全 文 ：园 艺 学 报 2003，30(3)：267～271
Aeta Hortieulturae Siniea
苹果 LEAFY同源基因的 cDNA克隆与表达分析
曹秋芬 和田雅人2 孟玉平 黄 静 孙 毅 王果萍
( 山西省农业科学院生物技术研究中心 ，太原 030031； 日本国农业技术研究机构果树研究所，盛岗市 020—0123)
摘 要：从苹果的果台枝顶芽中克隆了两个长约 1．4 kb的 eDNA片段，分别定名为 AFL1和 AFL2。它
们的碱基序列在编码区有 90％的同源性，但在 3’末端非编码区仅有约 印％的同源性。它们表达的肽链氨基
酸序列与小叶杨 、大豆、矮牵牛等有 70％以上的同源性 ，与番茄、金鱼草、拟南芥有近 70％的同源性，证
明它们是 LFY的同源基因。RT—PCR的结果表明，生长期 AFL2在萼片、子房、根、茎、叶以及果台枝顶
芽中都有表达，而 AFL1只在果台枝顶芽中表达 ；在不同发育时期的果台枝顶芽中，AFL1在顶芽停止营养
生长转向生殖生长以后才清晰表达，而 AFL2在生长期 6 10月都有表达。因此认为苹果中的这两个 LFY
同源基因虽有共同的起源，但是在功能上存在差异，在花和营养组织的发育中起不同的作用。DNA印迹分
析表明，在苹果属及近缘的梨属植物中 LFY同源基因是多拷贝的。
关键词：苹果；基因；LEAFY；克隆 ；表达
中图分类号：S 661．1 文献标识码 ：A 文章编号：0513．353X(2003)03．0267．05
近几年对拟南芥的研究证明，在成花过程 中有几个关键的基因控制着花的发育，其 中之一的
LEAFY( )是从营养生长向生殖生长转变时必需的 j¨。将 35S启动子下的 导人拟南芥使其超
量表达，会引起提早成花，并使所有的侧枝转变成单花 j。LFY的这种活性在其他植物，如小叶杨、
柑橘中也得到了类似的结果，即促进了成花和产生异位花 ．4j。苹果 “童期”较长，育成一个品种要
耗时 10—20年，能否使苹果 自发提早开花一直是果树研究上的一大课题。本研究试图克隆苹果中
的同源基因，并分析它在不同组织、器官以及不同发育时期的表达模式，通过模式植物拟南芥解
析它在植物体内的生理功能，为有效提早苹果开花提供理论依据。
1 材料与方法
1．1 植物材料
供试材料采自日本国农业技术研究机构果树研究所苹果研究部 (日本盛岗市)成年大树。苹果属
(Ma／us Mil1．)选用苹果种 (Ma／us pturd／a Mil1．)栽培品种 ‘红玉’ (Jonathan)和野生种圆叶海棠
[Ma／us prunifolia(WiUd．)Borkh．]；梨属 (Pyrus L．)选用秋子梨 (Pyrus usuriensi~Maxim)栽培品种
‘红梨’。采集上述植物所需组织、器官样本 ，用液态氮速冻后 ，保存在 一80％条件下。
1．2 总 RNA的提取和 eDNA的克隆
生长期 6～8月每隔 2周采集果台枝 (大部分果台枝发育成花芽)顶部 0．5～1．0 am的组织，用
CTAB—based的方法 J提取总 RNA混和后，用寡聚 (dT)引物反转录，构建 eDNA文库。根据拟南芥
(Arabidopsis thaliana)L 和金鱼草 (Antirhinum majus)脚 【 ]的 eDNA保守序列设计引物 6S(5’一CA—
GAGGGAGCACCCGTI1CAr兀℃TGAG3’)和 10A (5’一GAC@ GC3TrC~TIGGGAGACATACCA一3’)，并以构
建的 eDNA文库为模板，用 LA—PCR克隆试剂盒 (TaKaRa)进行 PCR反应，反应条件为 95℃ 10 min热
变性后，94oC 1 min，55oC 1 min，72oC 2 min，循环 40次。将得到的44O bp eDNA片段与带有 EcoR I
(TaKaRa)酶切点的接头连接，进而连接到 pBlueseript I1 SK (Stratagene，La Jola，Calif)载体 的
收稿日期：2002—07—03；修回日期 ：2002—10一t7
基金项目：山西省科技攻关项 目 (021034)；国家人事部留学人员择优资助项目
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园 艺 学 报 30卷
R工酶切位点，然后转化大肠菌 DH5c~，并涂布在含有 50Ⅱ H】L Amp，IVIC和 X．gal(Promega)的 LB平
板上，选择白色菌落。用 PCR法确定带有目的长度 cDNA片段的菌落，提取质粒并测定碱基序列，试剂用
Thermo sequenag~premixed cycle seqHenee kit(Amersham，Buckinghamshire，U．K．)，测序仪用 Hitachi SQ55OO
