全 文 ：园 艺 学 报 2001, 28 ( 4) : 361~ 363
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期: 2001- 03- 06; 修回日期: 2001- 05- 24
基金项目: 国家自然科学基金资助项目 (39960065)
萝卜抗真菌蛋白基因 RsAFPs 在大肠杆菌中的表达及其转
化番茄的研究
邓晓东1 费小雯2 胡新文1
(
1热带作物生物技术国家重点实验室, 海口 571101; 2 中山大学生命科学学院生物工程中心, 广州
510275)
摘 要: 通过基因工程手段将萝卜抗真菌蛋白基因 RsAFP1( 2)插入大肠杆菌表达载体
pTrxFus中并诱导表达, 其融合表达产物约 22 kD, 约占总可溶蛋白的 0. 45% ( 0. 5% )。抑菌活
性试验表明: 重组 RsAFP1( 2)有抑菌活性, 其中 RsAFP2 较 RsAFP1 抑菌活性强。构建了 Rs
AFP2基因的植物表达载体 pBIAFP2。利用农杆菌介导法将 pBIAFP2导入番茄中, 并诱导出完整
的植株 32株。对其中 28 株进行 PCR 和 PCRSouthern Blot检测, 其中 17 株呈阳性。对经 PCR
Southern Blot检测呈阳性的植株进行 Southern Blot检测, 6株呈阳性。
关键词: 萝卜抗真菌蛋白; 基因; 大肠杆菌; 表达; 转基因; 番茄
中图分类号: Q 78; S 641. 2 文献标识码: A 文章编号: 0513353X ( 2001) 04036103
1 目的、材料与方法
萝卜抗真菌蛋白 ( Raphnus sativusantifungal proteins, RsAFPs) 是 Terras 等1 从萝卜
( Raphanus sativus L. ) 分离的一类 5. 5 kD富含半胱氨酸的抗真菌蛋白质。本研究拟将 Rs
AFP 1( 2)基因导入大肠杆菌中表达, 以获得具有抑菌活性的表达产物, 并通过构建植物表达
载体, 将 RsAFP2基因导入番茄中, 以期获得抗病番茄材料。
含 RsAFP1 和 RsAFP2基因的质粒 pAFP1 和 pAFP2由胡新文博士构建2 , 其余载体和
菌株均由本实验室提供。为了便于操作, 设计并合成如下引物: p1: 5! CTGTGGATC
CACAGAAGTTGTGCGAAAG3! ; p2: 5!CTGTGGATCCACAGAAGTTGTGTCAGAG3! ; p3: 5!
CAAGCACTTAGTGATTGG3! ; sp6: 5!GATTTAGGTGACACTATAG3! 。分别以 p1、sp6和 p2、
sp6为引物, 对 RsAFP1( 2)成熟肽基因PCR扩增, BamHI+ Sal I酶切后, 插入 pTrxFus表达
载体中, 转化 E . coli GI724。重组质粒经诱导表达后进行SDSPAGE, 并用BACKMAN公司
DU70光谱扫描仪对表达的融合蛋白进行薄层扫描定量。按参考文献 3 方法, 收集表
达后菌液, 初步纯化蛋白, 进行抑菌试验。与此类似, 构建了植物表达载体 pBIAFP2, 通
过三亲交配的方法将 pBIAFP2 转入农杆菌, 并通过叶盘法将外植体与农杆菌共培养, 将经
Kan 50 mg/L 筛选得到的抗性芽转入含 Kan 50 mg/ L 的生根培养基上生根, 而后将植株移
栽至花盆, 以 PCR、PCRSouthern Blot和 Southern Blot对再生植株进行检测。
2 结果与分析
2. 1 大肠杆菌表达载体的构建及在 E. col i GI724中诱导表达 重组质粒 pTrxAFP1( 2)经
PCR鉴定, 能扩增出约 230 bp 的片断, 证明外源基因 RsAFP1( 2) 已插入其中。经 SDS
PAGE 后, pTrx AFP1( 2) 在 E . col i GI724 中有表达。与空载质粒 pTrxFus/ GI724 比较, 在
22 kD处多出一条蛋白带 (图 1)。其中, pTrxAFP2/ GI724, pTrxAFP1/ GI724所产生的融合蛋
白经薄层扫描后测定其含量约占总可溶蛋白的 0. 45%和 0. 5%。抑菌试验表明, RsAFP1( 2)
表达产物均有一定生物活性。其中重组 RsAFP2 的抑菌活性高于重组RsAFP1(图 2)。
图 1 pTrxAFP1(2)在 E. coli GI724中诱导表达结果
Fig. 1 The results of pTrxAFP1(2) expressing
in E. coli GI724
1. pTrxFus /GI724, induced for 4 h; 2. pTrxAFP2/ GI724,
induced for 4 h; 3. pTrxAFP2/GI724, induced for 3 h;
4. pTrxAFP2/ GI724, induced for 2 h; 5. pTrxAFP2/ GI724,
induced for 1 h; 6. pTrxAFP1/GI724, induced for 4 h.
2. 2 转基因植株的检测结果 RsAFP2 基
图 2 表达产物抑菌实验
Fig. 2 The inhibition experiment of expression products
1. pTrxAFP2/GI724; 2. pTrxFUS/ GI724;
3. pTrxAFP1/GI724; 4. pTrxFUS/ GI724.
