全 文 ：© 1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net
园 艺 学 报 2003 , 30 (5) : 505～510
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2003 - 01 - 24 ; 修回日期 : 2003 - 06 - 05
基金项目 : 国家自然科学基金资助项目 (39970526)3 通讯作者 : Wangt @cau1edu1cn
苹果柱型基因的 ISSR分子标记研究
朱元娣1 李光晨1 李春雨1 董利民2 王 涛2 3
(1 中国农业大学农学与生物技术学院 , 北京 100094 ; 2 中国农业大学农业生物技术国家重点实验室 , 北京 100094)
摘 要 : 以普通型苹果品种‘富士’和柱型苹果‘舞姿’以及其杂交后代的柱型与非柱型实生苗为
试材 , 建立了苹果的 ISSR ( Inter2Simple Squence Repeat polymorphic DNA) 分子标记体系 , 并将 ISSR 标记用
于苹果柱型基因 Co 的遗传分析。结果表明 , 在 20μL 反应体系中各组分的用量为 Taq DNA 聚合酶 1U、
Mg2 + 的浓度为 215 mmol·L - 1 、模板 DNA 用量 20 ng、引物浓度 012μmol·L - 1及退火温度 52 ℃, 80 %引物具
有良好的扩增能力。调整模板 DNA 的用量、引物浓度及退火温度能够优化苹果 ISSR - PCR 扩增体系。从
所筛选的 65 个引物中获得了 35 个 ISSR 标记 , 其中 33 个标记呈现 1∶1 分离 , 可用于苹果柱型基因的遗传
分析。
关键词 : 苹果 ; 柱型苹果 ; 柱型基因 ; 遗传分析 ; ISSR 标记
中图分类号 : S 66111 文献标识码 : A 文章编号 : 05132353X (2003) 0520505206
ISSR ( Inter2Simple Squence Repeat polymorphic DNA , 内部简单序列重复多态性 DNA) 是一种新的遗
传标记技术 , 依赖于植物真核基因组中丰富的简单序列重复 (SSRs) , 由 2～4 个随机的核苷酸锚定在
微卫星序列如 (AC) n 或 ( GA) n 的 3pi或 5pi端 , 由此组成的单引物进行重复序列间 DNA 的 PCR 扩
增〔1〕。扩增的产品由聚丙烯酰氨凝胶分离、放射自显影或用琼脂糖凝胶电泳、EB 染色等方法检出。
该标记技术克服了 RFLP、SSR 和 RAPD 的技术性限制 , 具有操作简单、可重复性高、模板 DNA 用量
少等优点〔2～5〕。ISSR 标记符合孟德尔遗传 , 不仅用于生物分类学和系统发育的比较研究 , 也是有应
用潜力的遗传作图工具 , 已应用于果树遗传学研究的各方面 , 如苹果、梨品种鉴定〔6 ,7〕、核桃品种遗
传关系的确定〔8〕、李和板栗品种的表现型分类鉴定〔9 ,10〕、醋栗属植物的遗传多样性分析〔11〕、葡萄品
种无性系的区分〔12 ,13〕和柑橘、欧洲板栗遗传连锁图谱的构建〔10 ,14 ,15〕。
柱型苹果是‘威赛克’ (McIntosh Wijcik) 及以威赛克为亲本杂交所选育的芭蕾苹果的几个品种的
总称〔16〕。由于它具有新梢节间极紧凑、短枝及叶丛枝多、侧生延长枝少或无、自然单干树型的特点 ,
区别于目前生产上常见的普通型和短枝型品种 , 特别适合苹果矮化密植生产〔17〕。关于柱型苹果遗传
特性的研究最初以形态学分析为主 , 根据新梢节间长度、树体高度、侧枝有无或多少、短枝数量等形
态指标 , 以金冠和威赛克为亲本进行正交、反交测验以及用威赛克和其他品种杂交 , 对所得到的杂交
后代调查分析 , 确认柱型苹果极紧凑的生长特性是受单显性的 Co 基因控制 , 一个或几个修饰基因共
同作用〔18 ,19〕。随着分子标记技术在果树育种领域的应用 , 柱型基因 Co 的研究也在形态学研究的基础
上 , 利用各种 DNA 分子标记方法 , 在 DNA 分子水平研究 Co 基因的遗传〔20 ,21〕, 期望在柱型苹果的分
子育种领域获得突破 , 为 Co 基因的克隆、测序及遗传转化打下基础。
作者以苹果栽培品种‘富士’ (普通型) 和‘舞姿’ (柱型) 以及其杂种实生苗后代的柱型单株与
非柱型单株为试材 , 建立适合于苹果的 ISSR 标记分析体系 , 为将 ISSR 标记用于苹果柱型基因 Co 的
遗传分析打下基础。
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1 材料与方法
试验材料为苹果普通型品种‘富士’和柱型品种‘舞姿’及其杂种实生苗后代的柱型单株 20 个
与非柱型单株 20 个 , 分别提取叶片总 DNA。利用集团分离分析 (Bulked segregant analysis , BSA) 方
法 , 等量混合柱型单株与非柱型单株的 DNA , 构建柱型基因池 Pc 和非柱型基因池 Ps。叶片总 DNA 提
取参照祝军的改进方法〔21〕, 紫外分光光度计测定 A260/ A280的吸光值 , 确定 DNA 浓度和质量 , 并将样
品冷藏于 - 20 ℃备用。
ISSR 引物购于加拿大的 University of British Columbia , 编号为 UBC801～UBC900 共 100 个 ; Taq DNA
