全 文 ：园 　艺 　学 　报 　2004 , 31 (5) : 623～626
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2003 - 11 - 16 ; 修回日期 : 2004 - 03 - 12
基金项目 : 国家自然科学基金资助项目 (38970516) ; 国家‘863’重大专项 (2002AA207011)3 通讯作者 Author for correspondence ( E2mail : liujun @mail1hzau1edu1cn)
马铃薯栽培种与野生种叶肉细胞融合及体细胞杂种
鉴定
蔡兴奎1 　柳　俊2 3 　谢从华1
(1 华中农业大学园艺林学学院 , 武汉 430070 ; 2 华中农业大学生命科学技术学院 , 武汉 430070)
摘 　要 : 以马铃薯栽培种 Solanum tuberosum ‘中薯二号’的无性系 3 # 、8 # (2n = 48) 和二倍体野生
种 Solanum chacoense (2n = 24) 的无菌苗为原生质体来源 , 比较了 PEG (聚乙二醇) 融合和电融合两种方
式马铃薯原生质体融合效果的影响。结果显示 , 两种融合方式对细胞的融合率没有显著差异 , 但电融合的
细胞植板效率和愈伤组织分化能力均显著高于 PEG融合法。在早期挑选的生长旺盛的愈伤组织再生的 100
个株系中 , 经 RAPD 标记检测有 97 个系为体细胞杂种。杂种植株经流式细胞仪倍性分析表明 , 5216 %为六
倍体 , 1414 %为八倍体 , 1414 %为非整倍体 , 1816 %为混倍体。叶绿体 SSR 引物 N TCP29 用于细胞质重组
检测 , 结果显示 , 体细胞杂种中叶绿体具有偏亲现象 , 大多数杂种只含有单一亲本的叶绿体类型 , 只有
1615 %株系为叶绿体重组的杂种植株。
关键词 : 马铃薯 ; 原生质体融合 ; 体细胞杂种 ; 遗传分析
中图分类号 : S 532 　　文献标识码 : A 　　文章编号 : 05132353X (2004) 0520623204
Mesophyll Protoplast Fusion of Solanum tuberosum and Solanum chacoense
and Their Somatic Hybrid Analysis
Cai Xingkui1 , Liu J un2 3 , and Xie Conghua1
(1 College of Horticulture and Forest ry , Huaz hong A gricultural U niversity , W uhan 430070 , China ; 2 College of L if e Sci2
ence and Technology , Huaz hong A gricultural U niversity , W uhan 430070 , China)
Abstract : The protoplasts were isolated f rom the leaves of Solanum t uberosum clones 3 # and 8 # (2n =
48) , which were derived f rom cv. ‘Zhongshu 2’, and dipliod species S . chacoense (2n = 24) . The PEG and
elect ric fusion methods were employed for looking into their effects on the protoplast fusion. The results
showed that no much difference existed in the fusion efficiency between the two methods , but higher cell
platingf requency and a st ronger plant differentiation ability of callus were observed in elect rofusion. Among 100
plants differentiated in earlier stage , 97 showed somatic hybrids by RAPD marker detection. Further ploidy
level analysis with flow cytometry demonstrated that 5216 % were hexaploids , 1414 % octoploids , 1414 % am2
phiploids and 1816 % mixoploids. Cytoplasm recombination of the somatic hybrids were investigated using a
specific chloroplast SSR primer N TCP29 , The results indicated that most of the hybrids contain the chloroplast
f rom one of the fusion parents. Only 1615 % of the hybrids combined the two parental chloroplasts.
Key words : Potato ; Protoplast fusion ; Somatic hybrids ; Genetic analysis
马铃薯青枯病 ( Ralstonia solanacearum) 在我国中原和南方马铃薯二季栽培地区以及西南一二季混
作区普遍发生。由于马铃薯四倍体栽培种中缺乏对青枯病的抗源 , 常规有性杂交育种难以取得突破。种
质资源研究表明青枯病抗源主要存在于二倍体野生种和原始栽培种中〔1〕。Laferriere 等〔2〕和 Fock 等〔3 ,4〕分
别利用野生种 Solanum com mersonii 和原始栽培种 S . phureja、S . stenotom um 与栽培种双单倍体融合 ,
获得了抗青枯病杂种株系。然而 , 栽培种的双单倍体需要通过花药培养或授粉诱导孤雌生殖产生 , 受遗
传背景限制 , 目前可供利用的双单倍体材料十分有限。近年来 , Helgeson 等〔5〕利用二倍体野生种 S .
