全 文 ：园 艺 学 报 2004，31(4)：517～519
Acta Horticulturae Sinica
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马铃薯 S病毒外壳蛋白基因的克隆及其在大肠杆菌
中的表达
李广存 杨 煜 王秀丽 杨元军 毕玉平
( 山东省农业科学院生物中心，济南 250100； 山东省农业科学院蔬菜研究所，济南 250100)
摘 要：以田间采集的马铃薯病叶中提取的马铃薯病毒 s(PVS)总 RNA为模板，通过 RT—PCR获取
长度为890 bp的P 一cp的cDNA，克隆至pGEM—T载体上。酶切回收该基因片段，并构建了该基因的原核
表达质粒 pBV—pvs。SDS—PAGE凝胶电泳和 Western印迹分析表明：P 一印基因在大肠杆菌 JM109中可特异
地高效表达分子量约33kD的蛋白，且表达蛋白具有良好的抗原活性。利用该表达产物免疫动物家兔，获
得的抗血清可用于大田马铃薯 s病毒的快速检测。
关键词：马铃薯；马铃薯 s病毒；外壳蛋白基因；RT—PCR；序列分析；Western印迹；抗血清制备
中图分类号：S 532；S 432．4+1 文献标识码：A 文章编号：0513—353X (2004)04-0517-03
Cloning of Potato Virus S Coat Protein Gene and Its Expression in E．coli
JM109
Li Guangcun ，Yang Yu ，Wang Xiuli ，Yang Yuanjun ，and Bi Yuping
( Bio—tech．Center，Shandong Academy of Agricultural Sciences，Jinan 250100，China； Vegetable Institute，Shandong
Academy ofAgricultural Sciences，Jinan 250100，China)
Abstract：Total RNA of potato virus S (PVS)was isolated from diseased potato leaves colected in
field，The cDNA encoding PVS coat protein(PVS-cp)was amplifed by RT-PCR and cloned into the plas-
mid pGEM—T vector． The expression vector of P 一cp gene was constructed through inserting the cDNA frag-
ment into the expression plasmid pBV220．The results of SDS-PAGE and Western blot analysis showed that
the P -cp gene highly expressed in E．coli JM109 and the molecular size of the expression product was about
33 kD． The product was used as antigen to immunize rabbits and the specific anti-serum can be used to detect
PVS rapidly．
Key words：Potato；Potato virus S；Coat protein gene；RT-PCR；Sequence analysis；Western blot；
Anti-serum preparation
1 目的、材料与方法
马铃薯 S病毒 (Potato Virus S，PVS)分布广泛，通常可造成减产 10％ ～20％。其症状潜隐，难
以辨认，目前主要采用指示植物和ELISA等方法进行诊断 ]¨。ELISA方法快速、方便，但需要大量
抗血清。为研究利用基因工程途径制备该病毒抗血清的可行性，克隆和分析了PVS—cp基因，并进行
了该基因的原核表达分析和抗血清制备。
采用ELISA方法对采自山东大田的马铃薯叶片进行马铃薯x、Y、s和卷叶 (LR)病毒检测，取
只对 s病毒呈阳性反应的叶片按改进的Peden等的方法 提取病毒粒子：①取病叶 100 g，加二倍体
积的0．1 mol／L PBS缓冲液，研磨后离心 (5000 g，20 min)；②上清液经 PEG8000沉淀并重溶于
0．05 mol／L PBS缓冲液中，低速离心去杂后进行20％的蔗糖垫离心 (160 000 g，180 min)，沉淀再次
重悬于0．05 mol／L PBS缓冲液中；③再次低速离心去杂后进行 10％ ～40％的蔗糖密度梯度离心
收稿日期：2003—11—17；修回日期 ：2004—02—13
