全 文 ：园 艺 学 报 2008，35(7)：1059—1064
Aeta Hortieulturae Sinica
苹果实生树阶段转变特异蛋白质的 SDS—PAGE分
析
曾广娟 ，李春敏 ，张新忠¨，田
( 河北省农林科学院昌黎果树研究所，河北昌黎 066600；
艺植物研究所，北京 100094)
义 ，陈东玫 ，赵永波 ，董文轩
沈阳农业大学园艺学院，沈阳 110161； 中国农业大学园
摘 要：利用聚丙烯酰胺凝胶电泳技术 (SDS—PAGE)分析了6株苹果实生树 ( ‘红玉 ’× ‘金冠 ’)
叶片中蛋白质随节位升高的动态变化。结果表明，随节位升高蛋白质带发生变化，共发现了3条阶段转变
特异蛋白质带，分子量分别为55 kD、19 kD和 l7 kD。其中55 kD蛋白质表现为定性变化，有 5株实生树
在36～75节出现，到 101～126节消失；19 kD蛋白质在实生树低节位含量高，在 86—100节之后含量突然
降低；17 kD蛋白质在实生树低节位含量低，随着植株的发育蛋白质在 36—50节含量突然增加并保持稳
定，到 91～105节后含量突然下降。认为这 3种蛋白质是苹果实生树阶段转变的特异蛋白质。
关键词：苹果；阶段转变；蛋白质；SDS—PAGE
中图分类号：S 661．1 文献标识码：A 文章编号：0513—353X (2008)07—1059-06
SDS-PAGE Analysis of Phase Change-related Proteins in Apple(Malus dom-
estica Borhk．)
ZENG Guang-juan ，LI Chun—min ，ZHANG Xin．zhong ，TIAN Yi ，CHEN Dong．mei ，ZHAO Yong—bo ，
and DONG Wen．xuan
( Changli Institute ofPomology，tebei Academy ofAgricultural and Forestry Sciences，Changli，Hebei 066600，China； Colege
ofHorticulture，Shenyang Agricultural Universit) ，Shenyang 110161，China； Institutefor Horticultural Plants，China Agricul-
rural University，Beijing 100094，China)
Abstract：Dynamic changes of proteins in leaves from different nodes in 6 hybrid seedlings(Jonathan ×
Golden Delicious)were analyzed with SDS-polyacrylamide gel electrophoresis in apple．Three protein bands
were f0und specific in different phases．The molecular mass of the 3 protein bands were approximately 55 kD．
19 kD and 17 kD．The 55 kD protein presented qualitatively between No．36—75 and No．101—126 nodes．
Th e change of 19 kD and 17 kD proteins was found quantitatively．In leaf samples taken below nodes No．86
— 100，the content of 19 kD protein was higher．but a sharp decrease occu~ed in leaves above nodes
No．100．The content of 17 kD protein kept high between No．36—50 and No．91—105 nodes．It iS therefore
suggested that the 3 proteins were phase change-related in apple seedlings．
Key words：Malus domestica；phase change；protein；SDS—PAGE
木本被子植物的个体发育分为童期 (juvenile phase)、成年营养生长期 (adult vegetative phase)
和生殖生长期 (reproductive phase)(Poethig，1990)。处于童期的植株即使给予成花诱导措施，仍不
