全 文 ：园 　艺 　学 　报 　2004 , 31 (5) : 617～622
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2003 - 11 - 27 ; 修回日期 : 2004 - 04 - 19
基金项目 : 北京市科技新星计划项目 (954812800) ; 北京市自然科学基金项目 (5012006) ; 国家‘863’计划项目 (2002AA244021 ,
2002AA20701223)
黄瓜分子遗传图谱的构建
张海英1 　葛风伟2 　王永健1 　许　勇1 　陈青君2
(1 国家蔬菜工程技术研究中心 , 北京 100089 ; 2 新疆农业大学园艺系 , 乌鲁木齐 830052)
摘 　要 : 利用黄瓜 ( Cucumis sativus L . ) 欧洲温室生态型栽培种高代自交系‘欧洲八号’和华北露地
生态型品种‘秋棚’杂交获得的 140 份重组自交系 , 采用 AFL P、SSR、RAPD 分子标记进行遗传分析 , 构
建了包含 9 个连锁组群 , 由 234 个标记组成的连锁图谱 , 其中包括 141 个 AFL P 标记、4 个 SSR 标记和 89
个 RAPD 标记 , 覆盖基因组 72715 cM , 平均图距 311 cM。
关键词 : 黄瓜 ; 分子遗传图谱 ; AFL P ; SSR ; RAPD
中图分类号 : S 64212 　　文献标识码 : A 　　文章编号 : 05132353X (2004) 0520617206
Construction of A Reference Linkage Map for Cucumber
Zhang Haiying1 , Ge Fengwei2 , Wang Yongjian1 , Xu Yong1 , and Chen Qingjun2
(1 N ational Engineering Research Center f or V egetable , Beijing 100089 , China ; 2 Depart ment of Horticulture , Xinjiang A2
gricultural U niversity , U rumchi 830052 , China)
Abstract : A 234 point map of cucumber was constructed from a narrow cross between Cucum is
sativ us L . ‘European 8’and a line from‘Qiupeng’, a cultivar of northern China open field type. The
map composed 141 AFL PSs , 4 SSRs and 89 RAPDs and delineated 9 linkage groups spanned 72715 cM
with an average distance of 311 cM between the markers. Since there are seven pairs of chromosomes in cu2
cumber and we delineated 9 linkage groups , the map is no fully saturated.
Key words : Cucumber ; Genetic map ; AFL Ps ; SSRs ; RAPDs
黄瓜遗传基础狭窄 , RFL P 显示的多态性仅为 3 %～9 %〔1〕, 相对于其他异花授粉作物〔2 ,3〕, 与自
花授粉作物更近似〔4〕, 因此其遗传图谱的构建进展比较缓慢。已经利用各种标记先后构建了 6 张黄瓜
遗传图谱 , Fanourakis 等〔5〕利用形态学标记构建的图谱长度为 168 cM , Knerr 等〔6〕利用同工酶标记构
建的图谱长度为 166 cM , Meglic 等〔7〕利用同工酶和形态学标记构建的的图谱长度为 584 cM , Kennard
和 Serquen 分别利用分子标记 ( RAPD、RFL P) 和形态学标记〔8 ,9〕构建的图谱长度分别为 766 cM、
