全 文 ：园 　艺 　学 　报 　2005, 32 (2) : 314～317
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2004 - 05 - 08; 修回日期 : 2004 - 07 - 05
基金项目 : 国家自然科学基金资助项目 (30100123) ; 江苏省自然科学基金项目 (创新人才 DK2002403)3 通讯作者 Author for correspondence
高温胁迫对黄瓜花药中 Ca2 + 分布、ABA含量及蛋
白质合成的影响
张玉华 1 　朱月林 2 　缪 珉 13
(1 扬州大学农学院园艺系 , 扬州 225009; 2 南京农业大学园艺学院 , 南京 210095)
摘 　要 : 经 45℃处理 1 h后黄瓜热敏品系新泰密刺单核花粉期花药胞内 Ca2 +水平上升较耐热品系 JY24
快 , 但在温度恢复 28℃后其钙稳态恢复较慢 ; 45℃处理 1 h后新泰密刺花药内源 ABA含量上升幅度比 JY24
大 , 恢复 28℃后下降速度也较快 ; 高温处理未能造成此期黄瓜花药新蛋白质的合成 , 但蛋白 (MW 70 kD,
p I 517和 MW 4515 kD, p I 516) 的表达热激后大幅度上调 , 且在 JY24中的表达水平显著高于新泰密刺。上
述结果表明 , Ca2 +和 ABA均参与了黄瓜花药对高温胁迫的反应调节 ; 黄瓜单核花粉期花药中热激蛋白的合
成至少已被部分抑制。
关键词 : 黄瓜 ; 高温 ; 花药 ; 钙 ; ABA; 蛋白质双向电泳
中图分类号 : S 64212　　文献标识码 : A　　文章编号 : 05132353X (2005) 0220314204
Effect of Hea t Stress on Ca lc ium D istr ibution, ABA Con ten ts and the
Syn thesis of Prote in s in Cucum ber An thers
Zhang Yuhua1 , Zhu Yuelin2 , and M iao M inm in13
(1D epartm ent of Horticu lture, College of A griculture, Yangzhou U niversity, Yangzhou 225009; 2 College of Horticu lture, N anjing
A griculture U niversity, N anjing 210095)
Abstract: Under 45℃ treatment, Ca2 + p recip itates in pollen and anther cells increase more quickly in
cucumber ( Cucum is sa tivus L. ) heat2sensitive line Xintaim ici than in heat2tolerant line JY24. W hile the
temperature recover to 28℃, the Ca2 + p recip itates quantity drop to the normal level more tardily in Xitaim ici
anther cells. Endogenous ABA contents in two line anthers also ascend significantly after 1 h 45℃ treatment,
especially in Xintaim ici. W hen the temperature return to 28℃, ABA in Xitaim ici anthers step down to the
control level, while JY24 anthers can maintain a higher ABA content within 2 h. No any additional p rotein
points can be seen in the IEF2SDS2PAGE map s of cucumber anthers under 45℃ stress comparing with 28℃,
although the exp ression of some p roteins, such as (MW 70 kD, P I 517) and (MW 4515 kD , P I 516) were
up regulated remarkably after heat treatment ( even higher in JY24 than in Xintaim ici). The results indicated
both Ca2 + and ABA signals were involved in the response of cucumber anthers to heat2stress. The synthesis of
HSPs in cucumber uninucleate2binucleate2pollen2phase anthers were at least in part inhibited under 45℃.