因插入表达载体 pBI121中, 构建出植物表达载体 pBIAFP2。含 pBIAFP2质粒的农杆菌转化
番茄 (美国1号) 共得到32株再生苗。对其中28株进行PCR检测, 17株呈阳性。部分植
株检测结果如图 3, A。Lane 4~ 6、8~ 11样品对应于植株 1~ 3、5~ 8, 有约 230 bp的目
的DNA片段扩增出来。Lane 2为正常番茄植株总 DNA PCR扩增结果 ( CK- ) , Lane 3为质
粒pBIAFP2 PCR扩增结果 ( CK+ )。Lane 7样品未扩增出目的带 (对应于植株4)。上述PCR
产物呈阳性的 17株经 PCRSouthern Blot检测也呈阳性。对 1~ 8株检测结果如图 3, B。上
述经 PCRSouthern Blot检测呈阳性的植株, 取其总 DNA 10 g 经 BamHI+ SacI酶切后进行
图 3 转基因植株的 PCR ( A) 和 PCRSouthern Blot ( B) 检测结果
1. 分子量标准; 2. 正常番茄 PCR 扩增结果 ( CK- ) ; 3. pBIAFP2 PCR扩增结果 ( CK+ ) ;
4~ 11. Kan抗性筛选的植株 1~ 8扩增结果。
Fig. 3 The PCR ( A) and PCRSouthern ( B) analysis of transgenic plants
1. PCR Marker; 2. The PCR results of nontransgenic tomato ( CK- ) ; 3. The PCR results of pBIAFP2 ( CK+ ) ;
4- 11. The PCR results of plantlets ( 1- 8) screened from Kan medium.
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Southern Blot 检测, 其中 6株检测呈阳性。
部分样品检测结果如图 4所示, 对照于总
DNA电泳后的 Marker, 可知 Lane 2~ 5, 7
的杂交条带约为 230 bp, 说明 RsAFP 2 基
因已插入上述植株基因组 DNA中。
本试验中, 重组 RsAFP2 抑菌效果较
好。由于 RsAFP1( 2)有较强的热稳定性和耐
酸碱能力, 故有极好的作为生物杀菌剂开
发的潜力。本试验通过基因工程的方法向
番茄良种导入抗真菌蛋白的基因, 但要保
持该基因的稳定遗传及获得较好的抗病效
果, 还有较多的工作要做。
图 4 转基因植株的 Southern Blot检测结果
1. 正常番茄总 DNA/ BamHI+ Sac I Southern Blot 结果
( CK- ) ; 2~ 7. 植株 3, 5, 18, 20, 23, 25总
DNA/ BamHI+ Sac I Southern Blot结果。
Fig. 4 The Southern Blot results of transgenic plants
1. The Southern Blot results of nontransgenic tomato total
DNA/ BamHI+ Sac I ( CK- ) ; 2- 7. The Southern
Blot result s of plant lets ( 3, 5, 18, 20, 23, 25)
total DNA/ BamHI+ Sac I.
参考文献:
1 Terras F R, Toorekens S, Van Leuven F, et al . A new family of basic cysteinerich plant ant ifungal proteins from Brassi caceae
species. FEBS. Lett , 1993, 316: 233~ 240
2 胡新文, 郭建春, 郑学勤. 抗真菌蛋白 RsAFPS 基因克隆与序列分析. 热带作物学报, 1998, 19 (3) : 57~ 63
3 胡新文, 郭建春, 郑学勤. 抗真菌蛋白 RsAFPS生物学活性的研究. 热带作物学报, 1998, 19 ( 2) : 36~ 42
The Expression of Raphnus sativusAntifungal Protein Gene and Its Transformation
into Tomato
Deng Xiaodong
1
, Fei Xiaowen
2
, and Hu Xinwen
1
( 1National Key Biotechnology Laboratory for Tropical Crop s, CATAS , Haikou 571101; 2The College of Life Science,
Zhongshan University , Guangzhou 510275)
Abstract: Raphnus sativusantifungal proteins ( RsAFPs ) are cysteinerich, antifungal proteins. The Rs
AFP1(2) genes were inserted into the vector pTrxFus and transferred into E. coli GI724. The fusion protein from recombi
nant pTrxAFP1( 2) was about 22 kD and taking up 0. 4 and 0. 5 percent of the total proteins respectively. Inhibition
experiment showed that the expressed products had antifungal activity to Colletotrichum musae. Expressed products from
pTrxAFP2 showed much stronger inhibitory activity than that from pTrxAFP1. A plant expression vector pBIAFP2 was
constructed, which had been transferred into tomato by Agrobactrium mediated transformation. 32 plantlets had been
obtained and 28 of them detected by PCR and PCRSouthern Blot. The results showed that 17 of them were positive,
and the results of Southern Blot showed 6 of them were positive.
Key words: Raphnus sativusantifungal proteins ( RsAFPs) ; Gene expression; E. coli ; Transgenic; Tomato
信 息 中国园艺学会设施园艺分会成立
∀ 中国园艺学会设施园艺分会成立大会暨学术讨论会# 于 2001年 8 月 18日在中国农业科学院蔬菜花
卉研究所召开。中国园艺学会理事长朱德蔚、学会及分会挂靠单位中国农业科学院蔬菜花卉研究所所长
屈冬玉以及来自全国 20多个单位的代表参加了会议。李天来、王志强、周长吉做了学术报告。中国农
业科学院蔬菜花卉研究所张志斌研究员当选为分会会长。代表们就分会章程及工作计划进行了讨论。
3634期 邓晓东等: 萝卜抗真菌蛋白基因 RsAFPs 在大肠杆菌中的表达及其转化番茄的研究