全 文 ：园 　艺 　学 　报 　2008, 35 (4) : 565 - 570
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2007 - 10 - 29; 修回日期 : 2008 - 02 - 02
基金项目 : 广东省科技计划项目 (2006B20130004)3 通讯作者 Author for correspondence ( E2mail: panlijing@m sn1com; m lmbzhnk@hotmail1com)
农杆菌介导石斛兰遗传转化的研究
张妙彬 , 梁擎中 , 肖　浩 , 岑　鹏 , 范干群 , 潘丽晶 3
(珠海市农业科学研究中心 , 广东珠海 519070)
摘 　要 : 利用根癌农杆菌介导转化石斛兰类原球茎 ( PLB s) , 研究了石斛兰对潮霉素的敏感性 , 并通
过 gus瞬时表达率比较不同类型农杆菌、侵染液浓度及乙酰丁香酮 (AS) 等对石斛兰转化的影响。结果表
明 : 带有 pCAMB IA1301的根癌农杆菌 (A grobacterium tum efaciens) EHA105 (简称为 E1301) 比带有相同表
达载体的 LBA4404 (简称 L1301) 对石斛兰的转化效率更高 , 前者约为后者的 6倍 ; 较高浓度的侵染液转
化效率更高 (OD600为 110或 112时的转化效率约为 OD600为 016或 018时的 2倍 ) ; 在农杆菌生长至 OD600值
为 018时 , 添加 AS可提高转化效率 ; 而当 OD600为 016、110和 112时 , 添加 AS反而不同程度地降低转化
效率 ; 在各种处理中 , OD600为 110时不添加 AS的转化效率最高 , 达 4414%。经过 5～6个月选择培养 , 抗
性小苗经 GUS染色、PCR和 Southern杂交检测证明为转基因植株。
关键词 : 石斛兰 ; GUS; 根癌农杆菌 ; 转化 ; Southern杂交
中国分类号 : S 682131　　文献标识号 : A　　文章编号 : 05132353X (2008) 0420565206
Study on A grobac te rium 2m ed ia ted Tran sforma tion of D endrobium
ZHANG M iao2bin, L IANG Q ing2zhong, X IAO Hao, CEN Peng, FAN Gan2qun, and PAN L i2jing3
( Zhuha i A gricu ltura l Science Research Cen tre, Zhuha i, Guangdong 519070, China)
Abstract: D endrobium ekapol‘Panda 1’was transformed by A grobacterium tum efaciens. The sensitivity
of D endrobium to hygromycin and transformation effective factors such as different strains of A grobacterium ,
bacterium concentration and acetosyringone (AS) were studied by transient gus exp ression. The results
showed that the transformation efficiency of D endrobium transformed by E1301 ( EHA105 equipped with
pCAMB IA1301) was 6 times higher than L1301 (LBA4404 equipped with the same vector). H igher concen2
tration of bacterium was more effective to transform D endrobium ( the transformation efficiency at OD600 110 or
112 was twice as OD600 016 or 018). W hen the concentration of bacterium was 018 (OD600 ) , the transforma2
tion efficiency was increased with the addition of AS. A t other concentrations (OD600 016, 110 or 112) , the
transformation efficiency was reduced with AS. Among all the treatments, the concentration of bacterium of
OD600 110 without AS gave the highest transformation efficiency of 4414%. Subjected to GUS histochem ical
staining, PCR and Southern blot analysis, the hygromycin2resistant shoots were p roved to be transformed
shoots.