480 cM 和 600 cM。然而 , 目前发表的遗传图谱主要存在以下几个问题 : 一是图谱密度相对不饱和 ,
平均标记间隔为 8～10 cM。二是目前已经发表的各类形态学基因总数已经达到 132 个 , 但在图谱中
被定位的基因只有 52 个 , 所占比例为 60 % , 与重要经济性状紧密连锁的标记 (5 cM) 非常少。三是
作图亲本多利用加工类型黄瓜 , 而我国的黄瓜以鲜食品种为主 , 加工黄瓜所占的比例很小。四是现有
作图群体多为非永久群体 ( F2) , 无法在此基础上进行深入研究 , 更难与其他实验室合作进行比较研
究。本研究利用欧洲温室生态型黄瓜栽培种高代自交系和华北露地型生态型黄瓜品种配制杂交组合 ,
通过单粒传构建重组自交系 , 采用 RAPD、SSR、AFL P 技术来构建黄瓜永久分子图谱 , 这将为进一
步开展重要数量性状如产量、雌性、抗病性的 Q TL 定位打下良好基础。
1 　材料与方法
父本为‘欧洲八号’, 是欧洲温室型生态品种高代自交系 , 来源于欧洲 , 持续生长 , 结果能力强 ,
适宜长季节栽培 , 光补偿点低 , 耐低温弱光 , 不合成苦味素 , 果皮光滑有光泽 , 全雌性。母本是‘秋
棚’, 是华北露地生态型品种 , 由北京市农林科学院蔬菜研究中心提供 , 抗霜霉病、白粉病、黄瓜花
叶病毒、小西葫芦黄化花叶病毒、西瓜花叶病毒 1 号、西瓜花叶病毒 2 号等 , 光补偿点高 , 在露地强
光下叶绿体不受损伤。两者通过一粒传的形式连续自交 6 代 , 最终获得 140 个 F6群体用于图谱构建。
每个自交系取 20 株幼叶混合 , 用于提取 DNA。
采用 CTAB 法提取亲本及群体基因组 DNA。用 Eppendorf 蛋白核酸测定仪测定 DNA 浓度。
AFL P 分析 : 采用 GIBCOBRL 公司的 AFL PTM Analysis System (试剂盒 , 内切酶为 EcoR Ⅰ和 Mse
Ⅰ。酶切反应体系 (1215μL 体系) 为 : EcoR Ⅰ/ Mse Ⅰ1125 U , 5 ×reactione buffer , 250 ng DNA 和
ddH2O。37 ℃酶切过夜 , 然后 70 ℃停止反应。连接反应体系为 : 12μL adapter ligation solution , 016
μL T4 Ligase , 1215μL 酶切反应产物 , 20 ℃连接 3 h。预扩增反应体系为 : 20μL pre2amp primer mix ,
215μL 10 ×PCR buffer , 5 U Taq 酶 , 215μL 连接反应产物 ; 扩增程序为 : 94 ℃/ 30 s →56 ℃/ 1 min →
72 ℃/ 1 min →20 循环。预扩增产物稀释 10 倍后进行选择扩增。取 AFL P 扩增样品与上样缓冲液
(98 %甲酰胺 , 10 mmol/ L ED TA , 0105 %溴酚蓝 , 0105 %二甲苯青) 各 5μL 混合 , 94 ℃变性 5 min ,
立即置于冰上冷却。每个样品取 5μL 上样 , 用 6 %的聚丙烯酰胺凝胶电泳 , 75 W 恒功率电泳约 115
h , 终止电泳。最后进行银染显色。
RAPD 分析 : 25μL 的反应体系中含有 10 ×buffer ( Tri2HCl 10mmol/ L p H 810 , KCl 50 mmol/ L ,
MgCl2 210 mmol/ L) 215μL , 215 mmol/ L dN TP 210μL , , 引物 30 ng , TaqE 1 U , 模板 DNA 10 ng。
RAPD 引物购自上海生工公司 , dN TP 购自上海生工公司 , TaqE 购自天为时代公司。反应程序为
94 ℃预变性 5 min , 94 ℃变性 30 s , 37 ℃退火 30 s , 72 ℃延伸 1 min , 35 个循环 , 72 ℃保温 7 min。
PCR 仪为美国 PE 公司生产的 PE2480 扩增仪。取 10μL 反应产物 , 与 2μL 溴酚蓝 (0125 %溴酚蓝 ,
40 %蔗糖水溶液) 混匀 , 点入含 015 mg/ L EB 的 115 %琼脂糖凝胶中 , 在 5 V/ cm 电场强度下电泳 1
