全 文 ：园 　艺 　学 　报 　2005, 32 (6) : 1026～1029
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2005 - 01 - 25; 修回日期 : 2005 - 04 - 11
基金项目 : 国家自然科学基金项目 (30370982) ; 农业部蔬菜遗传与生理重点实验室项目3 通讯作者 Author for correspondence
Codom inan t2SCAR技术的建立以及在番茄育种中
的应用
国艳梅　杜永臣 3 　王孝宣　朱德蔚　高建昌
(中国农业科学院蔬菜花卉研究所 , 北京 100081)
摘 　要 : 结合 SCAR标记的原理与多引物 PCR技术 , 建立了共显性标记技术 Codom inant2SCAR。利用
该技术对 12份番茄近等基因系进行了遗传鉴定 , 结果表明该方法具有重复性好、迅速、简便、成本低的特
点 , 可用于番茄和其它作物的分子育种。
关键词 : 番茄 ; SCAR; 共显性标记 ; 分子标记
中图分类号 : S 64112　　文献标识码 : A　　文章编号 : 05132353X (2005) 0621026204
The Development of Codom inant2SCAR and Its Application in Tomato Breeding
Guo Yanmei, Du Yongchen3 , W ang Xiaoxuan, Zhu Dewei, and Gao J ianchang
( Institu te of V egetables and Flow ers, the Chinese A cadem y of A gricu ltura l Sciences, B eijing 100081, China)
Abstract: Codom inant2SCAR was developed on the basis of combination of SCAR molecular marker and
Multip lex2PCR. W e used this new technique to identify twelve tomato N IL s. The results indicated that the
Codom inant2SCAR was characterized by good rep roducibility, low cost and time consum ing. It is useful for the
MAS app lication in tomato and other crop s.
Key words: Tomato; L ycopersicon escu len tum ; SCAR; Codom inant marker; Molecular marker
自 1992年 Tanksley等〔1〕发表了以 RFLP标记为主的高密度番茄连锁图谱以来 , 番茄图谱中的标
记不断增加。COS (Conserved O rtholog Set) 标记是利用番茄已有的 EST序列与拟南芥基因组序列信
息开发的一种标记技术 , 使番茄图谱的 COS标记增加到 300个。但是 COS标记与 RFLP等标记一样
存在费用高、步骤复杂、周期长、要求高质量 DNA等缺点 , 在辅助育种中很难推广。因此 , 在分子
育种中一些 RFLP、COS等标记常被转化成简单方便的 SCAR (特征性片段扩增区域 , Sequence charac2
terized amp lified region)、CAPS (酶切扩增多态性序列 , Cleaved amp lified polymorphism sequences) 等
标记。SCAR标记一般是由 RFLP、RAPD、AFLP等标记转换而来 , 其基本原理是根据已获得的标记
片段的序列信息 , 设计 1对特异引物 , 然后通过 PCR来揭示多态性。但是多数 SCAR标记为显性标
记 , 不能有效地区分纯合体与杂合体的基因型。本研究利用 SCAR标记的原理和多引物 PCR技术 ,
建立了一种共显性标记技术 Codom inant2SCAR。
1　材料与方法
111　材料
本研究应用的番茄材料为 TA517, TA1527, E6203, 以及 TA517的 12个近等基因系 ( 02P68、
02P69、02P70、02P71、02P72、02P73、02P74、02P75、02P76、02P77、02P78、02P79 )。 TA517是
以普通番茄 (L ycopersicon escu len tum E6203) 为遗传背景 , 含有来自多毛番茄 (L. h irsu tum LA1777)
第 4染色体底部 50 cM长的一段片段〔2〕, TA1527是 TA517的 1个亚近等基因系 , 含有的野生多毛番
　6期 国艳梅等 : Codom inant2SCAR技术的建立以及在番茄育种中的应用 　
茄第 4染色体的 DNA片段比 TA517短 , 长约为 20 cM〔2〕。
112　D NA的提取
所有试材播种于温室 , 待幼苗长到 6～8片真叶时 , 提取细嫩叶片中的 DNA进行分析。DNA提
取参照 W illiam son等〔3〕的 CTAB小量提取方法 , DNA贮存于 - 20℃的冰箱中备用。
113　引物设计
以 COS标记 T0974为研究对象 , 先将其转化成为 CAPS标记 , 并得到了亲本材料 TA1527和
E6203的 CAPS标记的 PCR产物。将 PCR产物送三博远志公司测序 , 测序结果分别命名为 T097422F
和 T097423R。
