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园 　艺 　学 　报 　2006, 33 (3) : 485～490
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2005 - 05 - 20; 修回日期 : 2005 - 08 - 16
基金项目 : 国家自然科学基金资助项目 (30471201)3 通讯作者 Author for correspondence
温州蜜柑线粒体基因的克隆与表达分析
胡志勇　仝　铸　徐　强　伊华林　邓秀新 3
(华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室 , 湖北武汉 430070)
摘 　要 : 根据其它植物 atp6、 cob和 coxⅡ基因保守区设计特异引物 , 利用 RT - PCR技术从 ‘国庆 1
号’温州蜜柑 cDNA中分别扩增出特异性片段 , 将其克隆至 pB luescrip t ( sk + ) 载体上进行测序。同源性
分析表明 , 所克隆的 a tp6、 cob和 coxⅡ与其他植物的对应氨基酸区域同源性分别达到 85%、98%和 96%以
上。RT - PCR分析表明它们在叶片、花瓣以及不同时期的花蕾中都有表达 , 在幼果中没有表达。Southern
分析表明它们在温州蜜柑基因组 DNA中为多拷贝。
关键词 : 温州蜜柑 ; 线粒体基因 ; 克隆 ; 表达分析
中图分类号 : S 666; Q 78　　文献标识码 : A　　文章编号 : 05132353X (2006) 0320485206
C lon ing and Expression Ana lysis of M itochondr ia l Genes from Sa tsuma M an2
dar in ( C itrus unsh iu M arc. )
Hu Zhiyong, Tong Zhu, Xu Q iang, Yi Hualin, and Deng Xiuxin3
(N ational Key Laboratory of C rop Genetic Im provem ent, Huazhong A gricultural U niversity, W uhan, Hubei 430070, China)
Abstract: Synthetic oligonucleotides based on the conserved sequence of a tp6, cob and coxⅡ of other
p lants were used to p rime the synthesis and amp lification of the specific fragments by RT - PCR from C itrus
unsh iu. PCR p roducts were cloned into pB luescrip t ( sk + ) vector and sequenced. Sequencing analysis
showed that the deduced am ino acid of a tp6, cob and coxⅡ shared over 85% , 98% and 96% identities with
homologic genes of other p lants species respectively. RT - PCR analysis indicated they exp ressed in the leaf,
petal and flower buds during different stages, while not exp ression in the immature fruit. Southern blot analysis
showed that there existed more than one copys in the genome.
Key words: C itrus unsh iu; M itochondrial gene; Cloning; Exp ression analysis
胞质雄性不育 (Cytop lasm ic male sterility, CMS) 是自然界的一种常见现象。在柑橘类果树中 , 雄
性不育是导致柑橘果实无籽的主要原因 , 而无籽是一个极其宝贵的性状 ; 雄性不育的品种和类型在生
产和育种中扮演着举足轻重的角色。我国具有丰富的柑橘雄性不育或低育资源 , 温州蜜柑是典型的胞
质雄性不育类型〔1〕, 是我国柑橘业中最重要的栽培类型。随着分子生物学技术的不断发展 , 国内外