能成花，随着发育，植株逐渐具备成花潜力，这一阶段实生树体内发生着由童性向成熟的转变，这一
连续的渐进的生理过程称为阶段转变 (Hacket，1983)。
收稿日期：2008—01—21；修回日期：2008—06—11
基金项目：河北省自然科学基金项目 (C2007000967)
通讯作者 Author for corespondence(E—mail：zhangxinzhong999@126．COB)
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1060 园 艺 学 报 35卷
Zhang等 (2007)研究苹果实生树个体发育过程中内源多酚的动态变化，发现童期、成年营养生
长期和生殖生长期分别出现多酚的变化，而且随节位升高，苹果实生树叶片、芽、韧皮部中内源细胞
分裂素含量发生明显变化 (Zhang et a1．，2006)。植物阶段转变过程中体内发生的一切生理变化均是
由一系列基因调控的，蛋白质是基因表达的产物，植物阶段转变的过程必然伴随着蛋白质定性或定量
的变化。因此，与阶段转变密切相关的特异蛋白质的分离及鉴定对认识多年生木本被子植物阶段转变
的分子机制具有重要意义。
研究发现高等植物阶段转变过程中存在着小分子量蛋白质的变化。许多植物上曾发现童期特异蛋
白质。如巨杉 (Sequoiadendron giganteum)童期组织中有一种与膜相关的蛋白质 J16，分子量为 16
kD，在成龄期组织中却检测不到 (Bon，1988)。相反，有些植物上存在成龄期特异的蛋白质，如板
栗成龄区枝条组培苗中有38 kD和43．6 kD的两条特异蛋白质带，但童期枝条的组培苗中没有检测到
(Amo—Marco et a1．，1993)。另一些植物既能检测到童期特异蛋白质，又能检测到成龄期特异蛋白质。
Hacket等 (1991)在洋常春藤 (Hedera helix)童期叶柄中鉴定出了分子量 25 kD、等电点 PI 9的特
异性多肽，而在成龄态叶柄中检测到分子量 28 kD、等电点 PI 5．3的专一性多肽。在北美红杉 (Se．
quoia sempervirens)中发现磷酸化的32 kD蛋白质仅在成熟期出现，而在童期的细胞中却检测到了被
磷酸化的分子量为31 kD的特异蛋白质 (Kuo et a1．，1995)。还有许多植物中虽未能检测到与童期、
生殖生长期相关的特异蛋白质的定性差异，但检测到了某些蛋白质含量的变化。Besford等 (1996)
在甜樱桃 (Prunus avium)童期茎尖上发现过量表达的 12 kD蛋白质。而 Hand等 (1996)在甜樱桃
上发现 28 kD的多肽在童期茎尖含量丰富。在柑桔成龄组织 中多量表达的是 59．7 kD的蛋 白质
(Snowbal et a1．，1991)。Garcia等 (2000)在橄榄 (Olea europaea)上发现29 kD的多肽在童期叶片
组织中多量表达，而35 kD蛋白质在成龄组织中高量表达。Huang等 (2003)在北美红杉的童期组织
中发现36、44、46 kD蛋白质大量表达，29 kD蛋白质含量较少，成龄态组织中含有更多量的34、36
kD蛋白质。
本研究利用 SDS—PAGE技术分析苹果实生树不同节位叶片的蛋白质动态变化，为进一步研究阶段
转变的生理和分子机制奠定基础。
1 材料与方法
1．1 材 料
选取生长一致的4年生苹果杂种实生树(‘红玉’× ‘金冠 ’)6株 (株系号分别为：02—16—116，
02—17-042，02—17—1 15，02—18-034，02—18—126，02—19—132)。2007年春季萌芽后每株实生树从根茎部
选留基生萌蘖，从树干中部选留旺盛新梢。6月6日分别采集基生萌蘖、与基生萌蘖有部分节位重叠
的树干中部旺盛新梢、以及与树干中部旺盛新梢有部分节位重叠的树冠内新梢的叶片，每株树单独取
样，从根茎部开始，每5节为一样品。样品采集完毕迅速放人冰盒内带回实验室，用液氮处理后装入
保鲜袋，置 ～40℃冰箱备用。
1．2 蛋白质提取
蛋白质提取参照谷瑞升等 (1999)的 Tris—HC1法，有所改进。取冷冻叶片，液氮研磨，准确称
取0．5 g粉末置 10 mL离心管中，加入 0．3 g PVPP和4．5 mL蛋白质提取缓冲液 (62．5 mmol·L
Tris—HC1 pH 6．8，0．5％ SDS，10％甘油，5％巯基乙醇)，涡旋 30 S，4℃放置 1 h，充分溶解蛋白质。
放置后的样品摇匀，4℃ 12 000×g离心20 min，取上清液 1．5 mL转移至10 mL离心管中，加入4．5
mL预冷丙酮，摇匀，一20℃放置1 h沉降蛋白质，之后4℃5 000×g离心10 min。弃上清液，沉淀
在 一20℃下放置 1 h，使丙酮完全挥发。加入 250 txL上样缓冲液溶解蛋白质 (62．5 mmol·L s—
