全 文 ：园 艺 学 报 2004，31(4)：511～513
Acta Horticuhurae Sinica — — — — — — —
真空渗入法转pinⅡ基因菜薹外源基因的遗传与表达
徐恒戬 ， 刘 凡 王秀峰 赵 泓 曹传增 罗 晨。
( 山东农业大学园艺学院，泰安 271018； 国家蔬菜工程技术研究中心，北京 100O89； 北京市农林科学院植保环保
所 ，北京 100089)
摘 要：本研究对利用真空渗入法获得的转bar基因及pinⅡ基因菜薹，进行了外源基因的遗传及表达
情况分析。结果表明通过该方法获得的转基因植株，外源基因能够稳定遗传。bar基因在 代的分离大部
分符合孟德尔遗传规律，但也有不符合的群体；pin I基因在 代中稳定表达，但各个株系之间的表达水
平差异较大，因而各个株系的抗虫效果也具有显著差异，即使具有相同外源基因拷贝数的各个株系，其
PIN I／蛋白表达量和抗虫效果也具有显著差异。
关键词：菜薹；pinI基因；抗虫；基因表达
中图分类号：Q 78；S 634 文献标识码：A 文章编号：0513—353X (2004)04-0511-03
Heredity and Expression of Foreign Genes in pinⅡ Transgenic Flowering
Chinese Cabbage Obtained by Vacuum Infiltration
Xu Hengjian ’ ，Liu Fan ，Wang Xiufeng ，Zhao Hong ，Cao Chuanzeng ，and Luo Chen
( Colage ofHorticulture，Shandong Agricultural University，T~ian 271018，China； National Engineering Research Centerfor
Vegetables，Beijing 100089，China； Institute of Plant and Environmental Protection，Beijing Academy ofAgriculture and Forest—
ry，Beijing 100089，China)
Abstract：Transgenic Chinese cabbage (Brasica campestris L．ssp．chinensis var．utilis Tsen et Lee)
with pin n gene and bar gene were got by vacuum infiltration transformation and strictly self-crossed．PCR assay，
Basta resistance and insect resistance of T2 generation lines proved stable inheritance and expression of the
foreign genes．The segregation ratios of 41 lines indicated low—copy transformation，and majority of them accord—
ing with the Mendel’S segregation law．The resistance of transgenic lines to Plutella xylostela L．has significant
diference along with the variation of relative quantities of PIN II protein．even lines with the san3．e insertion copies．
Key words：Flowering Chinese cabbage；pin n gene；Insect resistance；Gene expression
1 目的、材料与方法
真空渗入法是植物原位转基因方法之一，关于原位转基因植物后代的评价研究，国际上主要集中
在拟南芥上。其中对真空渗入法获得的转基因材料的评价研究，除拟南芥外仅在个别研究报道中有提
及 0¨ J。我们通过真空渗入原位转化法已经将来自马铃薯的蛋白酶抑制剂基因p Ⅱ及除草剂Basta抗
性基因bar转入菜薹 (Brassica campestris L．ssp．chinensis var．utilis Tsen et Lee．)品种 ‘49菜心’中，
本文就转基因菜薹的 代各株系中外源基因的遗传、分离和抗虫基因表达等进行报道。
所用 ‘49菜心’为一早熟农家品种。以真空渗入法获得 3批 T1代转化株，总共41个独立转化
株系，经严格的套袋自交，获得T2代群体作为试验材料。转化所用质粒由国家蔬菜工程技术研究中
心生物技术室构建保存，携带编码除草剂 Basta抗性的bar基因和来 自马铃薯的胰蛋白酶抑制剂基因
(pin 1I)。受试材料温室栽培，常规管理。
收稿 日期：2003—11—24；修回日期：2004—04—02
基金项目：北京市高技术实验室项目资助 (953850100)
通讯作者 Author for correspondence(E-mail：liufan@nercv．eom)
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I卷
髓 代群悼f}{=J除草剂抗惟筛选：利用外源bar基因介导的剥除草剂 Basla的抗 川 Bas ra喷施子
叶期幼苗，浓度为0 25％．每隔5 d处理1次． 处理3次，俘活幼曲即为抗’ 株．
外源基因的PCR鉴定：提取仔活抗性株的基因组 DNA．按常规方法进行目的螭jH 增 bar基幽
扩增弓I物申列为：5-M c Tr(：CGT ACC GAG CCC．CA-3’；5-ATG CCA GTT CCC GTG(：TT GA--3．pla
Ⅱ基因扩增引物序列为：5-GGA TGT TCT ACA AGG AAG 33"一3‘；5-GA_r GGA CAA(71’C TAG【；I 。F C一
3’ 非放射性探针标记采用 PCR DIG Probe SynIhesis KiI(产品号：】6360901，基 组的 Sotldle nl-杂交
