全 文 ：园 艺 学 报 , 一
菜蔓与 芥蓝种间杂交获得异源四倍体及其鉴定
满 红 , 张成合
’ , 王新娥 , 张广华
河北农业大学园艺学院 , 河北保定
摘 要 以四倍体菜墓 二 为母本与四倍体芥蓝 二 进行种间杂交 , 通过子房
培养 , 获得了菜墓与芥蓝的异源四倍体种间杂种 。 研究表明 , 适宜菜蔓与芥蓝种间杂交子房培养的培养基
为 培养基 , 附加蔗糖 岁 , 琼脂 岁 , 维生素 岁 , 维生素 留 , 生物素
岁 , 一 留 , 留 , 适宜培养的取材时间为授粉后 细胞学鉴定和流式细
胞仪分析表明 , 该杂种的染色体数为 二 , 相对含量约为其二倍体亲本的 倍 该杂种的开花
期 , 叶形
、
叶色 、 花冠大小和花色等特征介于两个亲本之间 。
关键词 菜蔓 芥蓝 异源四倍体
中图分类号 文献标识码 文章编号 一 一 一
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聊
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二
二 卿
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之 琢
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植物远缘杂交是推动植物进化的一种重要动力 , 也是人工创造植物新物种或新类型的一种重要途
径 。 关于十字花科芸蔓属植物远缘杂交创建异源多倍体的研究 , 国内外已有许多报道 ,
张国庆 等 , 。 获得了白菜与甘蓝的种间杂种 , 冯午和陈耀华 获得了
甘蓝与白菜的种间杂种 , 赵德培和张纪增 获得了结球甘蓝与大白菜的种间杂种 , 句等
获得了甘蓝型油菜与芥菜的种间杂种 , 梁红等 获得了甘蓝与菜墓的种间杂种 , 陈树
忠等 获得了甘蓝型油菜与羽衣甘蓝的种间杂种 。 近来 , 顾爱侠等 利用四倍体大白
菜与二倍体结球甘蓝杂交 , 通过子房培养直接获得了大白菜与结球甘蓝的种间三倍体杂种 。 但有关四
倍体菜蔓与四倍体芥蓝的种间杂交研究 , 迄今国内外尚未见报道 。
收稿 日期 一 一 修回 日期 一 一
基金项目 河北省自然科学基金项 目 创 碎
通讯作者 一
园 艺 学 报 卷
菜蔓 呷 的染色体数为
, 染色
体基数 , 染色体组为 。 芥蓝 咭 的染色体数为 , 染色体
基数 二 , 染色体组为 。 相对于白菜和甘蓝来说 , 菜蔓和芥蓝的遗传和育种研究基础比较薄弱 , 品
种或类型也相对较少 。 为拓宽其遗传背景 , 尚爱芹等 通过秋水仙素诱导分别获得了菜蔓和
芥蓝的同源四倍体新材料 。 本研究试图通过四倍体菜墓和四倍体芥蓝的种间杂交 , 直接获得菜蔓与芥
蓝的异源四倍体种间杂种 , 创建新种质 , 为菜蔓和芥蓝的遗传和育种研究提供新材料 。
材料与方法
材料
材料为同源四倍体菜蔓 ‘ ’ 、 同源四倍体白花芥蓝 ‘ ’ 及其二倍体亲本 。 其中 ‘ ’
和 ‘ ’ 是本课题组于 年用秋水仙素处理加倍并经过自交选育获得的遗传性稳定的株系 。
方法
杂交授粉 芥蓝于 年 月初播种在 日光温室 , 后播种菜蔓 , 以便使两者花期相遇 。
分别以四倍体菜蔓和四倍体芥蓝作为父母本 , 选择约 一 后开花的花蕾 , 人工去雄 , 然后取当天
开花的新鲜花粉进行相互授粉 , 套袋隔离 。
杂种幼胚培养 取杂交授粉后
、 、 、 、 、 、 、 、 一 、 和 的子房 , 用
的酒精表面消毒 , 的氯化汞水溶液消毒 , 无菌水冲洗 次 , 接种在附加生物素
翻
、 一 岁 、 岁 和蔗糖 岁 的 培养基上 。 培养 左右 , 从膨大的
子房 幼荚 中 , 剥出未退化的绿色胚珠 , 接种到 培养基上使之直接萌发成苗 , 然后切取茎
