全 文 ：园 　艺 　学 　报 　2005, 32 (4) : 638～642
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2004 - 10 - 18; 修回日期 : 2004 - 12 - 21
基金项目 : 国家 ‘863’计划项目 (2002AA207013)3 通讯作者 Author for correspondence ( E2mail: qinzw1957@ yahoo1com1cn)
黄瓜 NBS类型抗病基因同源序列的克隆与分析
丁国华 1, 2 　秦智伟 13 　刘宏宇 1 　周秀艳 1 　池春玉 2 　王志坤 1
(1 东北农业大学园艺学院 , 哈尔滨 150030; 2 哈尔滨师范大学阿城学院 , 阿城 150301)
摘 　要 : 简要报道利用简并引物从黄瓜基因组 DNA中分离得到 15条 NBS类型 RGA, 登录 GenBank获
得登录编号分别为 AY5554822AY555495和 AY545993。其中 10条为可通读序列 , 与已报道的甜瓜 RGA有较
高的同源性。
关键词 : 黄瓜 ; RGA; NBS
中图分类号 : S 64212　　文献标识码 : A　　文章编号 : 05132353X (2005) 0420638205
Analysis and Clon ing of NBS Class D isease Resistant Gene Analog in Cucumber
D ing Guohua1, 2 , Q in Zhiwei13 , L iu Hongyu1 , Zhou Xiuyan1 , Chi Chunyu2 , and W ang Zhikun1
(1 Horticu lture College, N ortheast A gricultural U niversity, Harbin 150030, China; 2A cheng College, Harbin N orm al U niversity,
A cheng 150301, Ch ina)
Abstract: Fifteen R2gene analogs of NBS were isolated from genom ic DNA of cucumber using degenerate
p rimer PCR, and obtained accession number from AY555482 to AY555495 and AY545993, respectively, in
GenBank. Among these RGA s were translatable and showed high sim ilarity with melonpis RGA s reported.
Key words: Cucumber; RGA; NBS
抗病基因同源序列 (Resistance gene analog, RGA ) 是一种存在于植物基因组当中的与至今已分
离出来的 30多个植物抗病基因的某些保守序列有较高同源性的 DNA片段〔1〕。许多研究证明 , 一些
RGA与抗病基因密切连锁 , 甚至就是抗病基因的一部分〔2〕。此外 , RGA标记还具有容易获得、扩增
结果稳定和使用费用低廉等优点〔3〕。因此 , 分离和克隆植物的 RGA成为当前人们比较认同的标记、
定位和克隆植物抗病基因的策略之一。分离黄瓜的 RGA不仅有助于筛选黄瓜各种抗病基因的分子标
记 , 而且通过对黄瓜 RGA的结构、表达和调控的研究 , 将有助于深入阐释黄瓜的抗病机制。当前在
瓜类作物中 , 仅从甜瓜 (Cucum is m elon L. ) 中分离了 15个 RGA片段〔4〕。本文报道了从黄瓜基因组
DNA中分离获得的 15个抗病基因同源序列及其初步分析。
1　材料与方法
111　植物材料及简并引物的设计
选取抗霜霉病黄瓜品种 ‘津春 4号 ’和 ‘649’为材料 , 取嫩叶使用 SDS方法提取基因组
DNA〔5〕。根据抗病基因产物的 NBS类型保守域的 4个亚结构域设计 4条简并引物〔1, 4〕, P1 (F) : 5piGG
NGGNGTNGGNAARACNAC3pi, P2 (R) : 5piNARNGCNARNGGNARNCC3pi, P3 (R) : 5piYCTAGTTGTRAY
DATDAYYYTRC3pi, P4 (R) : 5piCCANACRTCRTCNARNAC3pi。
112　PCR反应条件
25μL反应体系包含 10 ×buffer 215μL, 25 mmol/L MgCl2 210μL, 2 mmol/L dNTP 215μL, gDNA
模板 (50 ng /μL) 1μL, Forward p rimer (20μmol/L ) 1μL, Reverse p rimer (20μmol/L ) 1μL, Taq
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　4期 丁国华等 : 黄瓜 NBS类型抗病基因同源序列的克隆与分析 　
DNA聚合酶 (5 U /μL) 012μL, 重蒸水 15μL。 Taq DNA聚合酶为 MB I产品。反应程序 : 95℃预变
性 5 m in, 94℃变性 1 m in, 49℃退火 30 s, 72℃延伸 90 s, 40次循环 , 72℃延伸 10 m in。
113　PCR扩增产物的克隆、分类和测序
使用 115%琼脂糖凝胶和 8%的聚丙烯酰胺凝胶对 PCR产物电泳分离。使用上海华舜生物工程有
限公司小量胶回收试剂盒回收琼脂糖凝胶目的带 ; 按李卫东等〔6〕方法回收聚丙烯酰胺凝胶目的带 ,
用作模板重新 PCR扩增 , 使用琼脂糖凝胶进行电泳和目的带的回收。
使用 TaKaRa公司 pMD182T载体对回收产物进行连接 , 转化 JM109, 蓝白斑筛选 , 挑取所有阳性
单菌落 (白斑 ) 摇菌培养 , 醋酸铵方法提取质粒。酶切分类 : 使用 H infI、A su I、M ae I和 A fa I等四碱