Polymerase、Buffer (10 ×) 、MgCl2 (25 mmol·L - 1) 、dNTP (10 mmol·L - 1) 购于鼎国生物技术发展中心
及华美生物技术公司。扩增在美国应用生物技术公司生产的 Gene Amp. PCR system 9700 上进行。PCR
的扩增产物经 118 %～2 %的琼脂糖凝胶电泳、EB 染色 , 凝胶成像扫描保存。
2 结果与分析
211 苹果 ISSR引物初选反应体系的建立
参照 ISSR 引物在小麦、水稻、玉米和柑橘等
作物上的 PCR 反应体系〔2～5〕, 通过预备试验 , 确
定各个反应组分的用量 , 即是在 20μL 的反应体
积中加入 20 ng DNA、1U Taq 聚合酶、10 ×Buffer
(含 MgCl2) 2μL、012 mmol·L - 1 dNTP、012μmol·
L - 1 Primer 和 ddH2O。PCR 的反应参数是 : 94 ℃变
性 5 min ; 94 ℃1 min、52 ℃1 min、72 ℃2 min , 45
个循环 ; 72 ℃延伸 8 min。以富士 DNA 为模板
DNA , 利用该反应体系筛选了 UBC 100 个引物 ,
80 个引物有清晰条带 , 但扩增的条带数目及清晰
程度不一致 (图 1) 。
212 苹果 ISSR反应体系的优化
PCR 反应体系中 , 酶、dNTPs、Buffer 和MgCl2
的浓度很容易控制 , 关键是调节模板 DNA 的浓
度、引物的浓度以及 PCR 反应过程中退火温度的
高低。根据初选的结果 , 设立了包括 DNA 浓度、
引物浓度以及 PCR 反应过程中退火温度 3 个变量
(见表 1) , 筛选 UBC 100 个引物 , 选择适合于苹
果的 ISSR - PCR 反应体系。
21211 引物浓度对 PCR 扩增结果的影响 大多数
引物在 012～016μmol·L - 1的应用浓度之间均有清
晰的扩增片段 , 考虑到经济与效果两个方面 , 以
20μL 的反应体积中引物浓度为 012μmol·L - 1 , 个
别引物为 014μmol·L - 1和 016μmol·L - 1应用效果
更好。
图 1 以相同的模板 DNA对 ISSR引物的 PCR反应初选结果
Fig. 1 Display of ISSR primers with the same template
DNA in PCR reaction
表 1 ISSR- PCR反应体系 ( 20μL) 中各成分用量的设计
Table 1 Comparation of the components in ISSR- PCR
reaction volume ( 20μL)
模板 DNA
Template
DNA(ng)
引物
Primers
(mol·L - 1)
Taq DNA
聚合酶
Polymerase
(U)
Buffer +
MgCl2
(μL)
dNTP
(mmol·L - 1)
退火温度
Annealing
temperature
( ℃)
20 012 1 2 012 50
25 014 1 2 012 52
30 016 1 2 012 55
35 018 1 2 012 45
21212 模板DNA 的用量对扩增结果的影响 模板DNA 的用量对 ISSR - PCR 的扩增结果影响较小 (图
2) 。以富士 DNA 为模板 , DNA 的用量在 5～50 ng 之间均得到了良好的扩增 , 但以 20～25 ng 的效果最
佳。当 DNA 用量过多时 , PCR 扩增片段增加至不可数或呈现出弥散状态。
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21213 PCR 反应过程中退火温度对扩增结果的影
响 在引物浓度、模板 DNA 的用量固定的情况
下 , 不同的退火温度对 PCR 扩增的结果影响较
大。大多数引物在退火温度 52 ℃的条件下均有清
晰、稳定的扩增片段 , 而引物 UBC824 在 50 ℃、
UBC814 在 55 ℃时效果更好。图 3 表明不同退火温
度条件下 , ISSR 引物的 PCR 扩增能力在富士
(F) 、舞姿 (W) 、柱型基因池 ( Pc) 和非柱型基
因池 (Ps) 中的表现一致。
21214 不同引物的最佳反应条件 ISSR 引物在设
计上锚定的是基因组中重复序列中间的区域 , 碱
基数目为 16～22 个 , 多数为 17 个或 18 个 , 富含
不同的重复序列。由于碱基的种类、数目和排列
顺序的差异 , 对 PCR 反应条件的要求也有较大的
差异 , 不同引物表现的 PCR 扩增能力不同。以
(AT) n 为主的引物 UBC801～UBC806、UBC831～
UBC833、UBC837～UBC839 等在所设置的各个退
图 2 不同浓度的模板 DNA对 PCR扩增的影响
引物 UBC864 , 20μL 的反应体积中 DNA 用量
分别是 5～50 ng ; M. 分子量标记。
Fig. 2 Effect of different concentration of
template DNA in PCR reaction
primer UBC864 , 5 - 50 ng template DNA in 20μL
reaction volume ; M. marker.
