全 文 ：园 艺 学 报 2007，34(6)：1509—1514
Acta Horticulturae Sinica
三倍体狗牙根染色体数变异的分子细胞学鉴定
龚志云，高清松，苏 艳，单丽丽，于恒秀，王 淼，裔传灯，顾铭洪
(扬州大学 ，江苏省作物遗传生理重点实验室／教育部植物功能基因组学重点实验室，江苏扬州 225009)
摘 要：对三倍体狗牙根 ‘矮生百慕大’进行细胞学研究，结果表明，其细胞 内染色体数存在非整倍
性变异，变化范围为 2n=27—30。进一步利用荧光原位杂交 (FISH)技术 以45S rDNA为探针进行鉴定，
发现在三倍体狗牙根 ‘矮生百慕大’细胞中有3条染色体含有45S rDNA，并且都位于着丝粒部位。这3条
染色体上的杂交信号强弱不一，两个染色体在45S rDNA区杂交信号较强，且易伸长呈线状结构，杂交信号
较弱的一条染色体可能由于 45S rDNA含量比较少，所以这一区域染色体很易在分裂中 “拉长”并断裂，
形成非整倍体。
关键词：狗牙根；多倍体；45S rDNA；荧光原位杂交
中图分类号 ：S 688．4 文献标识码：A 文章编号 ：0513-353X (2007)06—1509436
M olecular-cytological Identification of Triploid Bermudagrass Chromosome
Number Variation
GONG Zhi—yun，GAO Qing—song，SU Yan，SHAN Li—li，YU Heng—xiu，WANG Miao，YI Chuan—deng，and
GU Ming—hong
(Key Laboratory ofCrop Genet~s and Physiology ofJiangsu Province／Key Laboratory ofPlant Functional Genomics，Ministry of
Education，Yangzhou University，Yangzhou，Jiangsu 225009，China)
Abstract：Cytological investigation of the triploid bermudagrass showed chromosome number varies be—
tween 27 and 30 in somatic cell indicating that some of the plants were aneuploid．In order to study the chro—
mosome variation，the digoxigenin一1 1一dUTP labeled 45S rDNA was used．Three distictive signals were locating
to the triploid bermudagrass prometaphase chromosome centromeres by fluorescence in situ hybridization
(FISH)．The intensity of three signals was diferent，and two signals of them showed lines sometimes．The
chromosome with the weakest signal was easy to snap，and aneuploid appeared．
Key words：Bermudagrass；Polyploid；45 S rDNA；Fluorescence in situ hybridization
狗牙根属 (Cynodon)植物属于禾本科虎尾草亚科，全世界共有 9个种 10个变种 (刘伟 等，
2003)。其中用草坪型狗牙根育成的草坪草具有植株低矮，繁殖能力强，抗旱，耐践踏，质地细腻，
色泽好，维护费用低等优良特性，是全球暖季型草坪草中应用广泛的草种之一 (马克群和刘建秀，
2005)。狗牙根属植物的染色体基数 x=9，二倍体 2n=2x=18(Harlan&de Wet，1969)。据报道，
狗牙根属植物广泛分布于不同生态地区，普遍存在着倍性变异，其中以四倍体 (2n=4x：36)(Hat—
lan&de Wet。1969；Harlan et a1．，1970；Burson&Tischler，1980；de Silva&Snaoydon，1995)和六
倍体 (2n=6x=54) (Hanna et a1．，1990)居多。而目前引 自美国的暖季型狗牙根品种 ‘矮生百慕
大’则是四倍体的普通狗牙根与二倍体的非洲狗牙根杂交育成的三倍体 (2n=3x=27)。狗牙根作为
收稿 日期：2007—07—09；修回日期：2007一o9—30
基金项 目：国家自然科学基金项目 (30600345)
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,g通讯作者 Authorfor correspondence(E—mal：gumh@yzu．edu．cn)
本研究得到上海交通大学胡雪华教授的大力支持，在此表示感谢!