对 T097422F和 T097423R序列用 DNAMAN进行同源比较 , 再用 Primer Prem ier 510对 T097422F和
T097423R序列进行设计 , 分别获得与 TA1527和 E6203基因型一致的显性 SCAR 引物 , 并命名为
SCAR2A和 SCAR2B (表 1)。引物设计的最显著特点是 SCAR2A和 SCAR2B的上游引物分别处于其特
异的 DNA序列内 , 每个引物只能与相应的同源序列配对 , 而下游引物则是同一个引物。SCAR2A和
SCAR2B分别与下游引物配对扩增得到分子量不同的 PCR产物。
表 1　引物名称及序列
Table 1　Pr im ers and sequences
引物 Primers 上游引物序列 Up stream p rimer sequences 下游引物序列 Downstream p rimer sequences
COS 5piCGCCTTTCACAGAAAACCAT3pi 5piACTTGCAAAATCAAGGGTCG3pi
SCAR2A 5piGTTCTCTCCGCCGTCGTTCG3pi 5piACTTGCAAAATCAAGGGTCG3pi
SCAR2B 5piTCAGACCCATATGAAGTTGTCA3pi 5piACTTGCAAAATCAAGGGTCG3pi
SCAR2A和 SCAR2B的 PCR反应体系相同 , 均为 50 ng模板、215μL 10 ×PCR buffer、110μL
Mg2 + (25 mmol·L - 1 )、1125 U TaqDNA聚合酶、015μL T097422F2138 ( 10 mmol·L - 1 ) 或 T09742
3R2115 (10 mmol·L - 1 )、015μL T0974R (10 mmol·L - 1 )、215μL dNTPs (10 mmol·L - 1 ) , 加超纯
水至 25μL。
SCAR2A + SCAR2B优化的 PCR反应体系 : 引物比例分别为上游引物 SCAR2A (10 mmol·L - 1 )
015μL、上游引物 SCAR2B (10 mmol·L - 1 ) 110μL及其共有的下游引物 (10 mmol·L - 1 ) 015μL,
其余成分相同。
SCAR2A、SCAR2B及 SCAR2A + SCAR2B的 PCR扩增的程序相同 : 92℃ 3 m in, 40个扩增循环 :
92℃ 1 m in, 64℃ 1 m in, 72℃ 2 m in, 最后 72℃ 8 m in, 保存温度 4℃。
2　结果与分析
图 1为利用 CAPS引物、SCAR2A和 SCAR2B引物对番茄材料 TA1527与 E6203的 PCR扩增结果 ,
以及利用引物 SCAR2A + SCAR2B对其 F1 的扩增结果。结果表明 : CAPS引物扩增的 PCR产物相同 ,
约为 370 bp, E6203与 TA1527都有此谱带 ; 根据 E6203的序列设计的特异引物 SCAR2B经扩增后仅
在 E6203中获得 270 bp的 PCR产物 , 而 TA1527没有该特异谱带 , 表明该谱带为与 E6203基因型一
致的显性 SCAR标记 ; 根据 TA1527的序列设计的特异引物 SCAR2A经扩增后仅在 TA1527中获得 200
bp的 PCR产物 , 而 E6203没有该特异谱带 , 表明该谱带为与 TA1527基因型一致的显性 SCAR标记 ;
同时加入 SCAR2A和 SCAR2B对 F1的 PCR扩增结果分别获得了与 E6203和 TA1527基因型一致的谱
带 , 两谱带的多态性正是两个引物多态性的叠加 , 分子量为 270 bp和 200 bp, 表明获得了可同时区
分亲本 TA1527、E6203及其杂交一代的共显性 SCAR标记。
上述结果表明 , 在将 RFLP、COS或 AFLP等多态性有无的标记转化为 SCAR标记的过程中 , 如
果同时知道父母本 (双亲 ) 的序列 , 可针对双亲的 DNA序列信息设计特异引物 , 将其转化成与父本
或与母本基因型一致的显性 SCAR标记。本研究在获得与父本、母本基因型一致的显性 SCAR标记的
基础上 , 同时将父母本的特异引物加入到同一 PCR反应体系中 , 得到了能同时鉴定父本、母本及其
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杂合体的基因型的特异谱带。这样 , 本研究结合了 SCAR标记和多引物 PCR技术原理建立了能同时
检测父本、母本及其杂合体基因型的共显性标记方法 , 并将其命名为 Codom inant2SCAR技术。
图 1　不同引物对番茄 TA1527、E6203及其 F1 的 PCR扩增结果
M: 标准分子量 ; 1, 3, 5: 番茄 TA1527; 2, 4, 6: 番茄 E6203; 1, 2: 未酶切的 CAPS; 3, 4: SCAR2B +下游引物的 PCR产物 ;
5, 6: SCAR2A +下游引物的 PCR产物 ; F1 : SCAR2A + SCAR2B +下游引物对 F1 的扩增结果。
F ig. 1　The result of PCR am plif ied w ith d ifferen t pr im ers
M: 100 bp ladder; 1, 3, 5: tomato TA1527; 2, 4, 6: tomato E6203; 1, 2: noncleaved CAPS; 3, 4: amp lified with SCAR2B +
downstream p rimer; 5, 6: amp lified with SCAR2A + downstream p rimer; F1 : amp lified with SCAR2A + SCAR2B + downstream p rimer.