Key words: D endrobium ; GUS; A grobacterium tum efaciens; transformation; southern blot
石斛属 (D endrobium ) 是兰科中最大的属 , 有药用和观赏两方面的应用价值。兰花的转基因研究
起步比较晚 , 第 1例报道是采用微粒子轰击万带兰 (Venda) 的类原球茎并检测到荧光素酶基因的表
达 (Chia et al. , 1990)。目前石斛兰的转化也有了较多的报道 ( Tee & Maziah, 2005; Cao et al. ,
2006; 陈之林 等 , 2007) , 但转化效率均较低 , 转化过程持续时间较长 , 转化受体制作繁杂。本研究
通过对影响根癌农杆菌介导基因转化效率几个因素的探讨 , 优化了石斛兰转基因体系 , 为更多具有重
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园 　　艺 　　学 　　报 35卷
要经济价值的外源基因转入石斛兰奠定基础。
1　材料与方法
111　植物材料及培养基
材料为珠海市农业科学研究中心兰花资源圃的石斛兰 ‘大熊猫 1号 ’ (D end robium ekapol‘Panda
1’) , 取其自交种子经无菌萌发而来的类原球茎 ( PLB s) 为转化受体。种子萌发培养基 : 1 /2 MS + 20
g·L - 1蔗糖 + 1 g·L - 1活性炭 + 8 g·L - 1琼脂粉 , pH 518。稀释培养基 : 1 /2 MS + 20 g·L - 1蔗糖 , 添
加或不添加 100μmol·L - 1乙酰丁香酮 (AS) , pH 515。共培养基 : 1 /2 MS + 110 mg·L - 1 BA + 20 g·
L - 1蔗糖 + 8 g·L - 1琼脂粉 + 100μmol·L - 1 AS, pH 515。选择培养基 : 1 /2 MS + 110 mg·L - 1 BA + 20
g·L - 1蔗糖 + 1 g·L - 1活性炭 + 8 g·L - 1琼脂粉 + 20 mg·L - 1潮霉素 + 250 mg·L - 1头孢霉素 , pH
518。
112　根癌农杆菌的活化与外植体的侵染
根癌农杆菌 (A grobacterium tum efaciens) EHA105和 LBA4404内带有潮霉素抗性基因 ( hpt) 和
gus基因的双元载体 pCAMB IA1301, 分别简称为 E1301和 L1301。该 gus基因包含 1个内含子 , 其表
达情况可用以判断转化效率的高低。
取 100～200μL保存于 - 70 ℃冰箱的农杆菌 , 转接到 40 mL附加卡那霉素和利福平 ( E1301) 或
链霉素 (L1301) 的 YEB液体培养基中 , 28 ℃ 200 r·m in - 1培养至一定 OD600。取 10 mL菌液 , 4℃
3 600 ×g离心 10 m in。收集菌体 , 去上清液 , 用 20 mL稀释培养基重悬菌液即成为转化石斛兰的侵染
液。稍切去 PLB s的顶端 , 将其浸入侵染液中 , 28 ℃ 180 r·m in - 1侵染 30 m in。取出 PLB s, 用灭菌滤
纸吸干 , 转入共培养基 , 25 ℃暗培养 5 d。将 PLB s转到选择培养基 , 25 ℃培养 , 光照 16 h·d - 1。约
20 d继代 1次 , 除去褐化死亡的 PLB s。
113　石斛兰对潮霉素的敏感性试验
将石斛兰 PLB s接种于含有不同浓度 (0、10、20、30、40 mg·L - 1 ) 潮霉素的培养基上 , 每 20
d转瓶一次 , 两个月后统计 PLB s存活率。
114　影响农杆菌介导石斛兰转化效率因素的研究