尖接种到附加 一 留 、 岁 的 培养基上 , 经腋芽增殖使每个杂种植株繁殖成为
单株试管无性系 。
杂种植株的 含量测定 采用美国 一 公司生产的 流式细胞仪对杂
种植株及其二倍体亲本的细胞 含量进行测定分析 。 试材为试管苗 , 参照吴雅琴等 的方
法测定 。
杂种植株的染色体数鉴定 将各单株试管无性系的部分试管苗转人 培养基上进行生
根 , 待根长约 一 时 , 切下根尖 , 置 的 一 经基喳琳水溶液中处理 , 然后用
改良卡诺固定液 酒精 丙酸铁饱和液 固定 常规压片法制片 , 丙酸一铁
一水和三氯乙醛一苏木精 染色液染色 , 一 显微镜观察 , 分别鉴定各杂种植株的染色体
数目 , 并挑选染色体分散
、
形态结构清晰的中期分裂相进行照相 。
杂种植株的减数分裂观察 于 月初 , 将生根试管苗移栽人 日光温室 , 开花初期取适宜大小
的花蕾 , 用卡诺固定液 酒精 冰醋酸 二 固定 常规压片法制片 , 染色液染色 ,
、 一 显微镜观察并照相 。
花粉大小 、 生活力和花粉量测定 用显微测微尺在 倍镜下 , 测定新鲜花粉的大小 , 随机测
个花粉粒 , 取其平均值 用 , , 一 氯化三苯基四氮哇 染色法测定花粉活力 用血球计
数板测定花粉量 , 取未散粉的成熟花药 枚 , 置于小玻管中 , 准确加人 的蔗糖溶液 , 用
小玻棒挤压花药 , 使花粉悬浮于溶液中 , 然后用血球计数板计数 , 重复 次 , 计算出花药内的平均
花粉粒数 。
维生素 、 可溶性糖 、 蛋 白质及含水量测定 取现蕾初期的幼嫩花墓 , 采用二 甲苯萃取法测
定维生素 含量 蕙酮比色法测定可溶性糖含量 考马斯亮蓝 一 法测定粗蛋白含量 烘干法测定
含水量 。
期 满 红等 菜蔓与 芥蓝种间杂交获得异源四倍体及其鉴定
结果与分析
授粉后天数对幼胚离体培养的影响
由表 可见 , 以 菜墓为母本时 , 授粉后
一 的子房 , 经离体培养 图版 , 后均有
存活的绿色胚珠 , 其中授粉后 的子房存活 的
胚珠最多 , 平均为 个 子房 而授粉后
和 一 的子房则均未见有存活的胚珠 。 而以
芥蓝为母本时 , 无论培养授粉后几天的子房 ,
均未获得存活的胚珠 。 可见 , 正反交对远缘杂交
及杂种幼胚培养的影响很大 。
杂种植株的形态特征
将存活的绿色胚珠 未成熟籽粒 从子房中
剥出接种到 培养基上 , 一 后便开始
萌发 图版 , , 约 周后 形 成幼苗 图版 ,
。 每个幼苗经过腋芽增殖 , 繁殖成单株试管无
性系 , 然后再接种到生根培养基中 , 形成完整试
管植株 图版 , 。
表 不同授粉天数对子房培养的影响
价 亡 月免 助 址
授粉天数
菜墓 芥蓝
存活胚珠 存活胚珠数
总数 荚
芥蓝 菜墓
罗
存活胚珠
总数 存活胚珠数 荚
表 杂种植株及亲本的特征特性比较
伴 山
材料 出苗到开花天数
菜墓
二 二
芥蓝
二 二
异源四倍体
二
花墓直径 花冠直径 花色
黄
白 】
浅黄
花药端部特征
无紫点
有紫点
甲
有紫点
甲
花蔓蜡质层
薄
厚
中间
由表 和图版 一 可见 , 异源四倍体杂种的叶片大小 、 颜色 , 花蔓粗度 , 花大小
、 颜色 , 蜡质
层厚度以及从出苗到开花的天数等基本上介于两二倍体亲本之间 。 此外 , 杂种和芥蓝的花药顶端有紫
点 , 而菜蔓没有 。 这表明该异源四倍体杂种的某些性状是由
、 两个染色体组共同决定的 , 而有的
性状 , 如花药紫点的有无 , 则是由单一染色体组所决定 。
染色体倍性鉴定
相对含量分析 流式细胞仪测定结果表明 , 二倍体菜蔓 和二倍体芥蓝 的
荧光强度高峰均出现在 位置上 , 分别为 和 图 , 、 而其异源四倍体杂交种
的对应值为 图 , , 约为其两个二倍体亲本的平均值的 倍 。 由图 还可以看出 ,