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一 种既可有性繁殖又可无性繁殖的草本植物，物种内存在有染色体数不同的非整倍体 (郭海林 等，
2002)，但对其为何容易出现非整倍体，国内外没有明确报道。
作者利用核糖体 DNA (rDNA)作为探针，通过荧光原位杂交 (FISH)技术对引自美国的三倍体
狗牙根品种 ‘矮生百慕大’进行了研究，探讨狗牙根中一种非整倍体的形成机理。
1 材料与方法
1．1 材料及其染色体的制备
试验材料三倍体狗牙根 ‘矮生百慕大’由上海交通大学胡雪华教授惠赠，种植于扬州大学农学
院试验田内。为获得清晰的根尖细胞有丝分裂前中期的染色体图像，根尖收取后置于 0．002 mol／L的
8一羟基喹啉中，在 20℃下处理 2 h，然后用甲醇：冰醋酸 (3：1)的固定液固定，置于 一20℃冰箱中
备用。制片按 Kurata和 Omura(1978)的方法进行。
1．2 常规镜检
制好的玻片用 DAPI染色后在I~ica DMRXA荧光显微镜下进行观察，对于染色体分散好，形态清
晰的细胞用气冷式数码相机 (CCD)摄像。
1．3 荧光原位杂交检测
所用探针45S rDNA由日本北海道大学 Sano博士提供，端粒探针 pAtT4，引 自美国康奈尔大学。
用digoxigenin(地高辛)-11-dUTP标记探针，标记和杂交方法按Jiang等 (1995)的方法进行。
FISH信号通过 anti—digoxigenin(地高辛)一FITC检测，染色体用 DAPI复染。以气冷式数码相机
(CCD)摄像，并将图像输人计算机中，以I~ica QFISH软件调节对比度和亮度。
1．4 二次杂交检测
对做过 FISH分析的载玻片，放于含有 1×PBS溶液的染色缸中，放置于脱色摇床上轻摇至盖玻
片自然脱落后，用70％、90％、100％系列酒精脱水后，自然晾干，再进行第2次 FISH分析 (方法
同前)。
2 结果与分析
2．1 狗牙根染色体数的变异
2．1．1 常规镜检结果
在普通光学显微镜下，对根尖细胞有丝分裂中染色体分散良好且形态清晰的55个分裂相进行观
察，发现三倍体 ‘矮生百慕大’染色体数存在差异，变化范围为2n=27～30(图 1)。其中表现典型
三倍体染色体数 (2n=27)的细胞仅为2个，占3．6％，具28条染色体的细胞44个，占80％，具29
条染色体的细胞4个，占7．3％，具30条染色体的细胞5个，占9．1％。
2．1．2 FISH检测结果
由于在光学显微镜下看到的染色体一般只能从分散程度上区别 ，不通过特殊处理，很难确定染色
体变异的性质。为了研究上述同一狗牙根品种染色体数变异的来源，利用端粒 DNA (pAtT4)作为探
针对以上进行常规镜检的细胞进行了 FISH鉴定，以确定每一条染色体的完整性。
以图 1，B分裂相为例，该细胞中，在普通显微镜下可看到28条染色体，比理论上的染色体数多
了 1条，经过 FISH鉴定可发现 (如图2，A所示)，这一细胞中有26条染色体长短臂末端都有绿色
的端粒杂交信号，并且由于有丝分裂中期的每条染色体包含有两条姐妹染色单体，所以一条染色体都
显示有4个点状信号 (部分染色体末端两个信号重叠在一起)，但箭头所示的两条染色体只有一个末
端显示杂交信号，说明它们不是完整的正常染色体，很可能是由一条染色体发生断裂形成的端着丝粒
染色体。
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通过分析其它细胞，发现在有些分裂相中容易断裂的染色体有时在着丝粒区域有一条线状结构联
接着长短臂。很像有些物种染色体45S rDNA比较富集的位置在分裂时出现的图像 (Liu et a1．，2005；
刘博 等，2005；Liu et a1．，2006)。为了确定这条染色体是否是狗牙根中45S rDNA所在的染色体，
利用45S rDNA作为探针对其作进一步的FISH分析。
2．2 45S rDNA在狗牙根染色体上的分布
利用45S rDNA作为探针，对经过端粒 DNA (pAtT4)杂交过的染色体进行第 2次杂交。
从杂交图像可看出，每个分裂相中一般可出现 4个杂交信号，其中两个杂交信号较弱，另两个杂
交信号较强 (图2，B)。
由于图2，A和图2，B是同一细胞同一分裂相的照片，将两者对照起来分析可以发现，图2，A