～2 h , 以 GeneRulerTM 100 bp DNA Ladder Plus 作为标准分子量标记 (MB I 分装) , 确定 DNA 片段在
胶上的相对位置 , 利用 Kodak EDAS2120 凝胶分析仪进行凝胶分析。
SSR 分析 : 25μL 的反应体系中含有 10 ×buffer ( Tri2HCl 10 mmol/ L p H 810 , KCl 50 mmol/ L ,
MgCl2 210 mmol/ L) 215μL , 215 mmol/ L dN TP 210μL , , 引物 30 ng , TaqE 1 U , 模板 DNA 10 ng。
引物序列来自美国 Wisconsin Staub J E 实验室 , 由上海生工公司合成 , dN TP 购自上海生工公司 ,
TaqE 购自北京天为时代公司。反应程序为 94 ℃预变性 5 min , 94 ℃变性 1 min , 45～60 ℃退火 45 s ,
72 ℃延伸 1 min , 40 个循环 , 72 ℃保温 7 min。PCR 仪为德国 Eppendorf 公司生产的 Mastercycler Gra2
dient PCR 扩增仪。取 SSR 扩增样品与上样缓冲液 (98 %甲酰胺 , 10 mmol/ L ED TA , 0105 %溴酚蓝 ,
0105 %二甲苯青) 各 5μL 混合 , 94 ℃变性 5 min , 立即置于冰上冷却。每个样品取 5μL 上样 , 用 6 %
的聚丙烯酰胺凝胶电泳 , 75 W 恒功率电泳约 115 h , 终止电泳。最后进行银染显色。
数据记录及连锁分析 : 来自父本‘秋棚’的纯合带型记为“A”, 来自母本‘欧洲八号’的纯合带型记
为“B”, 模糊不清或者丢失的带记为“ - ”。RAPD 标记的命名是采用引物加上其片段大小 , AFLP 和 SSR
标记命名采用引物组号加片段分子量大小。采用JoinMap 310 分析数据。用最小 LOD (Log of Odd ratio) 值
410 , 最大重组率 (Recombination value) 0149 将标记进行分组。每个分组的连锁群内 , 用最小LOD 310 和最
大重组率 0125 进行排序。采用“Kosambi”函数计算图距。
2 　结果与分析
211 　分子标记的多态性分析
RAPD 试验首先选用 620 条随机引物对两个亲本进行多态性引物筛选 , 共发现 79 条引物 (表 1)
具有多态性 , 多态性比例 1217 %。
816 园 　　艺 　　学 　　报 31 卷
　　AFLP 试验中 , 首先利用 32 对
AFLP 引物组合 ( E2 + / M3 + ) 对两个
亲本进行多态性引物对筛选 , 选用其中
9 对引物 (表 2) 可以产生较多清晰的、
多态性多的片段。9 对引物组合共产生
585 个 AFLP 片段 , 平均每对引物获得
62 条扩增条带 , 其中 200 个扩增片段表
现多态性 , 多态性比例为 3412 %。
SSR 试验中 , 根据美国 Wisconsin
大学 Staub J E实验室提供的引物序列随
机选取合成了 12 对 SSR 引物 , 只发现
2 对引物 (CMAG59 , 5piTTGGGTGGC
AATGAGGAA3pi, 5piATATGATCTTCCATT
TCCA3pi; CSWCT05 , 5piCTTGTTCCCACT
CACA3pi, 5piGGTTCCGATTTATTACTT 3pi)
在亲本中存在显著差异 , 多态比例为
1617 %。
212 　扩增条带分离分析
RAPD 试验中 , 8 条在亲本筛选中
表现 差 异 的 引 物 ( AH11 , AH13 ,
AI8 , AI11 , AL3 , V3 , I1 , C13) 对
重组自交系群体进行 PCR 扩增时表现
无差异 , 其余 71 条扩增获得 117 个多
态性位点 , 平均每个引物获得 116 条
带。对这些多态性位点的分离比例进
行卡方检验 ( P < 0105) , 只有 92 个位
点符合 1∶1 的分离比例 , 其余 25 个多
态性位点由于条带模糊或不符合分离
