全 文 ：园 艺 学 报 2006, 33 (5) : 1079～1082
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2006 - 01 - 25; 修回日期 : 2006 - 05 - 18
基金项目 : 国家自然科学基金项目 (30370993) ; 国家高技术研究发展计划 (863计划 ) 项目 (2001AA241172)
无核葡萄与中国野生葡萄杂种的胚挽救技术研究
王 飞 王跃进 周建锡
(西北农林科技大学园艺学院 , 陕西杨凌 712100)
摘 要 : 通过无核葡萄与中国野生葡萄杂交 , 获得了 4个杂交组合的后代植株 , 确定了各杂交组合取
胚珠培养的最佳时期。1Flame ×山葡萄 ; 2红宝石 ×爱莫无核 ; 3红宝石 ×北醇 ; 4爱莫无核 ×山葡萄在授
粉后 45 d取样培养效果较佳 ; 5长穗无核白 ×山葡萄授粉后 30 d; 6无核白自交在授粉后 35 d培养效果较
佳。以 N itSchs为基本培养基 , 附加 015 mg·L - 1 62BA + 015 mg·L - 1 GA3 + 215 mg·L - 1 IBA + 011 mg·L - 1
ZT, 适合于 1、3、5号杂交组合 ; 而 015 mg·L - 1 62BA + 015 mg·L - 1 GA3 + 210 mg·L - 1 IBA + 011 mg·L - 1
ZT适合 2、4、6号杂交组合 ; 胚萌发培养基为 210 mg·L - 1 IBA + 110 mg·L - 1 62BA + 012 mg·L - 1 GA3 , 适
合 1、2、3、5、6号杂交组合 , 而爱莫 ×山葡萄在 115 mg·L - 1 IBA + 110 mg·L - 1 62BA + 012 mg·L - 1 GA3
培养基上表现较佳 , 生根培养基为 1 /2MS基本培养基添加 0115 mg·L - 1 IBA + 0102 mg·L - 1 62BA, 它适合
1号与 5号组合 , 0110 mg·L - 1 IBA + 0102 mg·L - 1 62BA适合 4号与 6号组合。
关键词 : 无核葡萄 ; 中国野生葡萄 ; 杂种 ; 胚挽救
中图分类号 : S 66113 文献标识码 : A 文章编号 : 05132353X (2006) 0521079204
Breed ing Technology of Em bryo Rescue in Seedless Grape w ith Ch inese w ild
Grape
W ang Fei, W ang Yuejin, and Zhou J ianxi
(N orthw est Science and Technology U niversity of A gricu lture and Forestry, Yang ling, Shaanxi 712100, China)
Abstract: Through crossing between seedless grapes and Chinese wild grapes we got four group hybrid
grape seedlings. The best time to harvest the hybrid grapes ovule for embryo rescued were as follows: 45 d af2
ter pollination are ( 1) Flame seedless with V itis am urensis, ( 2 ) Ruby seedless with O lmo seedless, ( 3 )
Ruby seedless with Beichun, (4) O lmo seedless with V itis am urensis; 30 d after pollination is (5) Changsui
saltanina seedless with V itis am arensis; 35 d after pollination is (6) Self2pollinated saltanina. N istschs medi2
um with additional 015 mg·L - 1 62BA + 015 mg·L - 1 GA3 + 215 mg·L - 1 IBA + 011 mg·L - 1 ZT was suit2
able for cross (1) , (3) and (5) , butN istschsmedium with additional 015 mg·L - 1 62BA + 015 mg·L - 1
GA3 + 210 mg·L - 1 IBA + 011 mg·L - 1 ZT was suitable for cross (2) , (4) and (6). For embryo regener2
ation N istschs medium with additional 210 mg·L - 1 IBA + 110 mg·L - 1 62BA + GA3 012 mg·L - 1 was suit2
able for cross (1) , (2) , (3) , (5) and (6) , but for cross (4) medium with 115 mg·L - 1 IBA + 012 mg
·L - 1 GA3 + 110 mg·L - 1 62BA wasmore suitable. 1 /2 MS medium adding 0115 mg·L - 1 IBA + 0102 mg·
L - 1 62BA were suitable for cross (1) and (5) to acquire embryo rescue p lants, but 1 /2MS medium with addi2
tion 011 mg·L - 1 IBA + 0102 mg·L - 1 62BA was suitable for cross (2) and (4).