火温度 , 提高模板 DNA 及引物浓度等条件下均无扩增产物 ; 以 ( GT) n 为主的引物如 UBC819、
UBC820、UBC821 等 , 在所设置的各个条件下 , 虽然有清晰的扩增片段 , 但数目少 , 一般为 2～3 个 ;
一些以重复序列 ( GA) n、(AC) n、( GC) n、(CT) n 为主的引物多数有清晰可辨的扩增片段。个别引物如
UBC880 , 序列为 ( GGAGA) 3 , 在 DNA 模板用量和引物浓度一致的前提下 , 在 3 个退火温度 50、52 及
55 ℃的 PCR 扩增中均有清晰稳定的片段 (图 4) , 而大多数的引物在一定的反应条件下表现为扩增片
段数目多而且清晰 , 否则会出现扩增条带弱、数量少或是呈现弥散状态。
图 3 不同退火温度对 PCR扩增结果的影响
A、B、C分别为 50 ℃、52 ℃和 55 ℃。F : 富士 ; W: 舞姿 ; Pc : 柱型基因池 ; Ps : 非柱型基因池。
Fig. 3 Effect of different annealing temperature in PCR amplification
A : 50 ℃; B : 52 ℃; C : 55 ℃; F : Fuji ; W: Waltz ; Pc : Columnar gene pool ; Ps : Standard gene pool ; M: marker.
通过对富士、舞姿、柱型基因池和非柱型基因池 DNA 的 PCR 扩增结果表明 , 不同引物最佳的
PCR 反应条件各异 , 为了获得更好的扩增效果 , 应调整反应体系的关键变量 , 如模板 DNA 的用量、
引物浓度及 PCR 扩增中退火温度。表 2 列举了可用于苹果遗传分析的 65 个 UBC引物最适合的 PCR 反
应条件。
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表 2 苹果 ISSR- PCR扩增体系的优化最佳条件
Table 2 Optimization of ISSR- PCR reactions for apple
引物序号/ 引物序列
The serial number and sequence of primers
适宜的 PCR 扩增条件
Optimization of ISSR - PCR reactions(20μL)
引物 Primers
(μmol·L - 1)
DNA
(ng)
退火温度 Annealing
temperature ( ℃)
UBC808/ ( AG) 8C; UBC809/ ( AG) 8G; UBC810/ ( GA ) 8T; UBC811/ ( GA ) 8C; UBC812/ ( GA ) 8A ;
UBC813/ (CT) 8T; UBC815/ ( CT ) 8G; UBC816/ ( CA ) 8T; UBC817/ ( CA ) 8A ; UBC818/ ( CA ) 8G;
UBC825/ (AC) 8T; UBC827/ ( AC) 8G; UBC834/ ( AG) 8YT; UBC835/ ( AG) 8YC; UBC836/ (AG) 8YA ;
UBC840/ ( GA) 8YT;UBC841/ ( GA) 8YC;UBC842/ ( GA) 8YG;UBC845/ (CT) 8RG;UBC880/ ( GGAGA) 3 ;
UBC846/ (CA) 8RT; UBC848/ ( CA) 8RG; UBC851/ ( GT) 8YG; UBC852/ ( TC) 8RA ; UBC856/ (AC) 8YA ;
UBC861/ ( ACC ) 6 ; UBC862/ ( AGC ) 6 ; UBC864/ ( ATG ) 6 ; UBC866/ ( CTC ) 6 ; UBC867/ ( GGC ) 6 ;