基内切酶对提取的质粒分别酶切 , 酶切产物使用 115%琼脂糖凝胶电泳 , 根据电泳谱带是否相同进行
归类。每类选取 1～2个克隆送上海生工生物工程有限公司测序。
使用 B lastn和 B lastx在 GenBank数据库中进行同源性序列搜索 , 使用 ClustalW进行序列比较。
2　结果与分析
211　黄瓜基因组中 NBS类型的 RGA
图 1显示引物组合 P1 + P2、P1 + P3和 P1 + P4在黄瓜津春 4号上均有较好的扩增 , 但 P1 + P2组
合扩增带与 P1的单引物对照有一定的重复 , 未作回收。P1 + P3组合扩增带被回收、克隆 , 由于转化
效果不佳 , 只得到 13个克隆 , 其中克隆 p13212经测序后含有 NBS保守域 , 被确定为 CsRGA2。
P1 + P4组合扩增带被回收、克隆 , 得到 48个克隆 , 经 PCR2PAGE方法 (按简并引物 PCR反应
体系和程序 , 模板用 1μL菌液代替 , 扩增产物进行 PAGE, 使用凝胶图象分析软件标定扩增产物的
bp数量 , 有相同 bp数量扩增带的克隆归为一类 ) 归类后测序 , 其中 18个克隆含有 P2loop和 kinase 2
保守域 , 根据同源性比对 , 核苷酸序列同源性达到 97%归为同一类 , 分别被确定为 CsRGA 6～15,
具体特征见表 1。
图 1　引物在 ‘津春 4号’黄瓜上的扩增结果
F ig. 1　The am plif ied products w ith pr im er on ‘J inchun 4’
1. P1 +P4; 2. P1 +P3; 3. P1 +P2; 4. P4; 5. P3; 6. P2; 7. P1
图 2　引物在 ‘ 649’黄瓜上的扩增结果
F ig. 2　The am plif ied products w ith pr im er on ‘649’
1. P1 + P4; 2. P1 + P3; 3. P4; 4. P3; 5. P1
图 2显示 P1 + P3和 P1 + P4在黄瓜 ‘649’上的扩增结果。其中 P1 + P4组合在 ‘649’上有较好
的特异扩增 , 该带被回收、克隆 , 得到 48个克隆 , 经酶切和 PCR2PAGE归类后 , 选取其中 12个克隆
测序 , 核苷酸同源性 97%以上为同一类 , 分别被确定为 CsRGA1、3和 4, 具体特征见表 1。
为增加分辨率 , 将 P1和 P2组合的扩增产物进行 PAGE (图 3) , 得到约 530 bp和 870 bp两条双
引物扩增带 , 回收其中 530 bp带 , 使用原引物组合重新扩增、回收并克隆 , 获得 72个克隆 , 4种四
碱基内切酶酶切分类 , 共分为 13类 , 各取 1个克隆测序 , 其中同时含有 P2loop和 HD (即 GLPLAL )
保守域结构的克隆 4个 , 两端都是 HD结构的 2个 , 其余克隆无任何保守域结构。经进一步的序列分
析 , 发现含有两个保守域结构的克隆序列中没有预想的 kinase 2和 kinase 3a两个特征保守域。重新对
870 bp的条带进行回收克隆 , 因转化效果不好 , 只得到 11个转化菌落 , 其中 p10827测序后含有所有
预想的 NBS保守域 , 被确定为 CsRGA5。
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212　已克隆的 15个 C sRGA的基本特征
所有测序克隆在 GenBank 上进行 B lastn 和
B lastx比对 , 多数克隆与 B rotman 公布的甜瓜
(Cucum is m elon L. ) RGA有较高的同源性〔4〕, 少
数克隆没有较高同源性基因序列。选取其中 15类
克隆序列提交 GenBank, 获得登录编号 (表 1)。
15个 CsRGA 中 , CsRGA10、12、13、14 和
15的核苷酸序列中存在终止密码 , 为不完全翻译
序列 , 其余 CsRGA均可通读。
对 15个 CsRGA中可通读的 10个 CsRGA进
行了氨基酸序列比对 , 所比对的氨基酸序列来自
各自的核苷酸序列的推测翻译 , 比对结果见图 4。
仔细比较可看出 , CsRGA2、CsRGA4和 CsRGA5
的同源性较高 , 差异的氨基酸表现在 CsRGA4第
18位氨基酸为 G (甘氨酸 ) , CsRGA2和 CsRGA5
为 D (天冬氨酸 ) ; CsRGA5的第 63位氨基酸为
G, CsRGA2和 CsRGA4为 E (谷氨酸 ) ; 第 106
位氨基酸 CsRGA5是 R (精氨酸 ) , CsRGA2是 K
(赖氨酸 )。其它 CsRGA之间的氨基酸有较大的
差异 , 其中 CsRGA7与 CsRGA9相比较 , 在第 10
～22位缺失了 13个氨基酸 , 这种大量氨基酸的
缺失与其功能应当是相一致的 , 即暗示了 CsR2
GA7在某个基因中所起的作用与 CsRGA6、CsR2
GA8和 CsRGA9存在差异 , 这种差异还需通过功
能的表达分析来加以验证。
表 1　从黄瓜基因组中克隆到的 NBS类型 RGA片段
Table 1　The RGA s of NBS am plif ied from genom ic D NA
of cucum ber w ith degenera te pr im ers
RGA
通读性
Transl2
ating
长度
Length
( bp)
保守域 Conservative domain
P2loop kinase 2 kinase 3 HD 登录编号Accession
CsRGA1 + 252 + + - - AY555482
CsRGA2 + 336 + + + - AY555483
CsRGA3 + 255 + + - - AY555484
CsRGA4 + 258 + + - - AY555485