应用 DIG Luminescent Deleetion Kit(产品号：1363514)．均咻j白Roche Diagnosti( Cm poration 操作按
照酞剂盒说明书进行 pin 1基因相剥丧达量的删定参照Edanger等 方法． Bmdl}ml方法测定町
溶性蛋白含量 (SPC) 。
抗虫性鉴定：小菜峨 c Phzlela x)．1ostela I．)由中国农业大学植保系提供。转垦 株及刘照品系
在温室盆栽，常规管理，6～7叶期后取相同部位叶片供试．、供试叶片用0．1％的 NaCIO溶液浸泡5 min
消毒，然后用清水冲洗晾干 将转基因株叶和对照株叶片分别放人直径为9 el|的培养皿巾．培养_Ⅲ·
放人吸水的滤纸保湿 将孵出的一龄幼虫接入到培养皿巾．每皿接 lO头．每个处理重复5次
2 结果分析与讨论
2．1 真空渗入法转基因菜薹 T2代的表型
在来自41个独立转基因株系的 12代转基因
植株中，无论在茎叶形态 数 目、着生位置 、花
序形态、花的结构等性状 与对照菲转基因材料
相比，都没有发现明显差异
2．2 除草剂Basra抗性在T2代的遗传与分离
真空渗八法的转化株．T】代通常是杂合体，
在n 代出现分离．41个 r2株系中，呈现 15：1
和3：1分离比的株系是31个．分别符台两个有数
插人片段独立遗传和一个有效捕 人片段的盂德尔
遗传规律；毓现 1：l和2：1分离比的株系9个，这
表 1 T2代植株群体的 Basra抗性分离
Table 1 1’he seg~gatlon of Basra re~istantc_¨ r1 generation
or 10 independently transfornled plants
几个株系分离比例比较特殊，不符合上述孟德尔舰律；1个株系种子太少，未发生分离 表J列出了
其中的10个独立转化个体的 12代Basta抗性分离结果 图I显示其中8个株系的 r基固的PCR扩
增鉴定，结果表明，所测株系的基因组都存在4OO hp的特定bar基因片段，进一步表明了bar基因
的稳定遗传 为了验证外源基阿的插人拷贝数与有效拷贝数的关系．从41个转化株中随机取5个株
系进行基因组的Southem杂交分析鉴定．结果表明．株系1 l有3个插入片段，但却表现为l：1分离，
图1 T2代植椿 bar基因的PCR鉴定
M：DNA marker；H!O：卒 坷蛆．CK1：质粒 DNA：
CK2： 转化株 I—I～3 9：转化株
Fig 1 PCR 0fthe 盯 genein r2 generation
Ⅵ：DN^ marker：lI、()：bl~ik：CKI：pkL~nlid DNA：CK2 nlm u l 【1】[
planl 1 1—3-9：tmn~gen plaltt~
嚣
圈 2 bar基因的SOLlthe~rn杂交
M：^ Ⅱ ^／llirtdⅡ『．1-1—3-1冀 固林糸；CK：非转 I寰
Fig．2 Genomic southern blotting of bar gene
M：ADNik,"llindⅢ；I I一3-I：I ‘ -I plants；
CK ⋯ -lransgenlc plants
～
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4期 绦恒戬等：真李渗入法转pitⅡ堆矧荣薹外源慕因的遗传与表进 5I 3
表明外源基因表达的复杂性；其它几个株系有2个插人片断，与表型分离比相符台 (罔2) 以上初
步结果表明，真空渗人法获得的转基因植株与一股农杆菌介导的叶盘法转基因株相似+补激基因多为
单拷贝或低拷贝插人。
2．3 pinⅡ基因遗传情况
pin I基因编码蛋白酶抑制剂 扶41个株系
中随机选取9个株系，根据pin1基因编码序列设
计 PCR引物进行扩增： 电泳结果显示，9个独立
转基因株系的 T2代中都存在 600 bp的特定pinIl
基因片段 (图3)，从而证明通过真空渗入法获得
转基因植株中外源pinⅡ基因能稳定遗传
2．4 PIN I蛋白的相对表达量及活性
转基因植物中 外源基因的表达非常复杂，
既可 观察表型性状并进行对比，也可以直接测
量基因表达产物 从41个株系中随机选取6个株
图3 ， Ⅱ基因的 PCR
M：I ^marker；1I 0：空白对j!l{；CKI：m丰芷II~A；
CK2：非转化株；I—I～3-9：转化睥
Fig．3 PCR ofthe曲 Ⅱ genein T2 generaton
M：DNA marker；[I_0：blan k；CKI：phlsmid DN^ ；
【K2：IIOII一【 n planl； 【·l一3-9：1 r lls l—II1(plants
系进行PIN I蛋白表达量的测定，并进行抗虫性鉴定 由表2可以看出，各转化林系的 PINⅡ蛋白相
对表达量 (PREQ)以l一1、lI2、2—1、3-9这4个株系较高，2—1 2 3一I这两个株系较低；反映了PIN
Il蛋白酶抑制剂活性的姨蛋白酶剩余括性 (TRLA)指标也有很大差异．在 l—l 2．1、l一!中较低，2一
l2、3一l、3-9中较高 这两项指标与抗虫试骑结果基本一致，但是株系3 表现出差异
2．5 各株系的抗虫性鉴定
PIN1蛋白属丝氨酸蛋白酶抑制剂类，主要对鳞翅目昆虫有毒害作用，被昆虫摄取后能抑制消化
道中蛋白酶的活性，导致昆虫 食 异常发育，直至死亡 ，从4】个 n 株系中随机取 6个株系进行抗
虫试验 (表3)，可 看出，各个株系之间的抗虫性能表现不同，饲喂转基因植株的幼虫发育期变短。
化蛹率和成虫获得率显著降低，l—I、l一2、2一】这3个株系的抗虫性显著高于对照，而!一l2、3．1 3—9
这3个株系的抗虫性与对照没有显著差异。其中1一l株系的综台抗虫性能最好．
表2 Ⅱ基园表选情况
Table 2 Tbe~ pression of9／~I gen~
表 T2菜薹商体叶片饲喂小菜蛾的统计分析 c SAS软件
Table 3 Statistic analysis of influence O11
PIntella xytostefta L．1ed b 3"2 leaves
株采
Li『I
堇蔓旦 ! ( 墟蛹率
幼虫 蛹 [|ales r
蛹平均质精
Pt,p~a Pf 1￡e
成虫特得率
Hitl⋯ f d Lll
I⋯ Pl nn pupae(％ 1 m (m ， ．
参考文献：
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