UBC868/ ( GAA) 6 ;UBC873/ ( GACA) 4 ;UBC884/ HBH (AG) 8 ;UBC885/ BHB ( GA) 7 ;UBC888/ BDB(CA) 7 ;
UBC889/ DBD(AC) 7 ;UBC900/ ACTTCCCCACAGGTTAACACA
012～014
20～25
52
UBC822/ (TC ) 8A ; UBC823/ ( TC ) 8C; UBC824/ ( TC ) 8G; UBC826/ ( AC ) 8C; UBC847/ ( CA ) 8RC;
UBC849/ (CA) 8RG; UBC850/ ( GT) 8YC; UBC853/ ( TC) 8RT; UBC854/ ( TC) 8RG; UBC855/ ( AC) 8YT;
UBC858/ ( TC ) 8RT; UBC860/ ( TC ) 8A; UBC876/ ( GATA ) 2 ( GACA ) 2 ; UBC881/ ( GGGTG ) 3 ;
UBC886/ VDV(CT) 7 ;UBC887/ DVD(TC) 7 ;UBC891/ HVH(TG) 7 ;UBC898/ GATCAAGCTTNNNNNNATGTGG
014
20～25
50
UBC807/ (AG) 8T; UBC814/ ( CT) 8A ; UBC843/ ( CT) 8RA ; UBC844/ ( CT) 8RC; UBC857/ ( AC) 8YG;
UBC877/ (TGCA) 4 ;UBC897/ CCGACTCGAGNNNNNNATGTGG
014
25
55
UBC828/ ( TG) 8A ; UBC859/ ( TG) 8RC; UBC829/ ( TG) 8C; UBC896/ AGGTCGCGGCNNNNNNATG;
UBC899/ CATGGTGTTGGTCATTGTTCCA
016
20
50
213 利用 ISSR标记对 Co 基因进行遗传分析
用扩增能力强的 ISSR 引物对柱型基因池 Pc
和非柱型基因池 Ps 进行多态性筛选 , 并在亲本富
士和舞姿之间验证所筛选到的差异片段 , 所得到
的 ISSR 标记再经过富士与舞姿的 F1 作图群体检
测 , 观察各标记的分离表现。根据优化后的 PCR
扩增条件 , 引物 UBC880 在退火温度 52 ℃下 (图
4) 得到一个 1000 bp 的片段 , 来自亲本富士 , 并
在非柱型基因池 Ps 中出现 , 该多态性片段记为一
个 ISSR 标记 UBC880 - 1000 bp。经过 F1 后代 120 株
实生苗的检测 , 该标记在 61 株中出现 , 符合孟德
尔的 1∶1 分离 (χ2 = 011333) 。从所筛选的 65 个引
物中获得了 35 个 ISSR 标记 , 其中 33 个标记符合柱
型基因的遗传分离特性 , 呈现 1∶1 的分离 , 可用于
柱型基因的遗传图谱构建及连锁分析 , 两个标记表
现了偏分离现象。
图 4 引物 UBC880 在不同退火温度条件下 PCR扩增的表现
A、B、C分别是 52 ℃、50 ℃、55 ℃; F. 富士 ; W. 舞姿 ;
Pc. 柱型基因池 , Ps. 非柱型基因池 ; M. 分子量标记。
Fig. 4 Display of primer UBC880 in different annealing
temperatures in PCR amplification
A : 52 ℃; B : 50 ℃; C : 55 ℃; F : Fuji ; W: Waltz ; Pc : Columnar
gene pool ; Ps : Standard gene pool ; M: marker.