越来越多的研究表明线粒体基因组及其表达产物与 CMS直接相关〔2, 3〕。在其他植物的研究中有报道
CMS可能与 a tp6、 cob和 coxⅡ这几个线粒体基因相关〔4～6〕。曹庆芹通过 RFLP研究发现 , 线粒体基因
探针 a tp6、 cob和 coxⅡ与酶 PstⅠ的组合等能够检测到柑橘 CMS品种温州蜜柑和可育品种本地广橘
(与温州蜜柑亲缘关系最近的品种 ) DNA水平的差异 , 而且 Northern杂交也发现 a tp6、 cob和 coxⅡ在
温州蜜柑不同器官中的表达存在差异 , 可能与线粒体的时空表达有关〔7〕。因此本研究试图从温州蜜
柑中克隆这 3个可能与 CMS相关的线粒体基因 a tp6、 cob和 coxⅡ, 并分析它们在温州蜜柑不同组织、
器官以及不同发育时期的表达情况 , 探讨它们在柑橘体内的生理功能 , 为研究温州蜜柑的雄性不育机
理奠定基础。
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园 　　艺 　　学 　　报 33卷
1　材料与方法
111　材料
‘国庆 1号 ’温州蜜柑 (C itrus unsh iu Marc. ‘Guoqing 1’) 定植于武汉华中农业大学国家柑橘育
种中心材料圃。于花蕾期每隔一天采集不同大小花蕾 , 挑取花药经 0105%醋酸洋红染色压片用显微
镜镜检判断发育时期后进行分组 ; 同时采集花瓣、幼果以及叶片材料 , 采集的材料经液氮速冻后 , 保
存在 - 80℃条件下备用。
112　总 RNA的提取和 cD NA的克隆
总 RNA 提取参考 Chomczynski等的方法〔8〕,
分别提取各样品总 RNA, 之后取少量混匀 , 用寡
聚引物 ( dT) 18反转录 , 获得第一链 cDNA。根据
在 GenBank中登录的线粒体基因 a tp6、 cob和 cox
Ⅱ保守序列分别设计引物 , 并在每对引物上加上
EcoRⅠ和 B am HⅠ两个酶切位点 (表 1) , 引物由
上海博亚生物技术有限公司合成。
以 cDNA为模板进行 PCR反应 , 反应条件为
94℃预变性 10 m in后 , 94℃变性 1 m in, 55℃退火
45 s, 72℃延伸 1 m in, 32个循环。将得到的片段
和 pB luescrip t ( sk + )载体同时用 EcoRⅠ和B am HⅠ
表 1　PCR扩增线粒体基因 cD NA片段的引物
Table 1　PCR pr im ers used for m itochondr ia l gene cD NA
fragm en t am plif ica tion
线粒体基因
M itochondrial gene
大小
Size ( bp)
引物
Primer
序列 (5’23’)
Sequence (5’23’)
atp6 662 atp62l ggaattctttgtttatgctgctaactc
atp62r cgggatcccatcattcaagtaaatacag　
cob 381 cob2l ggaattctcaacagcgtagaaca
cob2r cgggatccaataaggggagtaaat　
cox Ⅱ 556 coxⅡ2l ggaattctaatagacttacatcacgat
coxⅡ2r cgggatccccatagtaaactccttct　
　　注 : 下划线示 B am HⅠ或 EcoRⅠ酶切位点。
Note: The underline showed the B am HⅠ or EcoRⅠ site.
内切酶进行双酶切 , 进行连接反应后转化大肠菌 DH25α。用 PCR法确定带有目的长度 cDNA片段的
菌落 , 提取质粒送上海联合基因科技有限公司测序。
氨基酸序列由 ORF Finder ( http: / /www1cnbi1nlm1nih1gov /gorf /gorf1htm l) 软件读取 , 所得的
序列通过 BLAST软件 ( http: / /www1ncbi1nlm1nih1gov /BLAST) 进行核苷酸和氨基酸序列同源性
比较。
113　不同发育时期及不同组织、器官的 RT - PCR分析
对不同发育时期及不同组织、器官提取 RNA样品 , 它们包括叶片、花瓣、幼果及小孢子母细胞
形成前、小孢子母细胞形成期、小孢子母细胞减数分裂期和花粉粒形成期的花蕾 , 反转录和 PCR反
应条件同上 , 以 actin基因为对照。取 5μL的反应液 , 用 115%的琼脂糖凝胶电泳分离 , EB染色后照
相。
114　基因组 D NA的提取及 Southern印迹分析
DNA的提取和杂交参照 Cheng等的方法〔9〕。采集生长期 ‘国庆 1号 ’温州蜜柑幼叶 , 提取基因
组 DNA。基因组 DNA 15μg分别用 B am HⅠ、EcoRⅠ、SacⅠ、Sm aⅠ和 X hoⅠ酶切电泳后 , 印迹到尼