比例而忽略 , 偏分离频率为 2114 %
(表 3) 。AFL P 试验中 , 9 对引物对共
产生 200 个多态性条带 , 对这些多态
性位点的分离比例进行卡方检验 ( P <
0105) , 只有 150 个位点符合 1∶1 的分
离比例 , 其余 60 个多态性位点由于条
表 1 　用于图谱分析的 RAPD 引物碱基序列
Table 1 　The nucleotide sequence of RAPD primers used in the mapping analysis
名称
Primers
序列
Sequence
名称
Primers
序列
Sequence
名称
Primers
序列
Sequence
OPA05 AGGGGTCTTGOPM07 CCGTGACTCA OPZ12 TCAACGGGAC
OPB11 GTAGACCCGT OPM11 GTCCACTGTG OPAI03 GGGTCCAAAG
OPC04 CCGCATCTAC OPM14 AGGGTCGTTC OPAI04 CTATCCTGCC
OPC18 TGAGTGGGTGOPM18 CACCATCCGT OPAI09 TCGCTGGTGT
OPC19 GTTGCCAGCC OPN01 CTCACGTTGG OPAI14 TGGTGCACTC
OPC20 ACTTCGCCAC OPN07 CAGCCCAGAG OPAJ03 AGCACCTCGT
OPD19 CTGGGGACTT OPN12 TGCCGGCTTG OPAJ10 GTTACCGCGA
OPE02 GGTGCGGGAA OPN13 AGCGTCACTC OPAJ11 GAACGCTGCC
OPE09 CTTCACCCGA OPN14 TCGTGCGGGT OPAJ15 GAATCCGGCA
OPE18 GGACTGCAGA OPN15 CAGCGACTGT OPAJ16 TCTGGACCGA
OPF01 ACGGATCCTG OPN18 GGTGAGGTCA OPAJ17 ACCCCCTATG
OPF10 GGAAGCTTGGOPN20 GGTGCTCCGT OPAJ20 ACACGTGGTC
OPF12 ACGGTACCAG OPO05 CCCAGTCACT OPA K03 GGTCCTACCA
OPF13 GGCTGCAGAA OPP03 CTGATACGCC OPA K04 AGGGTCGGTC
OPG17 ACGACCGACA OPP10 TCCCGCCTAC OPA K08 CCGAAGGGTG
OPH05 AGTTGTCCCC OPP17 TGACCCGCCT OPA K11 CAGTGTGCTC
OPH12 ACGCGCATGT OPQ11 TCTCCGCAAC OPA K14 CTGTCATGCC
OPI04 CCGCCTAGTC OPS17 TGGGGACCAC OPA K15 ACCTGCCGTT
OPI12 AGAGGGCACA OPT04 CACAGAGGGA OPA K16 CTGCGTGCTC
OPI14 TGACGGCGGT OPT06 CAAGGGCAGA OPA K18 ACCCGCAAAC
OPJ07 CCTCTCGACA OPT08 AACGGCGACA OPAL03 CCCACCCTTG
OPJ10 AAGCCCGAGG OPT17 CCAACGTCGT OPAL05 GACTGCGCCA
OPJ13 CCACACTACC OPX01 CTGGGCACGA OPAL08 GTCGCCCTCC
OPJ15 TGTAGCAGGGOPX03 TGGCGCAGTG OPAL09 CAGCGAGTAG
OPK15 CTCCTGCCAA OPX08 CAGGGGTGGA OPAL11 GTCACGTCCT
OPL09 TGCGAGAGTC OPZ03 CAGCACCGCA
OPM05 GGGAACGTGT OPZ10 CCGACAAACC
表 2 　用于图谱分析的 AFLP引物对碱基序列
Table 2 　The nucleotide sequence of AFLP primers used
in the mapping analysis
名称 Primers 序列 Sequence 5pi23pi