HC1 pH 6．8，10％甘油，5％巯基乙醇)，其问涡旋3～4次，l h后4℃ 12 000×g离心20 rain，取上
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7 期 曾广娟等 ： 苹果 实生树阶段转变特异蛋 白质的 S D S — P A G E 分析
清液 200 p．L ， 加入 4 0 IxL 10％ S D S 和痕量溴酚蓝 ， 混匀后在沸水浴 中热处理 5 m in ， 冷却至 室温 即为待
测蛋 白质溶液 。
1．3 S D S - P A G E
采用不连续双 垂 直板 (22． 0 em x 14 ． 5 cm x 1 ． 0 m ／n ) 聚丙 烯酰胺凝胶 电泳 (P A G E )， 北京市六
一 仪器 厂 D Y Y ． 1 1 B 型 三 恒 电泳仪 。 分离胶 浓度 12． 5 ％ ， 浓缩胶 4 ％ ， 将 15 g T ris ， 72 g 甘 氨酸 ， 5 g
S D S 溶于 1 L 去离子水 中即为 5 倍 电极缓 冲液 ， 用时稀释 5 倍 。 预 电泳 1 h。 上 样量 5 IxL ， 开始电流
15 m A ， 进人 分离胶后 25 m A 。 电泳时间 ： 2． 0 ～ 2． 5 h。 银 染显 色 ， 每样 品 2 次重 复 。 凝胶用 U M A X
P ow erlook2100X L (日本 ) 扫描仪扫描 ， 实 际测量 溴 酚蓝 的距 离 和蛋 白质谱带 的距 离 ， 计算迁 移率 ，
绘制蛋 白质标准 曲线 图 ， 估算特异蛋 白质分子 量 。 低分子量 标准蛋 白质分子 量 范 围 ： 14 ． 4 ～ 97 ． 4 kD
(购 自上 海生 工 )。
2 结果与分析
2． 1 特异 蛋 白质 带的确定
随实生树节位升高 ， 蛋 白质带发生变化 ， 不 同实生树有所不 同 。 供试 的 6 株实生树 中共检测 到 3
条共 同的差异蛋 白质带 B 。 、 B ：和 B ， (图 1 )。
l①
97 ． 4 — — —
66． 2 一
图 l 苹果 实 生树 (02 - 16 - 1 16 ) 叶片蛋 白质 S D S - P A G E 电泳
从左 至 右第 1 泳道 3 l ～ 35 节 ． 第 2 泳道 36 ～ 4 0 节 ， 依次向右 ， 每 5 节为 一 样品
(第 l】泳道 为标 准分子 量 蛋 白质 )， 最 右泳道 为 14 1 — 14 5 节 。
B l (58． 1 kD )， B 2 (19 ． 0 kD )， B 3 (17 ． 1 kD )。
F ig． 1 S D S - P A G E electrophoresis gelim ages ofprotein in apple seedlings
F rom leftto right： the 1 stline is 3 1 — 35 nodes ， the 2nd line is 36 — 4 0 nodes ， and analogicaly，
the lastline is 14 1 — 14 5 nod es， T he 1 lth line is the m arker．
B l (58． 1 kD )， B ! (19 ． 0 kD )， B 3 (17 ． 1 kD )．
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园 艺 学 报 35卷
3条带的分子量估算结果如表 1所示。取众值得到3条蛋白质带的分子量分别是55 kD、l9 kD和
l7 kD。其中55 kD蛋白质带表现为定性差异，只在生长发育的特定时期出现。l9 kD和l7 kD的两条
蛋白质带在实生树的某些节位含量高，而后含量突然降低，为定量差异。3条谱带株间重复较好，节
位差别较小。因此认为上述3条蛋白质带为苹果实生树阶段转变的特异蛋白质带。
表 1 3种特异蛋白质的分子量
Table 1 Mass of three spec~c proteins of apple seedlings
2．2 特异蛋白质在单株上的变化趋势及临界节位的确定
如图2所示，3条特异蛋白质带在6株实生树上变化趋势基本一致。在同一单株上，55 kD蛋白
质在 19 kD和 l7 kD两种蛋白质含量均高时出现，在它们含量降低后消失，表现为定性差异。
随实生树节位升高，55 kD蛋白质在不同实生树上出现和消失的临界节位单株间有差异，但随实
生树节位升高出现2个定性的临界点，有5株实生树 55 kD蛋白质出现的临界点在36～75节之间，
其消失的临界节位在 101～126节之间。实生单株 ‘02-17-042’(株号2)的55 kD蛋白质变化的临界