02P68～02P79是 TA517的 12个近等基因系。作者此前已经利用原始 COS标记 T0974对这 12个
近等基因系进行了遗传分析 , 根据结果已知 02P68、02P69、02P71、02P72和 02P75表现出与 TA517
一致的谱带类型 , 其余近等基因系与 E6203表现一致〔4〕。本试验中进而将 COS标记 T0974转化为
CAPS标记后对 TA517的 12个近等基因系进行遗传鉴定也得到同样的结果。
图 2为利用 Codom inant2SCAR技术对 TA517的 12个近等基因系的遗传鉴定结果。结果表明 ,
TA517、02P68、02P69、02P71、 02P72 及 02P75 的多态性表现一致 , 得到 1 条 200 bp 的谱带 ,
E6203、02P70、02P73、02P74、02P76、02P77、02P78及 02P79多态性表现一致 , 得到 1条 270 bp
的谱带 , 与上述已知的结果一致。
图 2　利用共显性标记技术 Codom inan t2SCAR对 TA517的 11个近等基因系的遗传鉴定
M: 100 bp标准分子量 ; 02P68～02P79: 分别为 TA517的 12个近等基因系。
F ig. 2　The genetic polym oph ism of 11 sub2N IL s using Codom inan t2SCAR
M: 100 bp marker; 02P68 - 02P79: 12 N IL s of TA517.
3　小结
Codom inant2SCAR技术综合了 SCAR标记技术与多引物 PCR技术的优点 , 根据已知的序列信息
扩增不同长度的 PCR产物 , 获得了共显性标记。该标记是一种十分稳定的分子标记 , 在应用上具
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有迅速、简便、低成本的特点 , 适合于样品的大量分析 , 对于构建遗传图谱具优越性。由于共
显性标记提供的信息量多 , 对于鉴定杂交种子的纯度 , 以及为新品种审定、保护品种知识产权
等方面也提供了方法和技术借鉴。因此 , 该技术对于提高番茄分子标记辅助育种的效率具有很
重要的意义。对于番茄、水稻、玉米、拟南芥等序列信息丰富的植物 , RFLP、RA PD、A FLP、
CO S等标记和已克隆的基因都可能根据其双亲的序列信息设计特异引物 , 将其转换成共显性的
SCAR标记。
参考文献 :
1　Tanksley S D, GanalM W , Prince J P, de V icente M C, Bonierbale M W , B roun P, Fulton TM, Giovannoni J J, Grandillo S, Martin G
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linkage map s of tomato and potato genomes. Genetics, 1992, 132: 1141～1160
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to. Theor. App l. Genet. , 1994, 87: 757～763
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W ang X X. The fine mapp ing of genes increasing fruit color and differential exp ression of genes related to fruit color in tomato: 〔Ph. D. D is2
sertation〕. Beijing: the Chinese Academy of Agricultural Sciences, 2004. 26～30 ( in Chinese);　 第五届小菜蛾及其他十字花科蔬菜害虫治理国际研讨会
将在北京召开
由中国农业科学院蔬菜花卉研究所、中国园艺学会和美国康乃尔大学共同主办的第五届小菜蛾及其他十字花科蔬
菜害虫治理国际研讨会将于 2006年 10月 24～27日在北京召开。
会议内容 : 十字花科蔬菜害虫的行为学、生物学和生态学 , 十字花科作物系统中害虫与植物之间的互作关系 , 十
字花科蔬菜害虫的生物防治 , 植物抗性及生境调控 , 杀虫剂及杀虫剂抗性 , IPM研究及其应用。
会议承办单位 : 中国农业科学院蔬菜花卉研究所 , 中国园艺学会。
　　会议主席 : 中国农业科学院蔬菜花卉研究所所长杜永
臣博士、中国园艺学会理事长方智远院士、美国康乃尔大
学托尼 ·谢尔顿 (Anthony M. SHELTON) 教授。
组织委员会主席 : 中国农业科学院蔬菜花卉研究所所
长杜永臣博士、中国园艺学会理事长方智远院士。
学术委员会主席 : 美国康乃尔大学昆虫系托尼 ·谢尔
顿 (AnthonyM. SHELTON ) 教授 , 中国农业科学院蔬菜
花卉研究所张友军研究员 , 浙江大学应用昆虫研究所刘树
生教授 , 美国康乃尔大学昆虫系赵建周研究员。
会议语言 : 英语。地点 : 北京友谊宾馆。网站 :
http: / /www1ciccst1org1cn / IWMDMOCP。论文摘要提交截
止日期 : 2006年 5月 31日。
国外代表注册费 (美元 )
分　类 2006年 5月 31日前注册 2006年 5月 31日后注册
正式代表 400 450
学生 250 300
正式代表参加一天 150 150
学生参加一天 110 110
陪同人员 100 100
国内代表注册费 (人民币 )
分　类 2006年 5月 31日前注册 2006年 5月 31日后注册
正式代表 1 200 1 500
学生 800 1 000
陪同人员 700 800
会议秘书处 :
联系人 : 刘广树 　　　　　　　　　　　　　　　　　单位 : 中国农业科学院蔬菜花卉研究所
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