E2AC/ M2CAC 　 GACTGCGTACCAATTCAC/ GATGAGTCCTGAGTAACAC
E2TC/ M2CTG　 GACTGCGTACCAATTCTC/ GATGAGTCCTGAGTAACTG
E2TC/ M2CAT 　 GACTGCGTACCAATTCTC/ GATGAGTCCTGAGTAACAT
E2TA/ M2CTG　 GACTGCGTACCAATTCTA/ GATGAGTCCTGAGTAACTG
E2AG/ M2CTG　 GACTGCGTACCAATTCAG/ GATGAGTCCTGAGTAACTG
E2TA/ M2CAC 　 GACTGCGTACCAATTCTA/ GATGAGTCCTGAGTAACAC
E2AG/ M2CAC 　 GACTGCGTACCAATTCAG/ GATGAGTCCTGAGTAACAC
E2AC/ M2CTG　 GACTGCGTACCAATTCAC/ GATGAGTCCTGAGTAACTG
E2AA/ M2CAT 　 GACTGCGTACCAATTCAA/ GATGAGTCCTGAGTAACAT
带模糊或不符合分离比例而忽略 , 偏分离频率为 2712 % (表 3) 。
表 3 　构建图谱的分子标记
Table 3 　The molecular markers used in the genetic map
分子标记
Molcular
markers
多态性标记数
Number of polimor
phic markers
偏分离标记数
Number of
distorted markers
偏分离频率
Rate of distorted
markers( %)
连锁标记数
Number of
linked markers
未连锁标记数
Number of
unlinked markers
未连锁标记比率
Rate of unlinked
markers( %)
AFL P 200 60 2712 141 59 29150
RAPD 117 25 2114 89 28 23193
SSR 　5 1 2010 　4 1 2010
总计 Amounts 322 86 2617 233 88 27130
916　5 期 张海英等 : 黄瓜分子遗传图谱的构建 　
SSR 试验中 , 2 对引物对共产生 5 个多态性位点 , 卡方检验 ( P < 0105) 显示 4 个多态性位点符
合 1∶1 的分离比例 , 偏分离频率为 20 % , 与 RAPD 标记比较接近 (表 3) 。
213 　连锁分析
应用在重组自交系群体中分离的 200 个AFL P 标记、117 个 RAPD 标记和 5 个 SSR 标记 , 进行连
锁分析 , 得到一张包含 9 个连锁组群的遗传图谱框架 (图 1) , 其中包括 141 个 AFL P 标记 , 89 个
RAPD 标记和 4 个 SSR 标记 , 该图谱覆盖基因组 72715 cM , 平均图距 311cM (表 4) 。每个连锁群上
的标记数在 10～65 之间 , 长度在 5616～10815 cM , 图谱密度 1cM/ 标记 ( G2 )～813 cM/ 标记 ( G5) 。026 园 　　艺 　　学 　　报 31 卷
图 1 　秋棚×欧洲八号的重组自交系连锁图谱
Fig. 1 　A linkage map for cucumber derived from an RIL population ( Qiupeng ×European 8)
图谱中两个标记间距小于 10 cM 的区域覆盖图谱
长度 87 %。只有 5 个间隙 (gaps) 大于 15cM , 最
大的间隙在连锁组 G5 (2415 cM) , 其余有两个在
G5 ( 1910 cM 和 1512 cM) , 一个在 G8 ( 1518
cM) , 一个在 G6 (1512 cM) 。
88 个标记 (59 个 AFL P 标记、28 个 RAPD
标记和 1 个 SSR 标记) 没有能够与其它标记连
锁 , 说明对于连锁分析而言 , AFL P、RAPD 等显
性标记具有较少的信息。这也是 88 个标记不能包
括在连锁图的一个原因之一。