(Hitachi，Japan)。3’末端扩增：根据得到的440bp cDNA片段，设计了特异JI生引物6s和3SP2(5-TCCAGAA．
1GCCAAGGAG．3’)，分别与盒式引物 (Cassete primer)C1和 C2进行 PCR扩增。C2和 3SP2之问得到了
600 bp的cDNA片段，并克隆到pBlueseriptlI SK 的E~oRV ( [
3SP2相同)、5SP4(与6s相同)之间进行 P~／I扩增，获得了 C2与5SP4之问约 750 bp的 cDNA片段，并测
序。全长 cDNA的扩增：从建立的cDNA文库中用共同引物 AFLF (5’．C!IGGAA衄 G肌 CC．3’)分
另0同AFL1R(5-TIEATIEAGIL-W_,CCCrAGCC．3’)，AFL2R (5’． I1CAAAC1C 1GCAGAAC GC．3’)进行 PCR
扩增，获得了两个约 1．4 kb的 cDNA，并将其克隆到 pBlueseriptlI SK 的 EcoRV酶切位点，从两个方向测定
全序列后分别定名为 舰 1和 AFL2。
1．3 不同发育时期及不同组织、器官的 RT—P 分析
不同发育时期的 RT—PCR分析，是在生长期 6～10月份，每隔 2周采集 ‘红玉’的顶芽；组织 、
器官包括根、茎、叶、果台枝顶芽 (同上 1．2)，花的萼片、花瓣 、雄蕊 、雌蕊；提取上述样品的总
RNA，用 RT—PCR HIGH试剂盒 (Toyobo，Tokyo，Japan)进行反转录，合成第 1条 cDNA，具体操作
如下 ：即5×Rtase bufer(4 L)，Random primer(1 L)，dNTPs(2 I￡L)，Rnase inhibitor(1 L)， I’0tal
RNA (1 )，M．MLV Rtase(2 )，最后用 Rnase free H20添加至 20 。反应条件为 3O℃ 10 min，
42℃ 60 min，99℃ 5 min，反应结束后保存在 4℃。取上述反转录液 2 ，用 A凡 1和 AFL2的共同引
物 3SP2，分别与 A凡 1的特异性引物 AFL1R和 AFL2的特异性引物 AFL2R用 AmpliTaq酶 (PE Biosys．
teme，Japan)进行 PCR反应，3SP2．AFL1R引物扩增出532 bp的片段，3SP2．AFL2R引物扩增出368 bp
的片段。PCR的条件是，95℃热变性 10 min后，94℃ 1 min，62℃ 1 min，72℃ 2 min，40个循环。取 5
的反应液，用 1．5％的琼脂糖凝胶电泳分离后在 l t-,g／mL溴化乙锭 (EB)溶液中染色。
1．4 基因组 DNA的提取及 Southern印迹分析
采集生长期 ‘红玉’、圆叶海棠、 ‘红梨’幼叶，提取基因组 DNA【 ，8】。Southem印迹分析，用选
自A凡 1和 AFL2共同的保守区域 6S和 IOA做一对引物 ，用地高辛标记进行 PCR扩增，得到的44O bp
(AFIAO0)片段作为探针。其 PCR扩增的条件是，94℃变性 5 min后，94℃ 1 min，55℃ 1 min，72℃ 2
min，循环 40次。染色体组 DNA的消化是用限制性内切酶 BamH工，酶切后取总 DNA 5 g，用 60 V、
50 mA、0．8％的琼脂糖凝胶电泳分离后，印迹到尼龙膜 (Hybond Nt，Amersham)上。分子杂交是用
DIG EASY HYB液体在50~C，探针浓度100 ng／mI~的条件下进行 12 h。杂交后的尼龙膜在室温下用 2×
SSC，0．1％SDS冲洗 2次，然后在 65℃条件下，用 0．5×SSC，0．1％SDS洗 2次，各 15 min，化学发光
检测按照制造商的说明用 CDPs 进行，用 x光胶片显影。
2 结果与分析
2．1 AFL1和 AFL2的克隆及序列分析
从 ‘红玉’苹果顶芽 cDNA文库中克隆出全长大约 1．4 l(b的 2个 cDNA片段，分别定名为 A凡 1
和 AFL2，它们的碱基序列如图 1所示。其碱基序列在编码区有 9o％的同源性 ，但是在 3’末端非编码
区的同源性较少，大约60％。它们的编码区有 1 230 bp，编码 410个氨基酸。通过与 GenBank中收集
的 LEY同源基因的氨基酸序列进行同源性比较表明 (如表 1所示)，其氨基酸序列与小叶杨的 P舰 、
豌豆的 PEAFLO、矮牵牛的 A 、番茄的 TOFL有 70％的同源性；与金鱼草的 FLO、拟南芥的 LEY、
蓝桉的 ELF1有 60％以上的同源性；而与水稻的 RFL和辐射松的NEEDLY同源性较低 (50％左右)。
说明我们克隆到的 A凡 1和 AFL2是 LEY的同源基因。
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3期 曹秋芬等：苹果 LEAFY同源基因的 cDNA克隆与表达分析