Key words: Seedless grape; Chinese wild grape; Hybrid; Embryo rescue
1 目的、材料与方法
近年来 , 选育大粒、优质、抗病的无核葡萄新品种已成为葡萄育种的重要目标〔1〕。通过胚培养
获得较多的无核葡萄植株〔2～5〕, 但用无核葡萄与抗性强的中国野生葡萄杂交 , 通过胚挽救获得植株的
园 艺 学 报 33卷
报道较少。本试验采用与前人不同的无核葡萄与中国野生葡萄杂交组合 , 采用种间杂交 , 如红光无核
×山葡萄 , 爱莫无核 ×山葡萄 , 长穗无核白 ×山葡萄 , 红宝石 ×北醇 ; 无核葡萄品种间杂交 , 组合为
红宝石 ×爱莫及自交组合无核白 ×无核白 , 根据胚的发育特点进行胚挽救 , 创造新的葡萄种质资源。
试验于 2001年在新疆鄯善瓜果研究所葡萄种质资源圃进行 , 在葡萄开花前去雄 , 用中国野生葡萄的
花粉授粉 3次并套袋 , 在授粉后 30、35、40、45、50 d分别采回果穗 , 培养 40 d后转移到胚萌发培
养基上 , 萌发后改用 1 /2MS培养基。材料与培养基成分见表 1和表 2。
表 1 各杂交组合特点
Table 1 The character of d ifferen t crosses com b ina tion
代号
Code
杂交组合
Cross combination
母本特性
Character of maternal
父本特性
Character of paternal
1 红光无核 ×山葡萄 Flame ×V. am urensis Rup r 无核 ,浆果为红色 ,糖度高 有核 ,浆果为绿色 ,抗炭疽病和抗寒
2 红宝石 ×爱莫无核 Ruby ×O lmo seedless 无核 ,浆果为红色 ,品质好 无核 ,浆果为绿色 ,果实糖度高
3 红宝石 ×北醇 Ruby ×Beichun 无核 ,浆果为红色 ,品质好 有核 ,浆果为绿色 ,抗寒性强
4 爱莫无核 ×山葡萄 O lmo seedless ×V. am urensis Rup r 无核 ,浆果为绿色 ,糖度高 有核 ,浆果为绿色 ,抗炭疽病和抗寒
5 长穗无核白 ×山葡萄 Long2bunch sultanina ×V. am urensis Rupr 无核 ,浆果为绿色 ,穗长品质好 有核 ,绿色 ,抗炭疽病和抗寒
6 无核白自交 Self2pollnation of saltanina 无核 ,果绿色糖度高 ,适应性强 无核 ,绿色 ,糖度高 ,适应性强
表 2 培养基组成 3
Table 2 Com position of m ed ia
基本培养基
Media
编号
Code
62BA
(mg·L - 1 )
IBA
(mg·L - 1 )
GA
(mg·L - 1 )
ZT
(mg·L - 1 )
糖
Sugar
( g·L - 1 )
琼脂
TC agar
( g·L - 1 )
酪蛋白
Casein hydrolysate
( g·L - 1 )
PVP
( g·L - 1 )
N itschs胚挽救 A1 015 115 015 011 60 615 015 012
Embryo rescue A2 015 210 015 011 60 615 015 012
A3 015 215 015 011 60 615 015 012
N itschs胚萌发 B1 110 110 012 - 30 610 013 011
Embryo germation B2 110 115 012 - 30 610 013 011
B3 110 210 012 - 30 610 013 011
1 /2MS成苗 C1 0102 0120 - - 20 610 - -
1 /2MS regeneration C2 0102 0115 - - 20 610 - -
C3 0102 0110 - - 20 610 - -
3 : pH 518
2 结果与分析
211 不同接种时间对胚珠离体培养的影响
从表 3可知 , 1～4号杂交组合取胚珠培养的
时间为授粉后 40、45、50 d, 而 5、6号杂交组合
取胚珠培养的时间在授粉后的 30、35、40 d。前
者无论从胚珠的发育还是萌发来看 , 45 d的效果
