全 文 ：园 艺 学 报 2001, 28 ( 2) : 173~ 174
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期: 2000- 08- 01; 修回日期: 2000- 10- 16
基金项目: 陕西省攻关项目 98K12G19 ( 11)
胡萝卜 Daucus carota var. sativus Hoffm Deutschl抗冻蛋白
基因的克隆及测序尹明安1 崔鸿文1 樊代明2 郭 立1
( 1西北农林科技大学, 杨凌 712100; 2 第四军医大学, 西安 710032)
摘 要: 以宁夏吴忠胡萝卜、陕西华县胡萝卜和陕西汉中胡萝卜 3 个地方品种为材料,
用PCR ( polymerase chain reaction) 的方法克隆了中国胡萝卜的抗冻蛋白基因 ( afp ) , 测定了其
核苷酸序列, 并和英国胡萝卜的 afp 序列进行了对比。在所测 1004 个核苷酸中, 两变种碱基
不同者有 36 个, 占 3. 6% , 其中无义突变 21个, 有义突变 15 个。按有义突变计, 同源性为
98. 5%。
关键词: 胡萝卜; 抗冻蛋白; 分子生物学
中图分类号: Q 785; S 631. 2 文献标识码: A 文章编号: 0513353X ( 2001) 02017302
1 目的、材料与方法
1998年 10月 Dawn Worrall等1 发表了胡萝卜抗冻蛋白 ( AFP) 及其基因的论文, 标志
着第 1个植物抗冻蛋白基因 afp 的发现。Worrall等所用胡萝卜材料为 Daucus carota var.
autumn King ( Smallwood M. , 个人通讯) , 与我国栽培的胡萝卜 Daucus carota var. sativus
Hoffm Deutschl属于同一种内的不同变种2 。两变种处于长期隔离的不同生态环境中。为
了解我国胡萝卜 afp 的基本结构和对其进行开发利用, 很有必要对我国胡萝卜的 afp 进行
克隆和测序。以宁夏吴忠、陕西华县和陕西汉中 3个地方品种为材料, 根据 var. autumn
King 的AFP cDNA已知序列, 设计合成一对引物, 以胡萝卜基因组 DNA 为模板进行 PCR。
对PCR产物做琼脂糖凝胶电泳, 纯化回收目的片段。根据已知序列的酶切位点, 选择
Bam H !和 Pst !对目的片段进行酶切分析。构建克隆载体所用的载体为上海生工的
pUCmT Vector, 宿主菌为大肠杆菌 DH 5, 感受态的制备及转化过程参照文献 3 进行。
按碱裂解法少量提取质粒3 。以质粒 DNA为底物用 Bam H !进行酶切鉴定; 以质粒 DNA
为模板进行 PCR鉴定。由上海博亚生物技术有限公司用 Sanger 双脱氧链终止法进行目的
基因的序列测定。
2 结果与分析
2. 1 PCR及目的片段的酶切鉴定 试验所用的3个品种均扩增出特异目的片段 (约 1 000
bp)。对经过纯化回收的目的片段分别用 Bam H !和 Pst !进行酶切分析, Bam H !产生约
600 bp和 400 bp的预期片段。Pst !产生约 900 bp和 100 bp的预期片段。据此可初步认为
该目的片段即为胡萝卜AFP 的基因片段。
2. 2 克隆载体的构建及重组质粒的鉴定 选择宁夏吴忠胡萝卜的 afp 片段构建克隆载体。
转化细菌后, 直径 9 cm 的培养皿上生成菌落约 800个, 其中白色菌落约占 60%。对白色
菌落的质粒DNA进行 Bam H !酶切鉴定, 1个克隆 (TV1) 产生约 600 bp的预期片段。以
TV1的微量质粒 DNA为模板, 非常特异地扩增出了约 1 000 bp的目的片段。
2. 3 目的基因的序列测定 目的基因的测序结果和 var. autumn King 的 afp 序列进行对
比。开放阅读框从ATG开始到TAG结束, 共 999个核苷酸, 编码 332个氨基酸。在所测
1004个核苷酸中, 两变种碱基不同者有 36 个, 约占 3. 6%, 其中无义突变 21 个, 占
2. 1%, 有义突变 15个, 占 1. 5%。按有义突变计, 两变种的同源性为 98. 5%。332个氨
基酸中, 两变种有 14个氨基酸不同 (其中 1个氨基酸的三联体密码有两个突变位点) , 它
们分别位于 AFP 的第 15、55、56、63、71、83、109、179、181、216、217、240、245 和
262位。var. autumn King 在这些位点的氨基酸依次为: I、P、G、N、N、Q、H、Q、Q、
S、S、N、T、G; var. sativus Hoffm Deutschl相应为: M、S、D、D、S、E、N、R、E、R、
A、K、M、E。它们对AFP 的结构与功能有何影响, 还不清楚, 但至少说明它们所在区域
乃非保守区。
3 讨论
本试验以地方胡萝卜品种为材料, 是考虑到地方品种比较保守, 基因流动少, 基本保
持着变种的原貌。中国胡萝卜 var. sativus Hoffm Deutschl与英国胡萝卜 var. autumn King 长
期以来处于不同的生态环境中, 其 afp 保持了很高的种内同源性 ( 98. 5%) , 但又有一定
的变种间异质性 ( 1. 5% ) , 体现了生物的多样性, 符合分类学和遗传学规律。至于 15个
核苷酸变异造成的 14个氨基酸的差异会不会导致 AFP 结构与功能的不同, 主要取决于发
生变异的氨基酸在决定AFP 结构与功能中所起作用的重要性。由于目前胡萝卜 AFP 结构
与功能的研究还不够深入, 故对某一位点的氨基酸, 很难判断其对AFP 的结构与功能究
竟有什么影响。在这种情况下, 只有通过严格的表达比较才能确定。这里, 两变种有差异
的 afp 则为AFP 的结构与功能研究提供了很好的实验材料。
参考文献:
1 Worrall D, El ias L, Ashford D, et al. A carrot leucine richrepeat protein that inhibits ice recrystallization. Science, 1998,
282: 115~ 117
2 中国科学院西北植物研究所编著. 秦岭植物志第一卷种子植物 (第三册) . 北京: 科学出版社, 1981. 432
3 萨姆布鲁克 J, 弗里奇 E F, 曼尼阿蒂斯 T. 分子克隆实验指南 (第二版) . 金冬雁, 黎孟枫译. 北京: 科学出版
社, 1992. 19~ 22, 55~ 56
Cloning and Sequencing of Antifreeze Protein Gene in Daucus carota var. sativus
Hoffm Deutschl
YinMing∀ an1, Cui Hongwen1, Fan Daiming2, and Guo Li1
( 1Northwest SciTech University of Agricultural and Forestry , Yangling 712100; 2The Fourth University of Military
Medicine, Xi∀ an 710032)
Abstract: Three carrot cultivar Wuzhong Ningxia, Huaxian Shaanxi and Hanzhong Shaanxi were used as test ma
terial and antifreeze protein gene ( afp ) of Chinese carrot ( Daucus carota var. sativus Hoffm Deutschl) was cloned
and sequenced by PCR ( polymerase chain reaction) . Obtained sequence was compared with that of British carrot
( Daucus carota var. autumn King) . There were 36 different bases in 1004 nucleotides ( 3. 6% ) between the two va
rieties. Among the different bases there were 21 nonsense mutations and 15 sense mutations. According to sense muta
tions, homology was 98. 5% .
Key words: Carrot ( Daucus carota var. sativus Hoffm Deutschl) ; Antifreeze protein; Molecular biology
174 园 艺 学 报 28卷