两个二倍体亲本除在 位置上各出现 个主峰外 , 还在 位置上各有 个小峰 异源 四倍体除在
位置上出现 个主峰外 , 还在 位置上有 个小峰 , 这表明用于测试的试管苗除了 期
的细胞外 , 还有部分处于 期或 期 的分裂细胞 。
园 艺 学 报 卷
图 杂种植株及其亲本 含里分布图
曲
染色体数鉴定 对培养获得的杂种植株鉴定结果表明 , 在获得的 个杂种植株中 , 染色体
数为 二 图版 , 的为 株 , 占 。 此外 , 还有染色体数多于或少于 条染色体
的非整倍体植株 , 约占 。
杂种植株的减数分裂行为
观察表明 , 异源 四倍体 的减数分
裂过程比较正常 , 细线期菜蔓和芥蓝两个染色体
组 、 的染色体相互缠绕在一起 , 没有明显
的分组 图版 , , 说明其亲缘关系并非很远
中期 各同源染色体主要 以二价体的形式排列在
赤道面上 图版 , 后期 同源染色体正常
分离 , 分到两极 的染色体数多为 图版 ,
, 其它不均衡的分离只占少数 表 。
杂种植株的花粉特性
异源四倍体的花粉量较 菜蔓和 芥蓝 的
少 , 与 菜蔓和 芥蓝的相近 花粉生活力与
、
菜蔓 及
、
芥蓝 的基 本相 同 , 均 达
以上 花粉整齐度与 菜墓和 芥蓝 的相
近 , 高于 菜墓和 芥蓝 表 。
杂种植株的营养品质
异源 四倍体的可溶性固形物含量和粗蛋白含
量略高于 菜墓 、 菜蔓和 芥蓝 , 而略低于
芥蓝 维生素 含量高于 芥蓝 和 芥蓝 ,
而低于 菜墓和 菜蔓 含水量略低于 菜蔓
和 菜蔓 , 而略高于 芥蓝和 芥蓝 表 。
杂种植株的结籽率
表 异源四倍体在后期 的染色体分离
分离方式 细胞数 所 占比率
表 杂种植株及亲本花粉的数 , 、 整齐度及生活力比较
们 ,
材 料 花粉量 花药 花粉生活力 花粉整齐度一
一 可
菜蔓
菜蔓
芥蓝
芥蓝
异源四倍体
异源四倍体的结籽率为 , 分别比 菜墓和 芥蓝低 和 个百分点 , 但较 菜
墓和 芥蓝分别提高了 和 表 。
期 满 红等 菜墓与 芥蓝种间杂交获得异源四倍体及其鉴定
表 杂种植株和亲本的营养品质及结籽率比较
叨 幼吐 吐 激 比雌 代
可溶性固形物 粗蛋白质含量 维生素
些一一,八,︸
‘、一了产声户
材料
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水 胎座数 荚
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籽粒数 英
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结籽率
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菜荃 吧
芥蓝
芥蓝
异源四倍
讨论
菜蔓和芥蓝为十字花科芸墓属的两个不同种 , 分属 染色体组和 染色体组 , 组的染色体基
数为 , 组的染色体基数为 二 。 菜蔓和芥蓝 自然杂交和人工杂交均难以获得杂种 。 植物种间
杂交不育的原因虽然有多种 , 但多数是由于胚胎和胚乳发育不协调
、 胚乳提早退化 , 致使胚胎缺乏营
养死亡 。 因此 , 在胚胎发生败育之前 , 对其进行离体培养挽救 , 在一定程度上可以克服种间杂交的不
育性 。 如通过幼胚 、 胚珠和子房离体培养 , 在大白菜 结球甘蓝 、 萝 卜 甘蓝 、 菜蔓 甘蓝
、 小麦
玉米 、 丁香 连翘等植物杂交中都成功地获得了杂种植株 。 远缘杂交中 , 大多采用二倍体 二倍体 ,
获得不育的双单倍体杂种后 , 再人工加倍成能育的异源四倍体 。 本研究采用四倍体 四倍体 , 直接获
得能育的异源四倍体 , 较前者省工省时 。
影响杂种幼胚培养的因素是多方面的 , 对菜墓 芥蓝的子房培养而言 , 培养基中添加维生素和生