明显优于 40 d和 50 d, 经方差分析和多重比较 4
个杂交组合取胚珠培养的时间 45 d极显著好于 40
d, 显著好于 50 d。而 5号组合则是在授粉后 30 d
取胚珠培养效果优于 35 d和 40 d的 , 6号组合在
授粉后 35 d的培养效果优于 30 d和 40 d的。从
表 3还可看出 , 1、4、5号父本同是山葡萄 , 但
母本不同 , 后代胚珠培养的最佳时间不同 , 1、2
号为 45 d, 而 5号为 30 d。2、3号母本同是红宝
石 , 但父本不同 , 它们取胚珠培养的最佳时间为
表 3 接种时间对胚珠离体培养的影响
Table 3 The effect of inocula ted tim e on v itro ovules cultured
代号
Code
接种时期
Inoculated
date ( d)
胚珠接种数
No. of ovules
cultured
胚珠发育率
Development
percentage ( % )
萌发率
Germ ination
percentage ( % )
1 40 88 3118 1412
45 96 6315 4519
50 94 3112 2816
2 40 90 2812 0
45 92 6310 314
50 88 3410 0
3 40 90 2617 0
45 90 5111 1110
50 96 3916 513
4 40 80 3012 810
45 100 6010 5313
50 92 3911 3015
5 30 101 4915 5210
35 95 2914 711
40 98 1513 1313
6 30 85 2710 4314
35 91 6617 5219
40 86 4412 3412
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5期 王 飞等 : 无核葡萄与中国野生葡萄杂种的胚挽救技术研究
45 d, 说明无核葡萄与有核葡萄或无核葡萄之间杂交时 , 母本的选择对取样培养影响较大。
212 不同胚挽救培养基对无核葡萄及其杂交胚珠培养的影响
表 4显示了不同胚挽救的培养基配方对 6个杂交组合的胚珠发育结果的影响 (胚珠发育是指胚珠
个体由小到大 , 体积与重量增大 2～3倍 , 颜色深绿且饱满 ) , 经方差分析和多重比较 , 不同生长调
节剂处理达极显著差异 , A2、A3与 A1相比表现显著差异 , 但 A2与 A3之间无显著差异 , 6个杂交组
合中 , 1、3两组合在 A3培养基发育率 (分别为 7719%和 5615% ) 比 A2 (分别为 4118%和 2415% )
和 A1 (分别为 2510%和 3414% ) 的效果好。而 2、4、5、6号组合在 A2培养基上胚珠发育效果好。
表 4 不同生长调节剂处理对离体胚珠发育和萌发的影响
Table 4 Influence of d ifferen t growth regula tors on v itro ovules developm en t and germ ina tion ( % )
代号
Code
发育率 Development percentage
A1 A2 A3
萌发率 Germ ination percentage
B1 B2 B3
1 2510 (92) 4118 (91) 7719 (95) 211 (48) 1916 (46) 4019 (44)
2 3310 (85) 5515 (90) 4110 (95) 0 (47) 416 (44) 813 (36)
3 3414 (90) 2415 (94) 5615 (92) 0 (40) 213 (44) 819 (45)
4 3616 (93) 5414 (90) 4513 (92) 613 (48) 5615 (46) 2812 (46)
5 3317 (98) 5613 (96) 2810 (100) 119 (54) 3613 (55) 910 (55)
6 2510 (88) 7117 (85) 4216 (89) 613 (62) 1516 (64) 2514 (63)
注 : 括号内为接胚数。
Note: The number in bracket is No. of ovules cultured.