在以下处理中 , 均以某一个因素为变量 , 其它各因素按照上述 112节所述的转化程序为准。转化
效率的对比以共培养后 gus的瞬时表达率为依据 , 每个处理外植体 20个 , 重复 3次。
不同农杆菌菌株的影响 : 分别以 E1301和 L1301侵染液侵染石斛兰 PLB s, 比较其侵染外植体后
的 GUS染色效果。
侵染液浓度及添加 AS的影响 : E1301菌液分别培养至 OD600为 016、018、110、112时用于侵染
石斛兰 PLB s, 侵染液添加或不添加 AS, 比较各处理外植体的 GUS染色效果。
115　抗性植株的分子生物学检测
抗性石斛兰 PLB s在含潮霉素的选择培养基上筛选 5～6个月分化出叶片时进行检测。
GUS染色检测 : 参照 Jefferson等 (1987) 的 GUS染色方法进行染色。取抗性和未转化植株 (阴
性对照 , 下同 ) 浸于 X2Gluc染色液中 , 于 37 ℃保温 3～12 h后 , 用乙醇脱色 , 观察蓝色斑点形成情况。
PCR检测 : 采用改良 CTAB法提取抗性石斛兰基因组 DNA, 扩增 T2DNA区域内一段 375 bp的
hpt基因片段。引物序列 hp t1: 5′GCT GGG GCG TCG GTT TCC ACT ATC CG 3′; hp t2: 5′CGC ATA
ACA GCG CTC ATT GAC TGG AGC 3′。50μL PCR反应体系 : 模板 DNA 50 ng, 两种引物各 0125μmol
·L - 1 , Taq酶 015 U, dNTP 200μmol·L - 1。94 ℃变性 5 m in, 然后依次在 94 ℃ 1 m in, 60 ℃退火 1
m in, 72 ℃延伸 1 m in的条件下循环 30次 , 最后在 72 ℃延伸 10 m in。PCR反应结束后取样 5μL在
110%琼脂糖凝胶上进行电泳检测。
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　4期 张妙彬等 : 农杆菌介导石斛兰遗传转化的研究 　
Southern blot分析 : 取 1μg pCAMB IA1301质粒 (阳性对照 )、10μg未转化植株基因组 DNA (阴
性对照 ) 和 10μg抗性植株基因组 DNA用 H ind Ⅲ单酶切过夜 , 酶切体系为 50μL。酶切产物经过电
泳、转膜 , 然后以潮霉素抗性基因片段为探针进行 Southern杂交。探针的标记和 NBT/BC IP显色采用
D IG DNA Labeling and Detection Kit (Roche公司 ) 试剂盒 , 操作步骤按照试剂盒说明书进行。
2　结果与分析
211　潮霉素对石斛兰 PL Bs正常生长的影响
石斛兰 PLB s在含潮霉素的 1 /2MS培养基上
培养 , 两个月后观察发现 , 10 mg·L - 1的潮霉素
对石斛兰 PLB s的增殖和分化有抑制作用 , 此时
PLB s存活率只有 19149% , 大部分 PLB s表现出发
白或黄化 , 不能继续生长 ; 潮霉素增加到 20 mg
·L - 1以至更高浓度时 , PLB s全部死亡 (图 1)。
因此 , 20 mg·L - 1潮霉素可作为区分转化与未转
化石斛兰 PLB s的有效选择压。
212　影响农杆菌介导石斛兰转化效率因素的研究
21211　不同农杆菌菌株对转化效率的影响 　GUS 图 1　潮霉素对石斛兰 PL Bs的选择效果竖线代表标准误 , 下同。F ig. 1　Effects of hygrom yc in on D endrobium PL BsVertical bars indicate standard errors, the same below.