龙膜 (Hybond2N + , Amersham) 上杂交 , 采用高严谨洗膜。
2　结果与分析
211　a tp6、 cob和 coxⅡ的克隆及序列分析
用表 1所列的 3对特异性引物分别从 ‘国庆 1号 ’温州蜜柑 cDNA中克隆出长 662 bp、381 bp和
556 bp的 3个 cDNA片段 , 分别定名为 C ita tp6、C itcob和 C itcoxⅡ, 它们的碱基及推导的氨基酸序列如
图 1、图 2、图 3所示。
BLAST进行同源性比较表明 , C ita tp6的氨基酸序列与向日葵、拟南芥、油菜、高粱、玉米、豌
豆、蚕豆以及水稻等的同源性均在 89% ～85%之间 ; C itcob的氨基酸序列与龙舌兰、拟南芥、黄瓜、
芦子、玉米、豌豆、蚕豆、水稻等的同源性均在 99% ～98% ; C itcoxⅡ的氨基酸序列与豆薯、芜菁、
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　3期 胡志勇等 : 温州蜜柑线粒体基因的克隆与表达分析 　
油菜、野生大豆、玉米、豌豆、胡枝子、山黑扁豆等的同源性均在 99% ～96%。说明我们克隆到的
这 3个 cDNA片段分别是温州蜜柑的线粒体基因 a tp6、 cob和 coxⅡ同源基因。
图 1　温州蜜柑线粒体 C ita tp6基因 cD NA片段核苷酸和氨基酸序列
F ig. 1　Nucleotide and deduced am ino sequences of m itochondr ia l gene C ita tp6 cD NA in C. unsh iu
图 2　温州蜜柑线粒体 C itcob基因 cD NA片段核苷酸和氨基酸序列
F ig. 2　Nucleotide and deduced am ino sequences of m itochondr ia l gene C itcob cD NA in C. unsh iu
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园 　　艺 　　学 　　报 33卷
图 3　温州蜜柑线粒体 C itcoxⅡ基因 cD NA片段核苷酸和氨基酸序列
F ig. 3　Nucleotide and deduced am ino sequences of m itochondr ia l gene C itcoxⅡ cD NA in C. unsh iu
212 　C ita tp6、C itcob和 C itcoxⅡ在不同发育时期
及不同组织器官的表达
RT - PCR分析结果 (图 4) 表明 , C ita tp6、
C itcob和 C itcoxⅡ在叶片、 花瓣以及不同时期的
花蕾中都有表达 , 在幼果中表达量很少或没有表
达。其中 , 在叶片中的表达一般高于花瓣。而在
几个不同时期的花蕾中 , 这 3个基因的表达均存
在差异 , 并且在处于减数分裂时期的花蕾中表达
量都较大。这说明线粒体基因的功能与温州蜜柑
花器官的发育存在密切的关系 , 可能对温州蜜柑
小孢子的发育存在影响。
213　C ita tp6、C itcob和 C itcoxⅡ的 Southern印迹
‘国庆 1号 ’温州蜜柑总 DNA分别用 B am H
Ⅰ、EcoRⅠ、SacⅠ、Sm aⅠ和 X hoⅠ酶切 , 用克
隆的片段做探针 , 在这些片段中均没有这 5个酶
的酶切位点。 Southern杂交结果 (图 5 ) 表明 ,
C ita tp6在不同的酶切情况下分别产生 2～4个不
图 4　‘国庆 1号’温州蜜柑不同组织、不同时期 C ita tp6、
C itcob和 C itcoxⅡ基因的 RT - PCR分析
1. 叶 ; 2. 小孢子母细胞形成前花蕾 ; 3. 小孢子母细胞形
成期花蕾 ; 4. 小孢子母细胞减数分裂期花蕾 ;
5. 花粉粒形成期花蕾 ; 6. 花瓣 ; 7. 幼果。
F ig. 4　RT - PCR ana lysis of C ita tp6, C itcob and C itcoxⅡ
gene in var ious tissues and tim es in C. unsh iu
1. Leaves; 2. Flower buds before the m icrosporocyte formation;
3. Flower buds in m icrosporocyte formation stage; 4. Flower
buds in m icrosporocyte meiosis stage; 5. Flower buds in
pollen formation stage; 6. Petals; 7. Immature fruits.