bulbocastanum 与四倍体栽培种 S . tuberosum 直接进行体细胞融合 , 获得了抗晚疫病的六倍体 (2n = 72)
体细胞杂种系 , 并成功将其与马铃薯栽培品种‘Katahdin’和‘Atlantic’杂交 , 从而提出了马铃薯倍性
育种的新思路。本试验采用野生种 S . chacoense 与四倍体栽培种进行原生质体融合 , 旨在获得抗青枯病
的新材料 , 为马铃薯抗青枯病育种提供抗性材料 , 同时为倍性育种奠定基础。
1 　材料与方法
以马铃薯栽培种 ( S . tuberosum) ‘中薯二号’的无性系 3 # 、8 # (2n = 48 , 中国农科院蔬菜花卉所
惠赠) 和二倍体野生种 S . chacoense (2n = 24) 的无菌苗为原生质体来源。试管苗培养采用 MS 基本培
养基 (2 %蔗糖 , 017 %琼脂 , pH 518) , 每天光照 16 h , 光强 3000～4000 lx , 温度 (20 ±1) ℃。
原生质体融合采用 PEG (聚乙二醇) 融合〔6〕和电融合〔7〕的方法 , 融合细胞培养以及杂种的 RAPD 鉴
定参照前文报道的方法〔7〕。原生质体培养后第 10 天统计分裂细胞占原生质体总数的比例 (植板效率) 。
愈伤组织接种在分化培养基上培养 4 个月时统计芽分化初始时间、分化频率 (分化出芽的愈伤组织块数
占愈伤组织块总数的比率) 和杂种株率 (体细胞杂种植株占分化成完整植株的比率) 。
杂种植株的倍性分析 : 取相同继代培养时间的各杂种植株及其亲本的试管苗叶片约 015 cm2 , 置于
塑料培养皿中 , 加入 400μL 细胞裂解液 (Partec HR2A) 并切碎 , 放置 3 min 后经 30μm 微孔膜过滤 , 然
后加入 015 mL Partec HR2B 溶液染色 2 min , 上样于 Partec 倍性分析仪 , 测定样品单个细胞核的 DNA 总
量。结果分析采用 Partec 公司的 DPAC软件 (Data Pool Application of Cytometre) 辅助完成。
叶绿体 SSR引物筛选、鉴定及两亲本差异片段测序 : 参照 Bryan 等〔8〕报道的烟草叶绿体 SSR 引物 ,
合成了 NTCP26、NTCP29 和 NTCP212 引物。参照杂种鉴定的方法进行 PCR 扩增筛选特异引物〔7〕。从琼
脂糖凝胶上切下两亲本的差异片段克隆并测序分析 , 测序由上海基康生物技术有限公司完成。
2 　结果与分析
211 　原生质体的培养和植株再生
融合产物置于 25 ℃培养箱进行液体浅层黑暗培养 , 2 周后长出大量肉眼可见的针尖状白色多细胞
团。此时转为固—液双层培养 , 再培养两周细胞团增殖至 1 mm 左右 , 挑出转至愈伤组织增殖培养基光
照培养。此时细胞生长迅速 , 细胞团逐渐变绿。继续培养两周后将直径大于 3 mm 的愈伤组织转入分化
培养基 , 两个月左右开始分化形成芽 , 每个愈伤
组织大多分化出 1～2 个芽 , 少数分化 3～8 个芽。
待芽长至 1 cm 左右时切下转入生根培养基形成完
整植株。组合 3 # + S . chacoense 在选择的 424 块
愈伤组织中有 39 块分化再生植株 , 分化频率为
912 %; 组合 8 # + S . chacoense 在选择的 788 块愈伤
组织中有 89 块分化再生植株 , 分化频率为 1113 %。
212 　再生植株的 RAPD 鉴定
利用筛选的亲本差异引物 OPA211 进行扩增 ,
由于无性系 3 # 、8 # 同为栽培品种‘中薯二号’
的不同株系 , 它们具有相同的特征带。从图 1 可以
清楚地看出 , 栽培种亲本的特征带显示在 1800 bp
和 800 bp , 而野生种亲本 S . chacoense 的特征带显
示在 1100 bp 和 620 bp , 3 至 11 泳道的融合再
生植株均同时显示了互补的特征带 , 说明它们均
图 1 　体细胞杂种及其亲本的 RAPD谱带(引物 A211)
M. Marker DL 2000 ;1.亲本 8 # ;2.野生种亲本 S . chacoense ;
3～11.体细胞杂种株系。箭头示杂种植株互补特征带。
Fig. 1 　RAPD patterns of somatic hybrids and
their parents with primer A211
M. Marker DL 2000 ;1. Parent 8 # ;2. Wild species S . chacoense ;
3 - 11. Somatic hybrids lines. Arrows show complementary
band sites of the hybrid plants.