染色结果表明 , 菌株 E1301转化效率 〔gus瞬时表达率 (1213% ±012% ) 〕极显著 ( P < 0101) 高于
带有相同表达载体的菌种 L1301 (210% ±210% ) , 约为后者的 6倍。表明菌株 E1301是转化石斛兰
PLB s更有效的农杆菌菌株。
21212　侵染液浓度及 AS对转化效率的影响 　从图 2可见 , 在添加 AS的情况下 , 不同浓度 (OD600
值 ) 农杆菌侵染液的转化效率没有显著性差异。而当农杆菌生长至 OD600分别为 016、110和 112时 ,
侵染液中添加 AS比不添加 AS的转化效率低。下降幅度最大的是 OD600为 110时 , 此时不添加 AS的
转化效率约为添加 AS的 2倍。侵染液不添加 AS的各个处理中 , 较高浓度 (OD600为 110或 112) 侵
染液的转化效率约为低浓度 (OD600为 016或 018) 侵染液的 2倍。在各个处理中 , OD600为 110时不
添加 AS的转化效率最高 , 极显著 ( P < 0101) 高于 OD600为 016时添加 AS的转化效率。优化后的转
化条件使转化效率有了显著提高 , 从 1213%提高到 4414% ( P < 0105)。
图 2　不同侵染液浓度及 AS对 gus瞬时表达率的影响
数据采用 Duncanpis多重比较 ; 数字后大、小写字母分别表示处理之间达 1% , 5%水平上的显著差异。
F ig. 2　Effects of bacter ium concen tra tion s and acetosyr ingone on gus tran sien t expression of D endrobium PL Bs
A ll values were tested by Duncanpis multip le range test; Small and cap ital letters indicate
significant difference at 0101 level and 0105 level, respectively.
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213　抗性植株的分子生物学检测
21311　GUS染色检测 　结果如图 3所示 , 经染色 , 抗性植株的叶片以及根都出现蓝色或蓝色斑点 ,
而未转化的对照植株未出现蓝色。
图 3　转基因石斛兰的 GUS染色
A: 未转化植株 , 箭头所示为 GUS染色阴性的根 ; B , C: 转化的潮霉素抗性植株 ; 箭头所示为 GUS染色阳性的根。
F ig. 3　GUS h istochem ica l sta in ing of A grobacterium 2tran sform ed D endrobium
A: Untransformed D endrobium p lantlet, the arrow showed the GUS2negative root;
B, C: Transformed hygromycin2resistant shoots, the arrow showed the GUS2positive root.
21312　PCR检测 　提取 GUS染色阳性的 5株抗性植株的基因组 DNA, 并利用特异引物 ( hp t1和
hp t2) 进行 hpt基因的 PCR扩增。结果 (图 4) 表明 , 5株转化植株均扩增出 375 bp的片段 , 与预期
hpt的扩增片段大小一致 , 而未转化植株没有目的片段出现。由此初步证实了外源基因已整合到石斛
兰转化植株的基因组中。
21313　Southern杂交检测 　挑取 GUS染色和 PCR扩增都为阳性的 3个转基因株系进行 Southern杂
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　4期 张妙彬等 : 农杆菌介导石斛兰遗传转化的研究 　
交 , 结果 (图 5) 表明 , 质粒阳性对照和 3株转化小苗基因组 DNA的 H ind Ⅲ单酶切产物均可特异性
地与潮霉素抗性基因探针杂交 , 未转化的对照植株没有出现任何杂交信号。3个转化株系中 , 有 2株
出现一条杂交带 , 1株出现两条杂交带 , 证实外源基因已经整合到石斛兰转基因苗的基因组 DNA中 ,
而且表明外源基因在转化植株基因组的插入位置和拷贝数均不同。
3　讨论
311　不同农杆菌菌株对转化效率的影响
