全 文 ：© 1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net
园 艺 学 报 2001 , 28 (1) : 74～76
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2000 - 04 - 25 ; 修回日期 : 2000 - 09 - 25
基金项目 : 国家自然科学基金资助项目 (39570381)
大白菜 AB281 高频再生系统的建立及 gus A基因瞬时表达的研究
王火旭1 王关林1 王晓岩2 方宏筠1 贾士荣3 唐益雄3 魏毓棠4
(1 辽宁师范大学生物工程研究所 , 大连116029 ; 2 大连市种子公司 , 大连116033 ; 3 中国农业科学院生物技术中
心 , 北京 100081 ; 4 沈阳农业大学园艺系 , 沈阳 110161)
摘 要 : 以大白菜自交系AB281的子叶和真叶切块为外植体 , 建立了高频不定芽离体再生系
统。在MS附加 TDZ 0. 2 mg/ L , NAA 2. 0 mg/ L , AgNO3 10 mg/ L 和 ABA 0. 25 mg/ L 的再生培养基上 ,
子叶和真叶的不定芽再生频率分别达到 93. 3 %和 90. 0 % , 每块外植体的不定芽数达 3～6 个 , 最多
达 21个。以 EHA105/ pMOG410为载体转化侵染大白菜AB281的子叶 , 获得较高 gus A基因瞬时表达
频率的条件为 : 子叶预培养 2～3 d ; 侵染的工程菌液的浓度 OD 0. 3～0. 5 ; 侵染时间 2～10 min ; 共
培养时间 2～3 d。
关键词 : 大白菜 ; 子叶 ; 真叶 ; 再生 ; gus A基因
中图分类号 : Q 786 ; S 634 文献标识码 : A 文章编号 : 05132353X (2001) 0120074203
1 目的、材料与方法
β
- 葡萄糖酸苷酶基因 ( gus A) 的瞬时表达测试是优化转化系统条件的快速有效方法 , 特
别是采用 gus A2intron 基因 , 保证了 gus A 基因只能在植物细胞中表达 , 不能在原核细胞中表
达 , 可避免农杆菌转化中假阳性的出现 , 增加实验的可靠性。为了进行大白菜的遗传转化 , 首
先应建立其高频再生和高效转化系统。经过许多学者的研究 , 迄今已利用大白菜的子叶—柄建
立了转化系统〔1〕。本试验中以大白菜 AB281 的子叶 (去除子叶柄) 切块及真叶切块为外植体 ,
建立高频不定芽再生系统 , 并以该系统研究 gus A2intron 基因在大白菜AB281 中瞬时表达的影响
因素 , 为建立大白菜高效目的基因转化系统奠定基础。
取大白菜自交系AB281 无菌籽苗4 日龄的子叶及20 日龄的真叶 , 沿四周切割 , 并垂直于中
脉切 2～3 道切口 , 接于MS附加不同浓度的 AgNO3、TDZ、BA、NAA、IAA 和 ABA 的再生培养
基上 , 每个处理 3 次重复 , 每次重复 15～20 个外植体。所有培养基均在灭菌前将 pH调至 5. 8。
外植体培养温度为 25 ℃左右 , 光照强度 2 900 lx , 光照时间 12 h。外植体接到再生培养基 30 d
左右统计不定芽再生频率。
所用菌株为根癌农杆菌 EHA105 (pMOG410) , 携带 gus A2intron , 辽宁师范大学生物工程研
究所实验室保存。工程菌液的制备及转化方法参见方宏筠等〔2〕的方法。
子叶中 gus A 基因瞬时表达的检测参照 Shi2rong Jia 等〔3〕的方法。瞬时表达频率 (transient
expression frequency , TEF) 为有 gus A 基因表达的外植体数占总外植体数的百分率。
2 结果与分析
2.1 大白菜子叶和真叶不定芽高频再生体系的建立及其影响因素 试验结果见表 1。大白菜
AB281 的子叶和真叶在MS单独附加 AgNO3 或生长素、细胞分裂素、ABA 的培养基上 , 均不能
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再生不定芽。在附加生长素和细胞分裂素但不附加 AgNO3 或 ABA 的培养基上 , 也不能再生不
定芽或不定芽的再生频率极低。AgNO3 5～15 mg/ L 与细胞分裂素及生长素配合使用 , 能大幅度
提高子叶及真叶不定芽的再生频率。ABA 0. 1～0. 25 mg/ L 对不定芽的再生也具有促进作用 , 并
能改善不定芽的质量 , 减少玻璃化芽的产生。ABA 与AgNO3 配合使用优于单独使用 , 二者具有
协同增效作用 , 其中AgNO3 是关键因子。
大白菜AB281 对 TDZ比较敏感 , 再生不定芽所需的浓度较低 , 对BA 的敏感性较差 , 再生
不定芽所需的浓度较高。TDZ的效价大约是BA 的 10～20 倍。NAA 对大白菜 AB281 不定芽再生
的作用优于 IAA。在MS附加 TDZ 0. 2 mg/ L , NAA 2. 0 mg/ L , AgNO3 10 mg/ L 和ABA 0. 25 mg/ L
的组合上 , 可使子叶及真叶获得高频再生 , 子叶再生频率可达 93. 3 % , 真
表 1 培养基中的附加成分对大白菜 AB281 子叶
不定芽再生的影响
Table 1 Effects of supplemented components in