基金项目：农业部 “948”项 目 (201047)；山东省科技攻关项目 (99-05)
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5l8 园 艺 学 报 31卷
(100 000 g，60 min)，收集病毒带；④重复步骤③，收集病毒带，获得纯化的PVS病毒粒子。病毒
液直接经苯酚、氯仿抽提，乙醇沉淀获得病毒总RNA。
按Joung报道的PVS．cp基因序列 (htp：／／www．ncbi．nlm．nih．gov／entrez／viewer．u74376)设计合
成正向引物 P1和反向引物 P2。P1：5’ATG CCG CCT AAA CCA GAT CCA AC 3’；P2：5’AGA TCT
GCC TYC ATT GGT TGA TCG 3’。参照 RT．PCR试剂盒说明书进行基因的扩增：先于42c反应 1 h合
成 cDNA，后于94c预变性 5 rain，再按 94c 45 s，50c 60 s，72c 60 s，反应 35个循环。PCR产物
经琼脂糖凝胶电泳分离，回收后与pGEM—T载体 (Promega，USA)相连，转化大肠杆菌JM109感受
态细胞，PCR及酶切鉴定后，提纯质粒送交大连宝生物公司测序。通过PC／GENE软件进行同源序列
的比较。酶切回收克隆基因片段，构建原核表达质粒，转化大肠杆菌JM109感受态细胞，于42c诱
导表达，并进行SDS—PAGE凝胶电泳和Western印迹分析 。提取表达蛋白，参照国际马铃薯中心植
物病毒学培训手册 进行动物免疫制备抗血清并测定其效价。
2 结果与分析
2．1 P 一 基因的克隆和序列分析
以PVS总RNA的反转录产物为模板进行 PCR扩增可得约0．9 kb的特异性扩增产物，且与文献
报道的大小一致。PCR产物序列测定结果 (图1)表明：该序列包含了PVS·cp cDNA完整的885 bp
编码序列，编码294个氨基酸。利用PC／GENE软件进行同源序列比较发现：所克隆的PVS-cp cDNA
与已报道的PSV-cp基因序列高度同源，其编码的氨基酸序列同源性更高，均在93．5％以上，且不同
分离株的差异也主要位于第 16位至第40位氨基酸上，其它位置的氨基酸差异不大。因此，以高度保
守的S病毒外壳蛋白为抗原制备抗血清应是可行的。
CCT A CCA GAT CCA ACT AGC TCA GGA GAG ACA CCA CAA GCT ATA CCA CTT GCG
P K P D P T S S G E T P Q A I P L A
CCC CGG AAC GTA GAG GAG CAT AAA GTT GGC CCA AGT CAA GGG CAC GGG CAG AAT
P R N V E E H K V G P S Q G H E Q N
GCT ATG CTG GAG CAG AGG CTC ATC AGA TTG ATT GAA CTC ATG GCC TCG A AGG
A M L E Q R L I R L I E L M A S K R
TCA ACA TTG AGC AAC ATC TCT TTT GAG ATA GGT CGG CCC TCG CTT GAG CCG ACC
A T L S N I S F E I G R P S L E P T
ATG CGT AGG AAT CCA GAG AAC CCA TAC TCG CGG TTT TCA ATC GAT GAG CTG TTC
M R R N P E N P Y S R F S I D E L F
GAA ATC CGA TCT GTG TCC AAC AAC ATG GCG AAC ACC GAG CAA ATG GCA CAA ATC
E I R S V S N N M A N T E Q M A Q I
GAC ATC GCT GGA CTC GGG GTC CCC ACT GAA CAC GTT GCA GGG GTT ATA CTG A
D I A G L G V P T E H V A G V I L K
ATT ATG TGT GCA AGC GTG AGT AGC TCT GTT TAT CTG GAC CCG GCA GGG ACT GTG
I M C A S V S S S V Y L D P A G T V
CCA ACA GC,C GCA GTG CCC TTG GAC TCG ATC ATT GCA ATC ATG AAG AAT CGC GCG
P T G A V P L D S I I A I M K N R A
AGA AM GTG TGC AGG CTA TAC GCT CCA GTC GTG TGG AAT TAC ATG CTA GTC CAG
R K V C R L Y A P V V W N Y M L V Q
CCA CCT TCG GAT TGG CAG GCC ATG GGA TTT CAA TGG AAT GCA CGC TTC GCC GCA