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为双亲融合的细胞杂种系。试验还显示 , 在生长旺盛的愈伤组织首批分化植株中 , 组合 3# + S .
chacoense 的 36 个再生株系均为体细胞杂种 ; 组合 8 # + S . chacoense 的 64 个再生株系有 61 个为体细
胞杂种 , 杂种比例为 9513 %。因而说明依据愈伤组织生长能力差异进行早期选择的方法是有效的。
213 　两种融合方法对原生质体融合效果的比较
从表 1 可看出 , PEG融合和电融合两种方法
的融合率没有显著差异 , 均可高达 40 %以上 , 但
是融合后的原生质体培养反应存在显著差异。电
融合的细胞培养反应迅速 , 培养后 24 h 即开始膨
大 , 而 PEG融合的细胞要 48～72 h 才开始膨大。
培养第 10 天时统计植板率 , 电融合细胞达
3316 % , 显著高于 PEG 融合方法的 2018 %。方
差分析表明 , 在愈伤组织分化成苗能力上 , 电融
合的细胞也显著优于 PEG融合。但是转移至分化
培养基上两者的愈伤组织生长正常 , 在初次分化
成苗的时间和杂种株率上没有差异。由此可见 ,
PEG对细胞生长的抑制作用集中表现在原生质体
培养前期。
214 　杂种植株的 D NA倍性分析
试管苗叶片的流式细胞仪倍性分析 (表 2)
表明 , 作为对照的二倍体 S . chacoense 的峰值位
于 50 , 四倍体栽培种的峰值位于 100 左右 , 而六
倍体则为 150 , 八倍体为 200 , 非整倍体位于
100～150 或 150～200 , 混倍体具有多个主峰 , 97
个体细胞杂种的倍性分析表明 , 大部分为六倍体
(5216 %) , 为典型的双亲融合杂种 , 少量为八倍
体 (1414 %) , 还有非整倍体 (1414 %) 和混倍体
(1816 %) 。
215 　叶绿体 SSR引物检测及差异片段的测序比较
在所合成的 3 对叶绿体 SSR 引物中 , 引物
N TCP29 可以区分用于融合的两亲本 , 引物序列
为 : 5’CTT CCA AgC TAA CgA TgC 3’; 5’
CTg TCC TA T CCA TTA gAC AA T g 3’。图 2 显
示 , 栽培种亲本的片段大小为 303 bp , 野生种亲
本的差异片段为 242 bp , 而体细胞杂种中既有单
个亲本类型 , 也有两亲本的重组类型。表 3 表明 ,
叶绿体在体细胞杂种后代中具有偏亲现象 , 在检
测的体细胞杂种植株中有 4413 %的植株为栽培种
叶绿体类型 , 3912 %的植株为野生种叶绿体类型 ,
同时含有双亲叶绿体的杂种只占少部分 , 本试验
中平均重组比例为 1615 %。
将两亲本的差异片段进行测序。片段测序经 NCBI
(National Center for Biotechnology
表 1 　不同的融合方式对原生质体融合效果的比较
Table 1 　Comparison of the effects on protoplast
fusion bet ween PEGand electrofusion
融合
方式
Fusion
type
融合频率
Fusion
frequency
( %)
植板效率
Plating
frequency
( %)
最初分化
时间 First
regeneration
time (d)
愈伤组织分
化频率
Regeneration
frequency( %)
杂种株率
Ratio of
hybrids
( %)
PEG 4217 a 2018 b 5713 a 918 b 9717 a
电融合 4512 a 3316 a 5812 a 1618 a 100 a
Electrofusion
　　注 : 同列相同字母表示差异不显著 (α= 0105) 。
Note : The same capital letters in each column indicated no signif2
icant difference (α= 0105) .