the medium on shoot regeneration from
cotyledons of Chinese cabbage AB281
MS培养基附加成分
Supplemented components in the
medium (mg/ L)
AgNO3 TDZ BA NAA IAA ABA
不定芽再生频率
Percentage of shoot
regeneration ( %)
子 叶
Cotyledons
真 叶
Leaves
0 1 0 0 0 0 0
0 0 0 1 0 0 0 0
0 0 1 1 0 0 0 0
0 0 0 0 0 0. 25 0 0
5 0 0 0 0 0 0 0
2 0 1 1 0 0 26. 7 ±5. 78
5 0 1 1 0 0 53. 3 ±8. 16
10 0 1 1 0 0 56. 7 ±5. 17 0
15 0 1 1 0 0 50. 0 ±6. 23
20 0 1 1 0 0 48. 3 ±7. 53
25 0 1 1 0 0 23. 3 ±5. 16
10 0. 1 0 1 0 0 73. 7 ±4. 78 63. 5 ±7. 24
10 0. 5 0 1 0 0 74. 5 ±5. 99 68. 3 ±5. 31
10 1. 0 0 1 0 0 61. 7 ±7. 64 42. 6 ±9. 66
10 0 0. 5 1 0 0 20. 5 ±4. 23 0
10 0 2. 0 1 0 0 51. 7 ±7. 50 0
10 0. 2 0 0. 5 0 0 67. 8 ±2. 55 57. 2 ±6. 56
10 0. 2 0 1. 0 0 0 79. 1 ±3. 78 66. 7 ±8. 67
10 0. 2 0 2. 0 0 0 87. 8 ±9. 70 80. 6 ±4. 37
10 0. 2 0 4. 0 0 0 59. 9 ±4. 86 47. 4 ±3. 42
10 0. 2 0 0 0. 5 0 0 0
10 0. 2 0 0 1 0 0 0
10 0. 2 0 0 2 0 0 0
0. 2 0 2. 0 0 0. 5 40. 0 ±7. 37
10 0. 2 0 2. 0 0 0. 25 93. 3 ±3. 25 90. 0 ±8. 97
10 0. 2 0 2. 0 0 0. 5 92. 2 ±5. 62
10 0. 2 0 2. 0 0 1. 0 82. 0 ±4. 61
叶再生频率可达 90. 0 % , 每块外植体不定芽
数一般可达 3～6 个 , 最多达 21 个 , 并且从
外植体的近轴端、中部以及远轴端切口均能
再生出不定芽。
大白菜不同基因型的再生应答反应不同。
11 个基因型的子叶在不同再生培养基上的再
生频率为 15. 8 %～93. 3 % , 其中 AB281 的再
生能力最强。
2. 2 gus A 基因在 AB281 中瞬时表达的影响
因素 试验结果见表 2。预培养能提高大白
菜AB281 子叶细胞中的 gus A 基因的瞬时表
达频率。未预培养和预培养 1d 的子叶 ,
表 2 转化因素对 gus A基因瞬时表达频率的影响
Table 2 Effects of factors on transient
expression of gus A gene
预培养
时间
Preculture
time (d)
菌液浓度
Bacterial
density (OD)
侵染时间
Infection
time
(min)
共培养
时间
Coculture
time (d)
瞬时表
达频率
TEF
( %)
0 0. 3～0. 5 2 3 10
1 0. 3～0. 5 2 3 20
2 0. 3～0. 5 2 3 100
3 0. 3～0. 5 2 3 100
4 0. 3～0. 5 2 3 60
5 0. 3～0. 5 2 3 30
3 0. 000 6～0. 001 5 3 30
3 0. 006～0. 01 5 3 60
3 0. 06～0. 1 5 3 80
3 0. 3～0. 5 5 3 90
3 0. 3～0. 5 10 3 90
3 0. 3～0. 5 2 2 100
3 0. 3～0. 5 2 4 90
3 0. 3～0. 5 2 5 80
3 0. 3～0. 5 2 6 70
571期 王火旭等 : 大白菜AB281高频再生系统的建立及 gus A基因瞬时表达的研究
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共培养结束后 , 子叶切口褐化比较严重 , 说明大白菜子叶伤口未愈合时易受农杆菌的伤害。预
培养 2 d 以上 , 子叶伤口处已形成少量愈伤组织 , 共培养结束后 , 子叶状态较好 , 伤口未发生
明显褐化。预培养时间超过 4 d , gus A 基因的瞬时表达频率明显下降。可能是由于此时子叶的
伤口细胞不能提供足够量的诱导农杆菌贴壁的受体 , 也可能是由于细胞的分裂速度减慢 , 进入
细胞核的 T2DNA 量减少。
菌液浓度能明显影响大白菜子叶细胞中 gus A 基因的瞬时表达频率。对数生长期的菌液不
稀释 (OD 为 0. 3～0. 5) 或稀释倍数较低 (OD 为 0. 06～0. 1) , 子叶的瞬时表达频率较高。菌液
的浓度过低 (稀释 50 倍以上 , OD < 0. 01) , 接菌量不足 , 共培养 3 d 后 , 外植体的切口边缘只