物素是必要的 , 生长素和细胞分裂素对其胚胎的生长发育亦有明显的促进作用 。 胚龄大小对胚胎培养
的影响很大 , 一般来说胚龄越小 、 培养的难度越大 , 对培养基的要求也越复杂 。 在菜蔓 芥蓝的子房
培养中 , 培养授粉后 一 的子房比较适宜 , 而培养授粉后 以前或 以后的子房均不能取得
成功 。 分析其原因可能是由于授粉后 以前的胚龄太小 , 培养基的营养条件不能满足其生长发育的
要求 , 而授粉 以后的胚胎已开始发生了退化 。 远缘杂交中 , 正交与反交的结果有时是不同的 ,
本研究中 , 以四倍体菜蔓作母本 、 四倍体芥蓝作父本时 , 子房培养能够获得成活的胚珠 反之 , 以四
倍体芥蓝作母本 、 四倍体菜蔓作父本时 , 子房培养则不能够获得成活的胚珠 。 由此可以推测 , 这种正
反交的差异 , 可能主要受细胞质基因组的决定 。
结籽率降低是人工创建多倍体中普遍存在的现象 , 也是影响生产上应用的一个重要因素 。 菜蔓
芥蓝异源四倍体的结籽率为 , 虽然高于其四倍体的结籽率 , 但仍明显地低于其二倍体 。 一般
认为 , 影响多倍体结籽率降低的原因主要有细胞学和遗传生理学两种 , 从细胞学看 , 该异源 四倍体的
减数分裂行为基本正常 , 花粉量和花粉活性与二倍体的差异不大 。 由此可见 , 引起结籽率降低的原因
可能主要是由于该新合成异源四倍体在遗传生理上尚未处于协调一致 。 随着两组染色体间及其与细胞
之间的逐步协调一致 , 结籽率亦会逐渐提高 。
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陈树忠
, 殷家明 , 唐章林 。, 〕 甘蓝型油菜与羽衣甘蓝远缘杂交初步研究 西南农业大学学报 , 一
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冯 午 , 陈耀华 甘蓝与白菜种间杂交的双倍体后代 园艺学报 , 一
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顾爱侠 , 申书兴 , 陈学平 大白菜与结球甘蓝异源三倍体的获得及细胞学观察 园艺学报 , 一
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梁 红 , 覃广泉 , 何丽贞 甘蓝与菜心种间杂种的幼胚培养及 代的快速繁殖 中国蔬菜 , 一
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尚爱芹 , 张成合 , 刘世雄 菜心多倍体诱变及其细胞学观察 河南科学 , 一
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吴雅琴 , 赵艳华 , 程和禾 流式细胞术检测葡萄倍性的研究 见 王秀峰 , 李宪利主编 园艺学进展 北京 中国农
业出版社 一
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赵德培 , 张纪增 通过幼胚培养获得结球甘蓝与大白菜的种间杂种 中国农业科学
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张国庆 , 周伟军 , 姚先伶 芸蔓属植物远缘杂交研究现状 山西农业科学 , 一
图版说明 培养 的子房 成活胚珠 、 试管植株 菜蔓 异源 四倍体植株 芥蓝 花 菜垄
左 , 异源四倍体 中 , 芥蓝 右 异源四倍体根尖细胞染色体 二 二 异源 四倍体 , 细线期 异源 四倍
体 , 中期 异源四倍体 , 后期 。
如 面 ,
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