中箭头所示的两个只在一端显示端粒杂交信号的染色体正是45S rDNA所在的染色体，所不同的是端
粒DNA杂交信号出现的位置与45S rDNA杂交信号出现的位置 (图2，B)正好相反，说明这两条体
形较小的染色体是由同一条染色体断裂为两条形成的。图2，B中另外两条染色体的45S rDNA杂交
信号都比较强，而且都出现在相应染色体的中部区域 ，表明这是两条结构完整的染色体。
进一步分析其它的分裂相，发现有两条染色体上有线状结构的杂交信号 (图2，C)，另有一条染
色体似乎正在发生断裂 (箭头所示)，以致信号分别位于正在断裂之中的两个染色体臂末端上。并
且，显示杂交信号的染色体除杂交信号区域外，其它部位都没有主缢痕，可以判断在这种三倍体狗牙
根中45S rDNA很可能位于相应染色体的着丝粒区域。
将同一细胞同一分裂相的图2，C与图1，C相比较，可以看出，图 1，C中箭头所示区域4条较
短的染色体其实是两条45S rDNA染色体，其中一条信号较弱的染色体发生了断裂，另一条信号较强
的染色体着丝粒区域已被拉长。
图2．D中有两条染色体上显示有线状结构的杂交信号，而另外一条有杂交信号的染色体发生了
断裂 (箭头所示)，因而杂交信号分别位于发生断裂的两个染色体臂上。将图2，D与图1，D相比较
发现，图1，D中箭头所示区域7条较短的染色体其实是4条染色体，其中3条是45S rDNA所在染色
体。两条染色体上的杂交信号呈线状结构，而另一条染色体在45S rDNA区已发生了断裂。在所观察
的分裂相中，有少部分细胞中信号最弱的染色体没有断裂，但都表现为伸长的线状结构，如图2，E
所示，在3条染色体的着丝粒区域均有3个杂交信号，并且两个较强的杂交信号呈点状，另一箭头所
示的信号呈线状。
总体分析，在三倍体狗牙根 ‘矮生百慕大’细胞中有 3条染色体含有 45S rDNA，并且都位于着
丝粒区域。这3个信号强弱不一，其中信号最弱的染色体最容易发生断裂。在所观察的55个细胞中
这条染色体的断裂率高达74．5％。而另外两个染色体在45S rDNA区杂交信号较强，且易伸长呈线状
结构，在有的细胞中信号长度可达20 Ixm (如图2，F箭头所示)。杂交信号较弱的那条染色体可能
由于45S rDNA比较少，所以最易产生断裂。在许多分裂相中可能正是由于这条染色体的断裂和另外
两条染色体的拉长，使染色体数表现出非整倍体的特征。如果 45S rDNA区在分裂中由于某种原因均
产生断裂，则三倍体狗牙根的染色体数就会比理论上的染色体数最多多出3条。在我们观察的55个
分裂相中染色体数均未超过30条，与这一推论相吻合。
3 讨论
郭海林等 (2002)曾报道过，狗牙根中非整倍体出现频率比较高。本研究中也看到了类似现象。
但是在常规细胞学镜检中，由于同一细胞中的不同染色体很容易重叠在一起，从而影响染色体数的确
定，所以在本研究中利用染色体端粒重复序列来确定每一条染色体的完整性。因为真核生物染色体端
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6期 龚志云等：三倍体狗牙根染色体数变异的分子细胞学鉴定
粒重复序列高度保守，在植物中从染色体内部到端部方向的序列一般为 rlTFAGGG的重复 (Riha&
Shippen，2003)。每条正常染色体的两臂末端都应该有端粒存在，所以可以借助端粒的鉴定来确定染
色体是否存在某一臂的缺失，从而保证所观察细胞中染色体数的准确。利用该方法，鉴定出在所观察
的55个细胞中分别有3种非整倍体类型。
为了进一步明确产生这些变异的原因，采用荧光原位杂交技术，对三倍体狗牙根 ‘矮生百慕大’
染色体数变异的细胞学原因进行了研究。研究表明，数量变异的原因主要是由于45S rDNA所在的染
色体发生断裂造成的。45S rDNA的定位在许多物种中都有报道，但在大多数物种如水稻中，45S
rDNA均位于染色体的末端 (龚志云 等，2002)，而在有些物种如棉花中，既有位于染色体末端的，
又有位于染色体着丝粒区域的 (Liu et a1．，2005)。有人认为位于非次缢痕和随体上的 rDNA，很多不
具转录活性 ，它们的起源尚不清楚 (Taketa et a1．，1999)。而本研究中45S rDNA都位于着丝粒区域，
而在染色体短臂的末端均未能发现杂交信号。也就是说在三倍体狗牙根 ‘矮生百慕大’中位于着丝