CsRGA5 + 520 + + + + AY555486
CsRGA6 + 243 + + - - AY555487
CsRGA7 + 205 + + - - AY555488
CsRGA8 + 243 + + - - AY555489
CsRGA9 + 243 + + - - AY545993
CsRGA10 - 288 + + - - AY555490
CsRGA11 + 267 + + - - AY555491
CsRGA12 - 168 + + - - AY555492
CsRGA13 - 277 + + - - AY555493
CsRGA14 - 227 + + - - AY555494
CsRGA15 - 168 + + - - AY555495
图 3　引物 P1 + P2在 ‘649’黄瓜上的扩增产物 PAGE结果
F ig. 3　The PAGE show ing the am plif ied products w ith pr im er
P1 + P2 on cucum ber‘649’
图 4　10个可读 C sRGA的氨基酸比对图示 (使用 C lusta lW )
F ig. 4　The com par ison on am ino ac id of 10 C sRGA w ith C lusta lW program
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　　使用 B lastx在 GenBank上进行同源搜索 , CsRGA1～11均与甜瓜 RGA有最高的得分 (表 2) , 说
明在 RGA序列上体现了两者较近的亲缘关系。但全部 CsRGA与甜瓜 RGA没有出现 100%的相同率
( identities) , 也说明了两者同科不同属的关系。除甜瓜 RGA外 , 上述黄瓜 CsRGA还搜索出大量得分
较高的相关序列。其它 5个 CsRGA均为不完全翻译序列 (内含终止密码 )。其中 CsRGA10与甜瓜假
基因 NBS23724有 93%的相同率 ( identities = 243 /261) , 但与其相关的其它序列多数是某些植物叶绿
体基因。CsRGA13与黄瓜 Cucum is sa tivus的一种卫星 DNA ( satellite DNA, type IV ) 存在 88%的相同
率 ( identities = 129 /145) , 得分为 161 bits。CsRGA12和 15的所有搜索结果的得分都在 40以下 , 基
本没有相近的序列 , 应该是黄瓜的未明功能序列。CsRGA14与黄瓜线粒体基因的一个克隆有 5011的
得分 , 但仅比对了其中 68个核苷酸 , 相同率为 9216% ( identities = 63 /68) , 其余序列与较多植物的
某些序列有部分 (20个左右核苷酸 ) 的相同率。
表 2　在 GenBank上 Bla stx得分最高的搜索结果
Table 2　The h ighest score results of hom ologous search ing on GenBank w ith Bla stx
被检序列
Query sequence
检出序列
Subject sequences
来源
O rganism
得分
Score ( bits)
期望值
Expect
其它相关序列数量
Total related sequences
CsRGA1 NBS25 Cucum is m elo 116 2e226 101 (80)
CsRGA2 NBS22622 Cucum is m elo 148 3e235 100 (68)
CsRGA3 Putative resistance gene homologue Cucum is m elo 157 3e238 100 (82)
CsRGA4 NBS22622 Cucum is m elo 148 3e235 101 (62)
CsRGA5 NBS22622 Cucum is m elo 131 5e230 100 (97)
CsRGA6 NBS21725 Cucum is m elo 120 8e227 100 (72)
CsRGA7 NBS242212 Cucum is m elo 9519 2e219 103 (48)
CsRGA8 NBS242212 Cucum is m elo 113 9e225 100 (73)
CsRGA9 NBS242212 Cucum is m elo 159 2e238 100 (71)3 CsRGA10 NBS23724 p seudogene, partial sequence Cucum is m elo 375 e2101 185 (105)
CsRGA11 NBS23 Cucum is m elo 4112 01004 16 (31)
CsRGA12 Putative p rotein A rabidopsis thaliana 3116 319 　3 (28)3 CsRGA13 Satellite DNA, type IV Cucum is sa tivus 161 8e237 31 (44)3 CsRGA14 Clone B21F m itochondrial genom ic sequence Cucum is sa tivus 5011 01002 85 (38)3 CsRGA15 Unnamed p rotein p roduct O ryza sativa 4011 112 21 (40)
　　注 : 带 3 者进行 B lastn比对。“其它相关序列数量”中括号内数字为最高得分。“期望值”中 e为自然对数。
Note: The sequence with“3 ”blasted byB lastn; The number in the bracket of“Total related sequences” is the highest score. “e” is the
natural logarithm.