1
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F^LlR
图 1 AFL1和 AFL2的 cDNA碱基序列
上一行为 AFLI cDNA的碱基序列，下一行为 AFL2 cDNA的碱基序列。
． 1 AIil t 0fnueleotide sequottees 0fAFL1 a|．d AFL2
Upper line shows nucleotide sequences of AFLI cDNA． 讨 lower line shows that of AFL2 cDNA
表 1 AFL1和 AFL2的氨基酸序列与其它植物同源基因的同源性
Table 1 AliLmn~ t 0famino acid sequelces 0f AFL1 and AFL2 witll other homologues genes (％)
2．2 AFL1和 AFL2在不同发育时期及不同组织器官的表达
取不同组织及花器官提取总 RNA，用 AFL2的特异性引物 3SP2．AFL2R进行 RT—PCR分析的结果
表明，AFL2在萼片、子房、根、茎、叶以及果台枝的顶芽内都有表达。而用 AFL1的特异性引物
3SP2一AFL1R进行 RT—PCR分析的结果表明，相同材料中 AFL1只在枝条顶芽中有表达；而增加 PCR
的循环数也不影响以上表达模式 (图 2)。说明根、茎、叶、顶芽及部分花器官的生长发育都需要
AFL2的存在，而 A凡 l是顶芽的发育所必需的。
图3表示 RT—PCR检测到的 AFL1和 AFL2在不同发育时期顶芽中的表达情况。根据显微观察，苹
果顶芽的营养生长从发芽持续到 6月末左右，8月末在芽的顶端开始发生圆锥状突起 】。从顶芽停止
生长到圆锥状突起开始出现这个过渡时期大概有一个月，在这一时期芽的顶端在形态上没有发生特
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殊变化。AFL1开始清晰的表达就是在这个时期内；而 AFL2则在整个观察期内都有表达。这些结果
表明，AFL1的表达可能具有时空调节性，而 AFL2则属于组成型表达。这种表达上的差异可能反映
了它们在生理机能上的差异。
AFLl
532bp
AFJ卫
368bp
图 2 不 同组 织 A凡 l和 AFL2
RNA的 RT—PCR分析
1：萼片；2：花瓣；3：雄蕊；4：子房；5：根；
6：茎；7：叶；8：顶芽。
№ ．2 RT—PCR analy~ of AFLI and AFL2
RNA in varioustissues
1：Sepal；2：Petal；3：Stamen；4：Ovary；5：Root；
6：Stem；7：【eaf； 8：Terminal bud．
2．3 AFL1和 AFL2的 Southern印迹分析
用内切位点较少的限制性内切酶 Barn／／工对
总 DNA进行消化，用地高辛标记的 AFIA00 PCR
扩增产物作探针 ，而且在 AFL1和 AFL2 cDNA两
序列的相对于AFL400区域内没有 BamH工的酶切
位点。图4表明，用 BamH I消化后红玉、圆叶
海棠、红梨都有 4条带。这些结果说明，在苹果
属中栽培品种红玉，野生种圆叶海棠，以及梨属
的栽培品种红梨中 L 的同源基因是多拷贝的，
而且有着相同的拷贝数。
06_m5 06-I9 07-I7 07-31 08-13 08-28 09-I2 10-10
AFLl
532bp
AFJ卫
368bp
图 3 不同发育时期顶芽 AFLI
和 AFL2的RT—PCR分析
Fig．3 RT—PCR analy~ ofAFLI andAFL2
RNA in apic~ meristem at variouslimes
4．3kb．．·
2．3kb．．·
图4 苹果、圆叶海棠和梨的 Soufl~em 印迹分析
1：红玉；2：圆叶海棠；3：红梨
F ．4 s0叫1em bolt analysis ofapple。crab ap le and pear
1：Jonathan 2：Crab apple；3：Hongli
3 讨论
在拟南芥中发现的 L 基因已经被证明是决定营养生长向生殖生长过渡的一个关键基因，与金
鱼草的 FLO是成花的同源基因，其主要在成花的茎顶端分生组织中表达l1，6]。该基因发生突变后拟南
芥的无限花序转变成了无限伸长的次生枝 ；而使该基因在 35S启动子调控下过量表达，则能使花期提
早和使所有的侧枝转变为单生花l2]。这些研究结果表明，对 L 或其同源基因表达的调控可以使我
们根据需要调节植物的开花时间和程度。
Kotoda~9J用 AFL1和 AFL2的共同探针进行的 Northern印迹也表明，AFL1和 AFL2的 mRNA在花芽