3 讨论
ISSR 标记技术同 RAPD、SSR 等相似 , 也是基于 PCR 扩增为核心的DNA 指纹分析技术 , 但该技术
融合了 RAPD 标记和 SSR 标记的优点 , 具有更广泛的应用前景。SSR 标记虽为共显性标记 , 但引物的
设计是基于某一物种中某重复序列两侧的保守序列 , 需要对该物种的基因组有足够的认识 , 引物是特
异的。而 ISSR 引物设计是随机的 , 不需要预先了解植物基因组的 DNA 序列 , 引物多以 (AT) n、
(GC) n、(AC) n、 ( GT) n 和 (CT) n 等两个碱基的重复序列为主 , 有的引物以 3 个碱基的重复为主 , 如
(ACC) n、(AGC) n 等 , 并在 3pi或 5pi端锚定。由于 AA/ TT和 GT/ CA 这样两种简单序列广泛分布于真核
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基因组中〔22〕, 增强了引物在植物基因组中的检测能力 , 可以在不同的植物中应用。除了用于果树的
遗传学研究之外 , 已经用于小麦遗传连锁图谱的构建〔5〕及水稻、玉米、甘薯、豇豆等品种、品系的鉴
定及系谱分析〔3 ,4〕。当然 , 不同的引物在不同植物的基因组中表现是不一致的。
与 RAPD 技术比较 , ISSR 引物一般是有 18～21 个碱基 , 多于 RAPD 引物的 10 个碱基 , 在 PCR 反
应过程中退火温度高 , 扩增稳定 , 可重复性强 , 而且模板 DNA 的用量更少。
311 引物序列对 PCR扩增能力的影响
在 UBC 100 个引物中 , 以 (AT) n 重复序列为主的引物均没有得到扩增产品 , 这种现象在柑橘上
亦如此。虽然植物基因组中含有丰富的 (AT) n 序列 , 但富含 (AT) n 或 ( TA) n 的引物由于可能自我互
配 (self2complementary nature) 的特性而导致无扩增条带的产生。同时在 3pi端和 5pi端锚定的引物 , 即
使其他碱基排列顺序完全相同 , 也表现出不同的扩增能力。在苹果基因组中 , 利用分子杂交技术筛选
Florida 的基因组文库很难得到 (AT) / (TA) 重复 , 但容易富集 (AG) / (CT) 重复 , 由此发展的微
卫星标记 , 富含 (AG) n、 ( GT) n 和 (AG) n 等 , 具有高水平的遗传多态性 , 可以用于品种鉴定和遗传
作图〔23 ,24〕。
312 检测方法对试验结果的影响
据报道 , ISSR 引物的扩增能力强于 RAPD、RFLP 和 SSR 等标记技术。用聚丙烯酰氨非变性胶方
法检测时 , PCR 扩增条带多 , 平均 60 个 , 扩增片段长度在 50～3000 bp , 可记录的条带在 100～2000
bp。用 2 %的琼脂糖凝胶检出 , 扩增片段长度在 200～2000 bp , 平均 1215 个扩增片段〔3〕。本试验用
118 %～212 %的琼脂糖凝胶电泳检测 , 扩增片段长度在 200～2000 bp , 数目在 6～12 之间。虽然理论
上 2 %以上的琼脂糖凝胶电泳可以检测出小到 50 bp 的 DNA 片段 , 但实际操作中大于 2000 bp 和小于
300 bp 的片段虽能检出 , 却很难进行统计分析。在可以检测区域的片段由于琼脂糖凝胶电泳分离能力
的限制 , 一些多态性片段不能被检测到。
313 模板 DNA的质量对扩增能力的影响
模板 DNA 的质量对任何一种分子标记技术的成功应用都是至关重要的。一般来说 , 吸光值 A260/
A280在 116～119 (紫外分光光度计) 的 DNA 样本能得到良好的扩增。但是如果模板 DNA 降解或含有
RNA 将会导致扩增的失败 , 表现为扩增片段少或无或弥散。当然 , 影响 PCR 扩增能力的还包括引物
本身是否降解、浓度的高低 , 以及 dNTP 与 Tag 聚合酶的质量。
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Studies on the ISSR Marker Analyses of the Columnar Gene in Apple
Zhu Yuandi1 , Li Guangchen1 , Li Chunyu1 , Dong Limin2 , and Wang Tao2
(1 College of Agarinomy and Biotechnology , China Agricultural University , Beijing 100094 , China ; 2 State Key Laboratories for
Agrobiotechnology , Beijing 100094 , China)
Abstract : In the present paper , cultivated apple‘Fuji’ (standard growth type) ,‘Waltz’ (or‘Telemon’,
columnar growth type) and seedlings in their progeny with standard and columnar types were used to establish the
ISSR (inter2simple sequence repeat) analyses in apple. ISSR markers were also used for genetic analysis of the
columnar gene. The results showed that 80 % primers produced good amplification in 20μL reaction volume include
1U Taq DNA polymerase , 215 mmol·L - 1 Mg2 + , 20 ng DNA and 012μmol·L - 1 primer with the annealing
temperature 52 ℃. Adjusting the concentration of the template DNA , primers and the annealing temperature can
optimize the ISSR - PCR amplification. 35 ISSR markers were obtained from the screened 65 primers. Among them
33 ISSR markers , which displayed 1∶1 segregant ratio in correspondence with the genetic segregation of Co gene ,
could be used for genetic analysis of the Co gene in apple.
Key words : Apple ( Malus ×domestica) ; Columnar apple ; Co gene ; ISSR marker ; Genetic analysis
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