P P S D W Q A M G F Q W N A R F A A
ACA TTC GAT TAT GTG ACT AAT GGG GCT GCA GTT CAG CCC GTA GAG GGG CTC ATA
T F D Y V T N G A A V Q P V E G L I
CCC ACA CCT GAG GAA ACA ATA GCT CAC AAT C,CC CAC AAG AGT ATG GCA ATC GAC
P T P E E T I A H N A H K S M A I D
AAC AGA AAT GAG CGA TTG GCT AAC ACT AAT GTT GAG TAC ACT GGG GGG ATG CTT
N R N E R L A N T N V E Y T G G M L
GAT ATT GTG CGC AAT CAC CGT AAT GCG ATC AAC CAA TGA
G A D I V R N H R N A I N Q
图1 PVS-cp cDNA序列及推导的氨基酸序列
Fig．1 Nucleofide sequence and deduced amino acid sequence of PVS-cp cDNA
∞P P E N从E M研A代v F LmR Dm R s a a Q Q a G T T A G A T G 代M∞ H P K T EmG N"F mK∞A C G C C A A G G T C A
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4期 李r俘等：马铃薯S病毒外壳蛋白基因的克隆搜其 大脑扦菌中的表达
2．2 PVS-cp基因的表达及 Western blot检测
为使PVS—cP基因在大肠l仟菌中高效表达，本研究对sD序列与ATG之间的距离进行了适当调整
(8个 bp)．掏建了该基因的原核表达载体pBV—pvs，转化大肠杆菌JM109感受态细胞．并于42 热诱
导表达。同时，所表达蛋白在细菌中以包含体形式存在．可有效防止细菌蛋白酶的降解 SDS—PAGE
电泳和WesternMot印迹分析表明 (围2、图3)：fJ 一印基因在大肠杆菌JM109中可特异高敬表达33
kD蛋白．且大小与文献报道的一致：所表达的蛋白确为马铃薯 S病毒的外壳蛋白．且该蛋白具 有良
好的抗原性．
图2 PVS-cp基因在大脑杆菌中的表达
M 虽由质甜 鹫 准：I求经蹲寻舳pRV-pvs 2诱 4 h的pBV甲vs
Fig．2 Expression of PVS-cp gene in E colt JM 109
M p~tein n址 ’ ：I h·】『1一⋯【i j pBV—pvs：
2 Indue。ed pBV-1) k 4 h
田3 PVS-cp基因的Western Mot分析
I～3 为 导4 h的 pBV巾、 的3 重复
Fig．3 Western blot analysis 0r PVS一印 gene
] Showed flr~ r ¨^ ( indu~PlJ I-BV fi,r 4 h
2．3 PVS抗血清的效价测定及样本检测
NCM-El+ ISA法测得抗血清的教价为1：1024，用该抗血清采用 DAS．EL1SA方法及We~Lem blII町
有效地进行PVS检测 (图略) 用国际马铃薯中心 (International P c+tato Center．CIP1的抗m清对
比，二者对于感病植株与健康植株的反应一致，说明利用基因1二程途径制备该病毒抗血清是可行的。
同时该方法克服了传统的以提纯的病毒粮子为抗原制备抗血清．需要网室和温室养殖毒源、费时费力
并存在毒源扩散的危险等．特别是克服 对于马铃薯s病毒常潜隐，难以获得足够的提纯抗原的
足，并且该法所掏建的工程菌株可在超低温条件下}乏期保存，随时可诱导表达用于抗[1n清制备。
参考文猷：
1 Salaza+1． Potato～iruxe~and Iheir mtml Lim ：lnlernathmal Potatll Cen r
．
I996 214
2 PedPn K W C，Symlns R Cu~u rntler m,~aic¨nls rontainsⅡfuncli,-r,~Ily divided genome Virolo~
． 1973．53(2l：487—492
3 萨姆布鲁克J．拉室 D W 舒千览隆宴骑指南 第三版．黄培堂详 E京：科学出版社．2001 1236～1239．I 6．1752
4 Salaz~ I F
． Jay~irt曲 U 丁 ·hniques in planl⋯ 】。盯 nⅡ ：lnlernalilmal Polat,：Center．1997 12～I4
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