本研究中 AFL P 标记在 G1、G2、G7 和 G8
连
表 4 　各种分子标记在分子遗传图谱上的分布
Table 4 　Distribution of molecular markers on the map
连锁组
Linkage group
长度
Length (cM)
标记数 Number
of markers
平均距离 Average
distance (cM)
G1 7410 63 1117
G2 6310 65 0196
G3 5616 10 5160
G4 10110 23 4139
G5 10815 13 8134
G6 8116 14 5182
G7 8114 17 4178
G8 8218 16 5116
G9 6616 12 5155
总计 Amounts 72715 234 3111
锁群上相对密集。本研究建立的图谱主要为 EcoRⅠ2MseⅠAFLP 标记 , 这种标记检测的位点多聚集在着丝
粒两侧甲基化较高的重复序列区域 , 聚集现象可能与异染色质区重组率低有关。利用不同分子标记特性
的互补 , 将有助于减小遗传图谱中的空隙。例如 PstⅠ2MseⅠAFLP 标记要比 EcoRⅠ2MseⅠAFLP 标记分布均
匀 , PstⅠ可以在非甲基化的常染色质区识别酶切位点 , 适于表达区域的研究。
3 　讨论
黄瓜共有 7 对染色体 , Ramachandran 等研究认为 : 黄瓜在减数分裂过程中每对染色体将有 2112
交换〔10〕, 每次交换约占基因组长度 50 cM , 黄瓜基因组长度大约为 742 cM (2112 交换/ 对染色体 ×7
对染色体 ×50 cM/ 交换) 。本图谱覆盖基因组 72715 cM , 基本接近于该估算值 , 构建的遗传图谱长度
126　5 期 张海英等 : 黄瓜分子遗传图谱的构建 　
为 166～766 cM〔5～9〕。2000 年 , Staub 等〔11〕利用 JoinMap v 110 软件 , 将以往的黄瓜遗传图谱首次进
行了图谱整合研究 , 最后整合成一个具有 134 个位点的连锁图谱 , 图谱长度 431 cM , 两个标记间平
均间隔 312 cM。整合后连锁图谱虽然密度大大增加 , 但是不能覆盖整个基因组。因此 , 相对于已经
发表的黄瓜遗传图谱 , 本项研究获得的图谱可以覆盖更多的基因组 , 而且图谱密度为 311 cM , 饱和
度相对较高。尽管如此 , 本图谱仍在某些区域有较大的间隙。
Kennard 等〔8〕试验表明 , 在近缘杂交黄瓜亲本之间 RAPD、AFLP 的多态性为 9 %和 1012 % , 而本试
验中所获得的多态性稍高 , 原因可能在于两个试验采用的亲本不同。本试验所用的亲本为两个生态型 ,
存在较远的遗传距离 , 其遗传相似距离为 017 〔12〕, 故使用 RAPD、AFLP 和 SSR 等分子标记进行图谱构建
时获得了相对比较多的多态性。而 Kennard 所用的两个亲本均为加工型黄瓜品种 , 亲缘关系相对较近 ,
造成多态性较低 , 这也是其图谱密度不够饱和的原因之一。
分子连锁群是植物染色体在分子水平上的反映 , 分子连锁群的数目应该同相应物种染色体的数目
一致。但由于分子标记在染色体上分布的随机性及染色体不同区段交换值的异质性的存在 , 连锁群上
常常会产生较大的间隙 , 严重者则出现小片段的连锁群。这种情况在 RAPD 和 AFL P 等基于 PCR 的
DNA 标记情况下发生的机会很多。本研究中黄瓜染色体数为 n = 7 , 而建立的分子遗传图谱有 9 个连
锁群 , 说明至少有 2 条染色体中存在频繁交换或标记空缺区段。目前黄瓜尚未建立公共框架图谱 , 无
公共的标记可利用 , 因而无法判定这 9 个连锁群的相互关系以及连锁群与染色体对应关系。今后我们
将采用原位杂交技术进一步判定已有连锁群与染色体对应关系。目前已经发表的黄瓜遗传图谱中连锁
组群数目 9～12 个不等 , 由于缺乏足够多的锚定标记 , 目前还无法判断本文所获得的连锁群与其他学
者所获得的连锁群的相互关系。
参考文献 :
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226 园 　　艺 　　学 　　报 31 卷