粒区域的45S rDNA也具有转录活性，能形成核仁组织区，并且携有45S rDNA的染色体会在细胞分
裂中于该 DNA所在区域被拉长成线状结构，甚至发生断裂。这一现象在其他物种中很少有报道，这
是否与位于着丝粒区域的45S rDNA有转录活性有关，有待进一步研究。
另外，在本研究中，除了有非整倍性变异外，未曾发现有染色体的倍性变异。这与前人的报道
(de Silva&Snaydon，1995；郭海林 等，2002)不尽相同。狗牙根是以无性繁殖为主的，具有很强的
繁殖能力。在本研究中所用三倍体狗牙根是一个杂交种，本身是不育的，染色体变异类型较为简单，
可能与其这一繁殖特性有关。
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“中国园艺学会十届二次理事会暨学术研讨会"纪要
中国园艺学会十届二次理事会暨学术研讨会于2007年 11月 l7～20日在南京召开。会议的主题是 “加强园艺科
学研究，促进园艺产业发展”，主要内容是总结学会、各专业委员会和分会两年来 (2005—2007年)的工作，交流经
验、存在问题及今后的设想。会议由中国园艺学会、中国工程院农业学部主办，南京农业大学、江苏省农科院、江苏
省园艺学会承办。农业部副部长危朝安、江苏省副省长黄莉新 、中国农科院副院长屈冬玉、农业部科技 司司长白金
明、江苏省农林厅厅长刘立仁、中国工程院院士方智远、束怀瑞、吴明珠，中国园艺学会名誉理事长朱德蔚，南京农
业大学校长郑小波 、江苏省园艺学会理事长常有宏等出席开幕式。来 自全国 70多个科研院所、高等院校 、企事业单
位的理事和论文代表 400人参加了会议 ，其中有 l3位来 自园艺界的大学校长和省农科院院长，40多位研究所所长 、
大学学院院长。会议开幕式由学会副理事长兼秘书长杜永臣主持，中国园艺学会理事长方智远院士致开幕词。危朝安
副部长作重要讲话 ，黄莉新、屈冬玉、朱德蔚 、常有宏 、郑小波等先后致辞。
方智远理事长在大会上作了 《第十届理事会工作报告 (2005—2007年)》。报告指出，两年来，中国园艺学会始
终把学术交流作为中心工作 ，与省园艺学会、各专业委员会及分会、有关科研院所大学合作，在学术交流、科技普
及、培训和组织管理等方面，开展了多种多样活动，为促进我国园艺产业发展 、提高园艺学科学术水平做了大量的工
作，包括承办和参加国际学术会议5次；国内学术交流 l0余次；科技培训6次；各专业委员会、分会开展各项活动
30余次。广泛的学术交流活动，对促进园艺科学研究和生产发展，促进国际学术交流与合作起到了重要作用。会上
各专业委员会和分会、《园艺学报》编辑部也分别汇报了两年的工作。
会议共收到论文摘要 315篇 (其中果树75篇，蔬菜 136篇，西甜瓜 24篇，观赏园艺 70篇 ，综合 l0篇)。会议邀
请了 l2位专家分别就各自的研究成果作了大会报告，还邀请韩国园艺学会理事长李升九出席会议并作报告。会议还
分果树 、蔬菜 、西瓜甜瓜和观赏园艺 4个专业组进行了交流。
代表们的报告和发言内容十分丰富，利用现代生物技术进行基础研究取得很好的进展，例如有关柑橘果实颜色的
研究、甘蓝自交不亲和信号诱导的研究、黄瓜全基因组测序研究等；许多密切联系生产实际的研究取得一批重要研究
成果 ，例如大白菜 、白菜 、番茄 、甜椒、花椰菜 、柑橘的细胞工程，造林育种 、设施园艺栽培技术近年获得国家级奖
励，对推动我国园艺产业发展发挥了重要作用。但是通过会议交流也看到，我国园艺科技与产业发展需求相 比，与国
外先进水平相比还有较大差距，创新性强、应用价值大的研究数量依然偏少，低水平的重复性研究依然存在，园艺科
技任重道远。
本次会议展示了我国园艺科技界 目前欣欣向荣的局面。通过这次会议，代表们交流了经验，开拓了视野，增加了
友谊，对推进我国园艺产业和园艺科技的发展将起到重要的、积极的作用。
南京农业大学承担了大会的会务工作，中国工程院农业学部 、南京农业大学、江苏农业科学院、江苏省园艺学
会，作物遗传与种质创新国家重点实验室、金陵科技学院、北京华耐农业有限公司等单位为本次会议的召开提供了资
助。在此向以上单位表示最衷心的感谢。
中国园艺学会
2007年 I1月
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