3　讨论
利用抗病基因同源序列克隆抗病基因是当前人们普遍认同的克隆基因的方法〔7, 8〕, 但遗憾的是该
方法自 1996年出现至今还没有成功地克隆出抗病基因。尽管如此 , 使用图位克隆方法分离出来的玉
米抗锈病基因 R p12D〔1〕和拟南芥抗霜霉病基因 R PP8〔9〕被用紧密连锁的 RGA探针从基因组文库中成功
地筛选出来 , 说明 RGA在克隆抗病基因方面所具有的潜在能力。RGA在植物基因组中大量存在 , 与
抗病基因相关的 RGA只是其中一部分。不过就现有的 RGA的研究来看 , NBS类保守域基本只出现在
抗病基因当中 , 而 STK ( PK) 类和 LRR类的出现比较复杂。为此 , 本试验选择了 NBS保守域为克隆
对象 , 分离出大量的 RGA, 分析其存在特点 , 并希望从中得到与某些黄瓜抗病基因紧密连锁的 RGA
片段。
本研究克隆到了 15个同时具有特征保守域结构的黄瓜 RGA, 其中具有 4个完整 NBS亚保守域结
构的克隆只有 CsRGA5, 具有其中 3个亚保守域的克隆也仅有 CsRGA2。其余克隆都只有 kinase 1a和
kinase 2亚保守域 , 克隆片段长度为 250 bp左右。有关黄瓜 RGA的研究未见报道 , 本试验克隆出的
黄瓜完整 NBS结构的 RGA的数量相比其它植物低得多 , 还需要进一步的试验对该特点加以确认。事
实上黄瓜的同属植物甜瓜也存在类似的问题 , B rotman分离到的 14个甜瓜 RGA中 , 具有完整 NBS结
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构域的片段只有 2个 , NBS22和 NBS27, 其中后者为假基因 , 内含终止密码〔4〕。目前还不能断定该特
点是否是 Cucum is的共同特征。
15个黄瓜 RGA中 , 有 10个为可翻译序列 , 其推定产物在 GenBank上进行同源性比对后 , 可以
看出与许多抗病蛋白有较高的同源性。表现同源性最高的是与 B rotman公布的甜瓜 RGA, 其中核苷酸
水平上经 DNAMAN410比对 , 同源性都在 50%以上 ; 比较高的有 CsRGA9与 NBS242212 ( 94% )、
CsRGA9与 NBS21725 ( 81% )、 CsRGA3 与 NBS22322 ( 93% )、 CsRGA1 与 NBS21 ( 91% ) 以 及
CsRGA2, 4, 5与 NBS22622 (89% ) , 充分反映了两者同属不同种的近缘的亲缘关系。
另外 5个 RGA内部存在终止密码 , 为不可或不能完全翻译序列。B last比对发现 CsRGA10与甜瓜
假基因 NBS23724得分达 375 bits, DNAMAN410比对后发现与烟草 N 基因有 66%的同源性〔10〕, 表明
了该克隆片段可被确定为抗病基因同源序列 ( RGA )。CsRGA13和 14均与黄瓜自身序列部分同源
(卫星 DNA和线粒体基因组序列 ) , 有可能不属于 RGA类序列。CsRGA12和 15没有同源性高的已知
序列 , 可部分翻译序列的产物分别与拟南芥和水稻的未知蛋白同源 , 因此这两个片段是否属于 RGA
类序列有待确认。
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