等的杂交条带 ; C itcob一般产生 1个杂交带 , 但在 S acⅠ酶切情况下产生 3个杂交条带 ; C itcoxⅡ在不
同的酶切情况下分别产生 1个或 2个杂交条带。这说明 , 这 3个线粒体基因在温州蜜柑基因组 DNA
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　3期 胡志勇等 : 温州蜜柑线粒体基因的克隆与表达分析 　
中都是多拷贝的 , 由于柑橘的基因组呈杂合状态 , 具体的拷贝数尚不能确定。
图 5　线粒体基因探针对温州蜜柑的 Southern印迹分析
M. 分子量标准λ/H indⅢ; 1. 总 DNA B am HⅠ酶切 ; 2. 总 DNA EcoRⅠ酶切 ; 3: 总 DNA SacⅠ酶切 ;
4: 总 DNA Sm aⅠ酶切 ; 5: 总 DNA X hoⅠ酶切。
F ig. 5　Southern blot ana lysis of C. unsh iu w ith m itochondr ia l gene probe
M. Markerλ/H indⅢ; 1. D igestion of the total DNA with B am HⅠ; 2. D igestion of the total DNA with EcoRⅠ; 3. D igestion of the
total DNA with SacⅠ; 4. D igestion of the total DNA with Sm aⅠ; 5. D igestion of the total DNA with X hoⅠ.
3　讨论
CMS属于功能性不育 , 植物个体在小孢子的发生过程中出现败育从而不能形成有活力的花粉。
由于 CMS是母性遗传 , 胞质中线粒体的作用举足轻重。以往的许多研究都表明 , 花粉中的线粒体与
CMS有密切的关系。但在柑橘类果树中这方面的研究还不多见 , 对柑橘 CMS机理的研究甚少。
柑橘中线粒体基因的克隆尚未见有报道 , 本试验成功地从温州蜜柑 cDNA中克隆到 3个线粒体基
因 a tp6、 cob和 coxⅡ的片段 , 通过与 GenBank中收集的同源基因的氨基酸序列进行比较分析 , 在比较
的 10余种植物中 , C ita tp6、C itcob和 C itcoxⅡ的氨基酸序列与他们的同源性分别高达 85%、98%和
96%以上。这说明线粒体基因在结构上是高度保守的。正因为植物线粒体基因具有高度的同源性 , 本
研究直接采用总 RNA反转录获得的 cDNA作为扩增的模板 , 利用设计的特异性引物进行扩增 , 而未
进行线粒体 RNA的分离 , 结果证明是可行的。
关于植物 CMS分子机理 , 普遍认为与呼吸链和 ATP合成基因的嵌合基因以及 RNA的编辑等有
关〔10～12〕。线粒体基因 a tp6、 cob和 coxⅡ分别编码着 F1F02ATP合成酶的第 6亚基、细胞色素 b的亚基
和细胞色素 C氧化酶复合体的第二亚基。而它们又都是由线粒体 DNA所编码的 , 在线粒体基因组中
与呼吸作用有关 , 影响着能量代谢的基因。RT - PCR分析表明 , C ita tp6、C itcob和 C itcoxⅡ在不同时
期的花蕾中的表达基本上呈现先增强后减弱的趋势 , 并且都是在小孢子发育到减数分裂的时期表达最
强。在小孢子发育后期一直到形成成熟的花粉粒的过程中线粒体基因的表达减弱 , 这意味着供给小孢
子发育的能量可能在减少 , 这必然会导致花粉的败育。而前人在对柑橘类果树的花粉母细胞减数分裂
观察以及小孢子发育过程的研究中也发现小孢子的不正常发育从减数分裂时期开始 , 主要发生在发育
的后期〔13, 14〕。
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