节位较其它5株偏高，从 101～105节开始出现，146～150节开始消失。
19 kD蛋白质在实生树低节位含量高且含量稳定，到特定节位后含量突然下降。随实生树节位升
高，6株实生树 19 kD蛋白质含量变化只有 1个临界点。其中5株实生树 l9 kD蛋白质含量骤然下降
l 2 3 4 5 6
55 kD
l 2 3 4 5 6
l9kD
l 2 3 4 5 6
l7 k工)
株号Seedling No．
图2 苹果阶段转变特异蛋白质在不同实生树的动态变化
黑色代表蛋白质含量高，灰色代表蛋白质含量下降，1—6分别代表实生树02．16．1 16、
02—17-042、02—17-115、02—18-034、02—18-126、02—19—132。
Fig．2 The regulation and critical node of 3 specific protein in six apple hybrid seedlings
Black represented high content of protein，grey represented low content of protein，1—6 represented seedlings
No，02—16—1 16，02—17．1)42，02—17—115，02—18-034，02—18—126，02—19．132，
∞ ∞ ∞ 如 ∞ ∞ ∞ ∞ 加 0
0Poz
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7期 曾广娟等：苹果实生树阶段转变特异蛋白质的 SDS—PAGE分析
的临界节位均出现在 86～100节，单株 ‘02．17-042’与其它单株差异稍大，19 kD蛋白质含量下降的
临界节位出现在 13l～135节。
17 kD的蛋白质在实生树低节位含量低，生长到一定节位后含量突然增加并保持稳定，直到较高
节位又突然下降。随实生树节位升高，17 kD蛋白质含量变化出现 2个临界点，而且在所测定的5株
实生树上其临界节位相差不大。2个临界点分别是36～5O节和91～105节。从36—5O节开始，17 kD
蛋白质含量突然增加并保持稳定，91～105节之后含量突然降低，‘02-17-042’单株重复试验中未能
检测到 17 kD蛋白质带的变化。
以上结果说明虽然实生树株间特异蛋白质变化的临界节位略有不同，但总趋势一致。
3 讨论
本研究发现的苹果实生树阶段转变的3条特异蛋白质带在 6株实生树上变化的趋势和规律一致，
但临界节位株间有差异，尤其是实生树 ‘02．17-042’检测到的55 kD和 19 kD蛋白质出现和消失的
临界节位均远高于其它实生树。盛炳成等 (1992)曾对 7个苹果不同的杂交组合进行研究，指出苹
果实生树不同杂交组合童期长短不同，同一杂交组合不同单株之间童期长短也不同。不同实生单株间
阶段转变临界点存在差异是必然。
SDS-PAGE图谱上的一个条带中既可能含有一种蛋白质组分，也可能存在分子量大致相同的多种
蛋白质。本试验依据电泳图谱得到的 17 kD和 19 kD两条蛋白质条带，不同节位间存在条带染色程度
差异，既有可能是一种蛋白质或几种蛋白质含量变化所致，也可能是条带内蛋白质组分出现定性差异
所致。
依迁移率估算特异蛋白质带的分子量，是 SDS．PAGE技术的通用方法，虽然在不同实生树的电泳
图上所测分子量不同，但根据蛋白质条带的相对位置及带型特征进行判定可以确认所获得的3条蛋白
质带即B，、B 、B 的每条带在不同实生树单株间是相同的。
本试验在 6株实生树上检测到了3条共同的蛋白质带，既有定性差异的蛋白质带，也有定量差异
的蛋白质带，说明在实生树个体发育过程中存在蛋白质定性和定量差异。这与 Zhang等 (2007)对
苹果实生树个体发育过程中内源多酚动态变化的研究中发现阶段转变过程中分别存在根皮苷、槲皮
素、杨梅苷、咖啡酸的定性和定量的变化刚好相互印证。而且，随节位升高，苹果实生树叶片、芽、
韧皮部中内源细胞分裂素含量发生明显变化 (Zhang et a1．，2006)。这些研究结果均可以相互支持，
是深入研究阶段转变生理和分子机制的良好基础。
前人研究与阶段转变相关的特异蛋白质时，通用的方法是分别取某实生单株童期、成龄期样品进
行比较，寻找差异蛋白质。而本试验从苹果实生树树干基部到树冠顶部连续取样，研究蛋白质随节位
升高的动态变化。根据本试验的结果看，6株实生树每株都具有各自独有的蛋白质带 (数据未列出)，
仅以某一株实生树的样品研究阶段转变所取得结果会有较大偏差。而且，仅取童期和成龄期样品，检
测不到成年营养生长期特异性蛋白质存在和动态变化。
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