表 2 　体细胞杂种不同 DNA倍性植株的比例
Table 2 　The ratio of somatic hybrids with different DNA ploidy
组合
Combination
六倍体
Hexaploid
八倍体
Octoploid
非整倍体
Amphiploid
混倍体
Mixoploid
3 # + S. chacoense 23 (6319 %) 1 (218 %) 5 (1319 %) 7 (1914 %)
8 # + S. chacoense 28 (4519 %) 13 (2113 %) 9 (1418 %) 11 (1810 %)
合计 Total 51 (5216 %) 14 (1414 %) 14 (1414 %) 18 (1816 %)
图 2 　体细胞杂种及其亲本的 RAPD 谱带 (引物 NTCP29)
M. Marker DL 2000 ; 1. 亲本 8 # ; 2. 野生种亲本 S . chacoense ;
3～9. 体细胞杂种株系。箭头示差异带。
Fig. 2 　cpDNA SSR patterns of somatic hybrids and their parents
with primer NTCP29
M. Marker DL 2000 ; 1. Parent 8 # ; 2. Wild species S . chacoense ;
3 - 9. Somatic hybrids lines. Arrows show different band sites.
表 3 　体细胞杂种不同叶绿体 DNA类型植株的比例
Table 3 　The ratio of somatic hybrids with different cpDNA type
组合
Combination
栽培种类型
S . tuberosum type
野生种类型
S . chacoense type
双亲重组类型
Rearrengement type
3 # + S . chacoense 12 (3313 %) 18 (5010 %) 6 (1617 %)
8 # + S . chacoense 31 (5018 %) 20 (3218 %) 10 (1614 %)
合计 Total 43 (4413 %) 38 (3912 %) 16 (1615 %)
526　5 期 蔡兴奎等 : 马铃薯栽培种与野生种叶肉细胞融合及体细胞杂种鉴定 　
Information) 基因库 Blastn 检索结果表明 , 回收片段与其它作物叶绿体 DNA 具有较高同源性 , 来源
于野生种亲本的差异片段大小为 242 bp , 与 N icotiana tabacum 叶绿体基因组 DNA 序列 (登录号 :
Z0004411) 的 10220～10408 区段存在很高的同源性 , 在比较的 198 个碱基序列中有 183 个相同 , 相
似性达 9214 % ; 来源于栽培种亲本的差异片段为 303 bp , 与 A t ropa belladonna 叶绿体基因组DNA 序
列 (登录号 : AJ31658211) 的大片段比较有较高的同源性 , 在比较的 141 个碱基序列中有 129 个相
同 , 相似性达 9115 %。由检索比较的结果证明扩增片段确为马铃薯叶绿体基因组 DNA , 两亲本序列
比较结果表明 , 野生种亲本比栽培种亲本在碱基序列 109～168 位置缺失了两个 30 bp 的重复序列 ,
其他序列则完全一致。
3 　讨论
本试验得到的 100 个再生株系 , 97 %的株系为体细胞杂种 , 如此高的杂种比例可能是对愈伤组织
进行早期选择的结果。Polgar 等〔9〕认为异源融合的融合子具有杂种优势而生长快速 , 首先分化形成完
整植株 , 如同有性杂交过程中杂种植株表现出的形态学特征。后来的许多研究者也依据愈伤组织的生
长速度选择杂种愈伤组织 , 从而大大降低工作量和试验成本〔10〕。本试验的结果也证明了前人的观点。
由于创建马铃薯双单倍体的局限性和栽培种双单倍体自然加倍的高频率性 , 使得可供利用的双单
倍体十分有限。自 Helgeson 等〔5〕通过细胞融合获得能稳定遗传的六倍体杂种以来 , 目前已有多例通
过有性杂交和体细胞杂交获得可供利用的六倍体资源的报道〔5 , 11〕。本研究在国内首次报道了通过四
倍体栽培种和二倍体野生种细胞融合产生的六倍体杂种 , 其遗传稳定性和青枯病抗性正在鉴定中。
在众多作物的体细胞杂种中 , 细胞质具有偏亲现象。Wolters 等〔12〕对来自番茄和马铃薯细胞融合
的 17 个杂种系分析表明 , 除了 1 个株系含有双亲的叶绿体外 , 其它株系均只含有一个亲本的叶绿体 ,
其它作物的体细胞杂种也具有类似的结果〔13〕。本研究通过马铃薯叶绿体 SSR 标记分析了 97 个体细
胞杂种系的叶绿体 , 结果显示有 16 个株系携带有双亲叶绿体 DNA , 初步证明它们成功实现了细胞质
重组 , 但这些细胞质杂种能否稳定遗传还需进一步研究。
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626 园　　艺　　学　　报 31 卷