表 4经方差分析和多重比较 , 在 B培养基上萌发率较高的为 4 > 1 > 6杂交组合 , 平均萌发率分别
为 3013%、1716%与 1319% , 其次为 5 > 3 > 2杂交组合 , 不同处理间差异显著 , B3显著大于 B1与
B2, B1与 B2无差异。3号与 2号杂交组合胚的萌发率较低 , 均不到 10% , 可能是由于培养基配方不
适合 3、2号组合 ; 或与母本红宝石的遗传特性或其它生理原因有关〔7〕, 值得进一步探讨。
213 不同植物生长调节剂的 1 /2M S培养基对杂种成苗的影响
从表 5可知 , 6个杂交组合中 , 1、4、5、6
号组合最后形成苗子 , 通过方差分析和多重比较 ,
杂交组合间达到极显著差异 , 2、3组合成苗率为
0, 极显著低于其它 4个杂交组合 , 成苗数最多的
为 1号组合 , 其次为 4 > 5 > 6号组合。不同植物
生长调节剂间 , C2处理要好于 C1与 C3处理 , 笔
者将 2、3组合萌发的芽子接到成苗培养基上 , 培
养一周后 , 芽子顶部先变褐 , 然后向下延续 , 随
后整个芽子变褐死亡 , 其原因可能是 1 /2MS成苗
培养基不适合 2与 3号组合。
表 5 不同生长调节剂培养基对不同杂交组合成苗的影响
Table 5 The effect of d ifferen t growth regula tors
on established plan ts of d ifferen t cross ( % )
代号
Code
成苗率 Establishment percentage
C1 C2 C3
1 5313 (15) 92 (12) 6115 (13)
2 0 (3) 0 (3) 0 (2)
3 0 (3) 0 (5) 0 (4)
4 4218 (14) 4010 (15) 8310 (12)
5 7010 (10) 7217 (11) 2510 (12)
6 3614 (11) 5010 (8) 6010 (10)
注 : 括号内为接芽数。
Note: The number in bracket is No. of buds cultured.
3 讨论
利用无核葡萄的优质、丰产、大粒和中国野生葡萄的抗性强等特点进行杂交 , 目的是从后代选出
无核优质、抗性强的葡萄新品种和种质资源。但假单性结实的无核葡萄作为母本与有核葡萄杂交存在
着胚败育现象 , 通过胚挽救技术可克服胚败育 , 提高胚萌发及成苗〔2, 3, 5〕, 但胚挽救效果〔6～9〕受杂种
胚败育时间、胚挽救技术等因素影响。因此 , 确定胚挽救最佳接种时间是成功的关键〔4, 7〕, 不同的杂
交组合 , 其胚败育时期、机理不同。Flame ×山葡萄、红宝石无核 ×爱莫无核、红宝石 ×北醇、爱莫
无核 ×山葡萄在授粉后 45 d取样培养效果优于 40 d或 50 d, 而长穗无核白 ×山葡萄为授粉后的 30 d,
无核白自交为授粉后的 35 d培养效果优于其它时间。接种太早或太迟 , 均不利于胚的挽救 , 接种太
早 , 胚未充分发育 ; 接种太晚 , 胚已死亡。因此确定最佳接种时间应在胚发育程度最高 , 存活率最高
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园 艺 学 报 33卷
时进行培养 , 从细胞解剖学上研究则是在心形胚中后期进行培养效果较佳〔8, 10〕, 此时 , 胚挽救成功率
较高 , 且培养的苗子健壮 , 移栽成活率高〔11, 12〕。
在胚挽救过程中 , 根据胚的发育与败育特点 , 本研究采用了 3个培养阶段 , 选用了 3类培养基配
方 , 即胚挽救、萌发、成苗培养基 , 胚挽救与萌发培养基 , 均以 N itschs培养基为基础 , 附加不同的
激素处理 , 在第 1阶段胚挽救培养基中 , 由于此时胚发育程度较低 , 基本处于多细胞时期和球形胚时
期 , 属于异养阶段〔8〕, 此阶段胚主要依赖于胚乳及周围的母体组织吸取养分 , 而母体组织又从培养
基中吸取养分 , 所以胚挽救培养基加入了氨基酸含量丰富的酪蛋白和不同配比的激素 , 而且糖浓度
(6% ) 较高 , 目的是防止胚过早萌发 , 使胚处于高渗液的培养基中 , 利于胚的发育与增重〔9〕, 当胚
发育 40 d左右时 , 胚的重量和体积是接种开始的 3～4倍时 , 转入第 2阶段胚萌发培养基中 , 为了促
使胚萌发 , 减少了糖、生长素与酪蛋白的量 , 增加了细胞分裂素 62BA的量 , 目的是促使胚的萌发 ,
一旦芽子萌发 , 将其转移到 1 /2MS培养基上 , 去除细胞分裂素 62BA , 增加生长素 IBA的量 , 利于苗
子快速与健壮生长。
参考文献 :
1 王跃进 , Lam ikanra O. 葡萄无核基因的 PAPD标记的序列分析. 西北农业大学学报 , 1997, 24 (5) : 820～822
W ang Y J, Lam ikanra O. Analysis of sequencing the RAPD marker linked to seedless genes in grape. Acta Univ. Agric Boreali2Occidental2
is, 1997, 24 (5) : 820～822 ( in Chinese)
2 Cain D W. In2ovule embryo culture and seedling development of seeded and seedless grapes. V itis, 1983, 22: 9～14