有很少的农杆菌生长 , gus A 基因的瞬时表达频率较低 , 说明农杆菌的T2DNA向植物细胞的转
移机率较低。
侵染时间在 2～10 min 内 , 对瞬时表达频率无明显影响。
共培养 2 d , gus A 基因的瞬时表达频率即可达到 100 % , 共培养至第 3 天时 , 瞬时表达频
率可继续保持在 100 % , 第 4 天开始下降。共培养时间超过 4 d , 由于农杆菌的过度增殖 , 大白
菜外植体的伤口细胞受到农杆菌的伤害而褐化死亡的现象逐渐加重。
综上 , 在以根癌农杆菌介导的大白菜转化中 , 子叶应预培养 2～3 d ; 用于侵染的工程菌液
的浓度以OD 0. 3～0. 5 为佳 ; 侵染时间可选用 2～10 min ; 共培养时间以 2～3 d 为宜。
参考文献 :
1 Se Il Jun , Seok Yoon Kown , Kee Yoeup Paek , et al . Agrobacterium2mediated transformation and regeneration of fertile transgenic plants
of Chinese cabbage ( Brassica campestris ssp. pekinensis cv. spring flavor) . Plant Cell Reports , 1995 , 14 : 620～625
2 方宏筠 , 王关林 , 王火旭 , 等. 抗菌肽基因转化樱桃矮化砧木获得抗根癌病的转基因植株. 植物学报 , 1999 , 41 (11) :
1892～1898
3 Jia Shirong , Yang Mei2zhu , Russ Ott , et al . High frequency transformation of Kalanchoe laciniata. Plant Cell Reports , 1989 , 8 : 336
～340
Establishment of Efficient Shoot Regeneration System of Chinese Cabbage ( Brassica
campestris ssp. pekinensis) Inbred Line‘AB281’and Studies of Transient Expression
of gus A Gene
Wang Huoxu1 , Wang Guanlin1 , Wang Xiaoyan2 , Fang Hongjun1 , Jia Shirong3 , Tang Yixiong3 , and Wei
Yutang4
(1 Bioengineering Institute of Liaoning Normal University , Dalian 116029; 2 Dalian seed company , Dalian 116033;
3 Biotechnology center of the Chinese Agriculture Academy of Science , Beijing 100081; 4 Department of Horticulture , Shenyang
Agricultural University , Shenyang 110161)
Abstract : An efficient shoot regeneration system was established using cotyledon and leave cuts of the inbred line‘AB2
81’as explants. On the MS medium supplemented with 10 mg/ L AgNO3 , 0. 2 mg/ L TDZ, 2 mg/ L NAA and 0.25mg/ L
ABA , the regeneration frequency of the cotyledon and leave explants was up to 93. 3 % and 90 % respectively. The mean
number and the most number of shoots per explant was 3 - 6 and 21 respectively. Cotyledons of AB281 were inoculated with
Agrobacterium tumefaciens strain EHA105 containing pMOG410 carrying gus A2intron gene. The optimum conditions for the
transient expression of gus A gene were as follows : preculture time of 2 - 3 days , bacterium density of OD 0. 3 - 0.5 , infec2
tion time of 2 - 10 min , and coculture time of 2 - 3 days.
Key words : Chinese cabbage 〔Brassica campestris L . ssp. pekinensis (Lour) Olsson〕; Cotyledons ; Leaves ; Re2
generation ; Gus A gene
67 园 艺 学 报 28卷