目前 , 在兰花的农杆菌法转化中主要应用的菌株是章鱼碱型农杆菌菌株 LBA4404、农杆菌碱型超
毒力菌株 EHA101和 EHA105等。
农杆菌转化单子叶植物成功的重要原因之一 , 就是采用了超毒力的农杆菌菌株和超双元载体系
统 , 从而大大增强了农杆菌的侵染能力和 T2DNA的整合能力 , 较好地克服了单子叶植物对农杆菌转
化敏感性差的问题 (王育花 等 , 2006)。EHA105是 EHA101的衍生菌 , 具有超毒力菌株 A281的染
色体背景 , 具有生长快、不结球等优良特性 , 对难于转化的植物有较佳的侵染能力。比如 , 在水稻
(王育花 等 , 2006) 和香蕉 (赵静 等 , 2006) 等报道中 EHA105的转化效率均比 LBA4404高。本研
究结果也证明了 EHA105较适合用于石斛兰 ‘大熊猫 1号’的转化。但有些转化研究也有不同的报道 ,
比如 , 在 Belarm ino和 M ii (2000) 转化蝴蝶兰的研究中 , LBA4404转化效率比 EHA101要高约一倍。L i2
au等 (2003) 分别使用 LBA4404和 EHA105工程菌转化文心兰 , 未发现它们的转化效率有显著差异。
312　乙酰丁香酮 ( AS) 对转化效率的影响
农杆菌 Ti质粒上的 V ir区编码产物负责接受外界信号、T2DNA的加工、转移及整合等功能 , 所以
该区对菌种的侵染力起决定性作用 , 因此 , 农杆菌 V ir基因的表达及表达水平的高低直接影响到转化
(刘石泉和余沛涛 , 2003)。已有大量试验表明 AS能活化 V ir区基因 , 明显提高多种植物的转化效率。
在已报道的兰花农杆菌法转化研究中 , 均认为 AS能提高转化效率。比如 , 卢毕生 ( 2005 ) 使用
LBA4404转化石斛兰时发现 , 培养基中添加 100μmol·L - 1的 AS能使抗性愈伤的获得比率提高约
7%。Men等 (2003) 发现 , 在农杆菌培养基、稀释培养基、预培养培养基及共培养基中均添加 100
μmol·L - 1的 AS能使 gus瞬时表达效果提高约 3倍。不过 , AS的使用对转化无效甚至有害已在其他
一些植物的转化上有过报道 (张七仙和敖光明 , 2001)。
在本研究中 , 当 E1301生长至 OD600为 018时 , 在侵染液中添加 100μmol·L - 1的 AS能使 gus瞬
时表达率由 1614%提高到 2711% , 这一点与卢毕生 (2005) 和 Men等 (2003) 的研究一致。但本研
究亦发现 , 在 E1301其它生长阶段 (其他 OD600值 ) 添加 AS则会不同程度地降低转化效率 , 这在兰
花的转化研究中尚未见报道。其原因可能是 AS添加到不同生长阶段的农杆菌菌液对 V ir区基因的影
响不同。有报道指出 AS的不同添加方式及不同浓度对转化效率的作用不一样 (黄永红 等 , 2007) ,
由此可见 , 添加 AS不一定就能提高转化效率。在转化过程中 , AS添加的最佳时期及其对农杆菌的
作用机理还有待进一步研究。
313　不同侵染液浓度对转化效率的影响
本研究比较了不同浓度的 EHA105工程菌转化石斛兰 PLB s的 gus瞬时表达率 , 发现使用较高浓
度侵染液 (OD600为 110和 112时 ) 转化所得的 gus瞬时表达率约为较低浓度侵染液 (OD600为 016和
018) 转化时的 2倍。这很可能是因为浸泡在较高浓度侵染液的石斛兰 PLB s上附着的 EHA105工程菌
数更多 , 因而被转化的机率更高。李杰 ( 2005) 将达到对数期的 LBA4404工程菌稀释成不同 OD600
值 , 用于侵染蝴蝶兰 , 结果表明 , 使用较高浓度菌液 (OD600分别为 014、015和 016) 转化时的抗性
PLB s获得频率均比较低浓度菌液 (OD600分别为 011、012和 013) 略高。Men等 (2003) 用农杆菌转
化石斛兰时使用的也是相对较高浓度 (OD600为 018～110) 的菌液。但 Chai等 (2002) 认为使用低浓
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度菌液侵染可以避免因农杆菌在共培养时过度繁殖而引起的 PLB s死亡。本实验室一直以来使用较高
浓度 (OD600为 016～110) 的农杆菌转化石斛兰 , 效果较好 , 而且至今未发现因农杆菌过度生长而导
致难除菌的问题。
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