3 Ramm in D W. The use of embryos culturein fruit breeding. HortScience, 1990, 25 (4) : 395～398
4 David W R, R ichard E, Ronald T. A stenospermocarp ic, seedless V itis vin ifera ×V itis rotundifolia hybrid developed by embryo rescue. Hort2
Science, 2000, 35 (4) : 732～734
5 李桂荣 , 王跃进 , 唐冬梅 , 王西平 , 骆强伟. 无核白胚挽救育种技术研究. 西北植物学报 , 2001, 21 (3) : 432～436
L i G R, W ang Y J, Tang D M, W ang X P, Luo Q W. The studies on embryo rescue techniques of Thomp son seedless grape. Acta Bot. ,
2001, 21 (3) : 432～436 ( in Chinese)
6 赵密珍 , 苏家乐 , 钱亚明 , 王壮伟 , 刁曼妮. 红宝石无核葡萄胚珠培养成苗技术研究. 果树学报 , 2005, 22 (2) : 166～168
Zhao M Z , Su J L, Q ian Y M, W ang Z W , D iao M N. Technology of ovule culture for Ruby seedless grape cultivar. Journal of Fruit Sci2
ence, 2005, 22 (2) : 166～168 ( in Chinese)
7 赵月玲 , 程贯召 , 王汉海. 无核葡萄的育种与胚挽救的应用. 生物学通报 , 2004, 39 (9) : 15～17
Zhao Y L, Cheng G Z, W ang H H. App lication on seedless grapepis breeding and embryo rescue techniques. Bulletin of B iology, 2004, 39
(9) : 15～17 ( in Chinese)
8 王 飞 , 王跃进 , 周会玲 , 万怡震 , 杨进孝. 无核葡萄与中国野生葡萄杂种胚发育的细胞学研究. 西北农林科技大学学报 ,
2005, 33 (3) : 61～66
W ang F, W ang Y J, Zhou H L, W an Y Z, Yang J X. Cytological study of embryo development and abortion in hybrid p rogeny of seedless
grape and Chinese wild grapes. Journal of Northwest Sci2Tech University of Agriculture and Forestry, 2005, 33 (3) 61～66 ( in Chinese)
9 王 飞 , 王跃进 , 万怡震 , 任 杰. 无核葡萄与中国野生葡萄杂种胚败育的某些生理生化变化. 园艺学报 , 2004, 31 ( 5 ) :
651～653
W ang F, W ang Y J, W an Y Z, Ren J. Some physiological and biochem ical changes of embryo abortion in hybrids of seedless grapes and Chi2
nese wild grapes. Acta Horticulturae Sinica, 2004, 31 (5) : 651～653 ( in Chinese)
10 王 晶 , 罗国光. 巨峰葡萄胚和胚乳的发育. 园艺学报 , 1996, 23 (2) : 191～193
W ang J, Luo G G. The embryo and endosperm development in‘Kyoho’grapevines. Acta Horticulturae Sinica, 1996, 23 (2) : 191～193
( in Chinese)
11 陈香波 , 曹孜义. 离体葡萄未成熟胚成苗途径研究. 果树科学 , 2000, 17 (4) : 261～264
Chen X B, Cao Z Y. Studied on the ways for culturing immature embryos of grapevine. Journal of Fruit Science, 2000, 17 (4) : 261～264
( in Chinese)
12 张宏明 , 孟新法 , 张路生. 激素对胚珠离体培养的影响. 北京农业大学学报 , 1990, 16 (3) : 227～282
Zhang H M, Meng X F, Zhang L S. The effect of p lant growth regulators on ovule culture. Acta Agriculturae Universitatis Pekinensis, 1990,
16 (3) : 227～282 ( in Chinese)
2801