发育的整个时期都有表达，甚至在营养生长时期的6月也有表达。与以上结果相同的是 ，在苹果的顶
芽发育过程中 L 同源基因一直在起作用，但是由于苹果是一个复杂的杂合体植物，我们从其顶芽
中克隆的两个 L 同源基因在顶芽发育的不同时期以及不同组织器官又有各自的特异性表达 (图 3)。
图 1中 AFL1和 AFL2的编码区碱基序列有较高的同源性 (9o％)，而非编码区的同源性则在 60％以
下。说明这两个基因虽然有共同的起源，但是在功能及作用的时间、空间上已产生了明显的差异，在
花和营养组织的发育中起不同的调控作用。AFL1的表达表现了组织器官和时期的特异性 ，可能具有
时空调节性；而 AFL2在顶芽的整个发育过程及多数组织器官都有表达，属于组成型表达。关于这两
个基因在苹果属植物体内的生理功能，还有待进一步探讨。
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3期 曹秋芬等：苹果 LEAFY同源基因的 cDNA克隆与表达分析 27l
在被克隆了 同源基因的植物中，大部分植物基因组中 同源基因是单拷贝的，如拟南芥、
小叶杨、番茄、豌豆[2,3．10,1)；也有多拷贝的，如蓝桉u j有 3个 L 同源基因，但它们有两个是不表达
的，并且在它们的编码区域有终止密码子。因此蓝桉中仅有一个基因的功能与 相似。在辐射
松Ll_jH 中也有两个 同源基因 NEEDLY和 PRFLL。本研究中苹果属的栽培品种红玉和野生种圆叶海
棠，梨属的栽培品种红梨都显示了4条带，证明在它们的基因组中 同源基因都是多拷贝的．而且在
成花的调节功能上存在差异。由此可见， 的家族基因在二倍体植物中有的是单拷贝，有的是多拷
贝，这可能与这些植物的起源、进化及其所需的不同生理功能有关。这一问题尚需要进一步研究。
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Fruit Tree Science，Shimokuriyagawa，Morioka，020—0123 Japan)
Abf 徼 t：Two LEAFY like cDNA fragments of in length，AFL1 and AFL2 were cloned from the terminal buds
of bearing shoot of apple trees．Sequencing analysis showed that the coding regions of AFL1 and AFL2 had 9O％ ho·
mo legy，but the 3’non—coding regions had less than 60％ homology．The ded uced amino acid sequenc．e of AFL1 or
AFL2 cDNA had over 70％ similarity with Pm ， PEAFLO and肛 genes of poplar、pea and petunia， and less
than 70％ sim larity with TOFL， FLO and genes of tomato， antirrhinum 胧 and arab／dops／s respectivehy．
RT—PCR analysis showed that A儿 1 expressed only in the telminal buds during the transition period from vegetative
to reproductive growth；whereas AFL2 exp ressed in the sepal， ovary， root，stem， leaf and the terminal buds be·
tween June to Oct．These results might suggest that AFL1 and AFL2 had a common origin，and their functions had
diverged， so that they appeared to play independent roles inⅡ0Ial and vegetative tissue development．Southem blot
analysis showed that there were at least two copies of LEAFY homo logues genes in Malus species and pear．
Key words： Apple；Gene； LEAFY ；Cloning；Expression
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