分析结
果显示 , 单、二和三核苷酸所有的重复基元都有出现 , 但大多数的四、五、六核苷酸重复基元类型未
出现 , 表现出明显的偏倚性。但本研究分析白菜 EST序列数量不足 5 000条 , 所出现碱基偏倚性是白
菜 EST2SSR的真实反映还是由于分析 EST数量较少或者二者兼而有之所造成 , 还需要进一步研究。
甘蔗 EST中三核苷酸重复占 90%以上〔8〕, 普通小麦 EST中三核苷酸 SSR占 6712%〔9〕。而二核苷酸
重复序列在多数植物基因组中分布几率较高〔11〕。但本研究白菜 EST中二核苷酸重复和三核苷酸重复是
主导类型 , 分别占 SSR总数的 42119%和 40151%。这可能与白菜 EST2SSR自身的特点有关。
GA在大多数植物二核苷酸重复中是主导类型。本研究中观察到 GA是白菜二核苷酸重复中出现
频率最高的 (占 7115% ) , 这与 Thiel等〔12〕在大麦和 N icot等〔13〕在小麦 EST2SSR筛选所得到的结果一
致 (分别占二核苷酸重复的 52%和 45% ) , 也与 Kantety等〔4〕和 Morgante等〔14〕对多种不同植物 EST2
SSR综合分析后所报道的结果相符。但在猕猴桃〔15〕中频率最高的二核苷酸重复基元却为 CT
(4513% ) , 其次才是 GA (2513% ) , 在番茄〔16〕中也不是 GA而是 AT频率高。GC重复基元在多数植
物中很难见到 , 在本研究的二核苷酸重复中却观察到了 GC重复基元 , 但频率较低 , 占白菜 EST2SSR
总数的 0121% , 占 EST总数的 0102%。在拟南芥、杏、桃〔17〕、水稻、玉米、大豆〔18〕等植物中未发
现 GC重复 , 而在小麦中不同的研究报道结果却不一致 , 如 Gao等〔18〕报道小麦 EST2SSR中 GC重复只
以很低的频率 (0109 /100kb) 出现 , 但陈军方等〔19〕和 N icot等〔13〕却未发现 GC重复基元。白菜三核
苷酸重复基元中 GAA占主导地位 , 占三核苷酸 SSR总数的 37150% , 与拟南芥中的情形一致 , 而在
水稻、大麦、高粱、玉米中 CCG则是主要三核苷酸重复类型〔4, 18〕, 但在小麦中 , 不同的报道结果却
不一致 , 例如 , N icot等〔13〕报道小麦三核苷酸 SSR中占优势的类型是 CCG, Kantety等〔4〕报道却是
AAC。这种不同物种 EST2SSR主导类型的差异及同一物种中不同报道的结果差异 , 可能是由于各报
道中所用 EST来源和 EST数目不同所致。
312　建立白菜 EST2SSR标记的潜力与局限性
与其它标记相比 , EST2SSR标记有其独特的优越性〔9〕: 可以检测基因组表达区域的多态性 , 可以
从 EST数据库中开发 , 成本相对较低 , 具有较高的通用性。在遗传作图、资源多样性、功能基因的
发现与定位、物种起源与进化和比较基因组学研究等方面都有重要的利用价值〔20, 21〕。
目前 , 在白菜中还没有建立 EST2SSR标记的报道。本研究根据现有的白菜 EST资源 , 在明确了
355
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白菜 EST中的 SSR信息后建立了 EST2SSR标记。是否能显示多态性以及多态性水平的高低 , 是评价
遗传标记的重要指标〔22〕。我们的结果表明 , 在设计的 15对 EST2SSR引物中 , 有 4617%的引物呈现
多态性 , 已显示了较高水平的多态性。另一方面 , 本试验中扩增片段的多态性仅仅是通过琼脂糖凝胶
电泳检测的 , 如果提高分析手段 , 如采用聚丙烯酰胺凝胶电泳 , 呈现多态性引物的比例将会更高。
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