Key words: Cucumber; H igh temperature; Anther; Ca2 + ; ABA; 2D PAGE
1　目的、材料与方法
高温下授粉受精不良是夏季黄瓜减产降质的重要原因。据本课题组初步研究 , 黄瓜花粉发育在单
核期对高温最为敏感〔1〕。本试验选取对高温敏感度不同的黄瓜基因型 , 研究该时期黄瓜花药中 Ca2 +
分布、ABA含量及蛋白质合成的情况 , 以期寻找该时期对高温最为敏感的生理原因 , 为进一步深入
研究黄瓜花粉发育在高温胁迫下的信号传递及基因表达变化提供线索。
　2期 张玉华等 : 高温胁迫对黄瓜花药中 Ca2 +分布、ABA含量及蛋白质合成的影响 　
供试黄瓜 (Cucum is sa tivus L. ) 为耐热品系 ‘JY24’和不耐热品种 ‘新泰密刺 ’, 于 2003年 3
月、8月两次播在 21 cm ×21 cm的营养钵内 , 常规栽培管理。根据黄瓜雄花的大小判断其花粉的发
育状态〔1〕。当温室中大量植株的雄花花粉发育到单核花粉期时 , 将植株在晴天日中午 12时移入人工
气候室进行 45℃高温处理 , 处理 4 h后恢复 28℃常温 , 以一直处于 28℃为对照。高温处理与对照分
别选择一部分雄花挂牌标记 , 任其继续生长至开花 , 用于统计 28℃下培养 4 h后的花粉萌发率 (培养
基成分 : 硼酸 80 mg·kg- 1 +蔗糖 100 g·kg- 1 )。其余雄花在处理开始后 0、1、2、3、4 h以及恢复
常温后 1、2 h剥取花药 , 一部分用于超薄切片电镜观察 , 另一部分迅速投入液氮冷冻后再转入
- 35℃保存 , 用于检测 ABA和蛋白质。花药中 Ca2 +分布的电镜观察采用焦锑酸钾沉淀技术〔2〕。参照
吴颂如等的方法〔3〕测定 ABA含量。蛋白质提取和电泳参照 OpiFarrell的方法〔4〕。
2　结果分析与讨论
211　花粉萌发率
由表 1可知 , 常温下新泰密刺与 JY24的花粉
萌发率无显著差异 , 经高温处理后两品系萌发率
都明显下降 , 但是 JY24显著高于新泰密刺 , 这表
明 JY24花药发育的耐热性高于新泰密刺。
212　花药中 Ca2 +分布的电镜观察
常温下处于单核花粉期的 JY24和新泰密刺花
粉粒中的 Ca2 +主要分布在花粉的外壁及萌发孔口
表 1　高温处理后黄瓜花粉在 28℃下的萌发率
Table 1　Pollen germ ina tion percen tage of cucum ber
a t 28℃ after h igh2tem pera ture trea tm en t
品系
L ines
28℃下花粉萌发率
Pollen germ ination percentage at 28℃ ( % )
28℃处理 Treatment 45℃处理 Treatment
新泰密刺 Xintaim ici 9317 A 3616 B
JY24 9415 A 6013 A
注 : 数字后不同字母表示差异达 0101显著水平。
Note: The different cap itals after data indicate the significance at
0101 level.
区域。中层细胞及药室内壁细胞中的 Ca2 +主要分布在细胞壁及细胞间隙中 , 细胞质及细胞核中均未
见有 Ca2 +分布 (图版 , 1、2)。高温胁迫处理 1 h后 , JY24花粉粒中沿着花粉外壁及中层细胞细胞壁
Ca2 +沉淀颗粒明显增多 , 细胞质及细胞核中未观察到 Ca2 +沉淀物 (图版 , 3)。新泰密刺花粉粒中沿
花粉外壁及中层细胞细胞壁 Ca2 +沉淀颗粒大量增加 , 营养细胞开始液泡化 , 在分离层及营养细胞的
细胞壁上分布有许多 Ca2 +沉淀物 (图版 , 4)。高温胁迫处理 4 h后 , JY24花粉粒的细胞核中出现较
图 1　高温胁迫对黄瓜单核花粉期花药内源 ABA含量的影响
每个数据均为 3次测定的平均值。
F ig. 1　Effect of hea t2stress on endogenous ABA con ten ts
in un inuclea te pollen stage an thers of cucum ber
Each point is the average of 3 measurement.
多的 Ca2 +沉淀颗粒 , (图版 , 5) , 新泰密刺花粉的细胞质及细胞核中 Ca2 +沉淀颗粒较多 , 药室内壁
细胞及中层细胞中的 Ca2 +沉淀颗粒较密集 , 主要分布在细胞内壁及细胞质中 (图版 , 6)。高温处理
恢复 2 h后 , JY24的花粉细胞中 Ca2 +沉淀物大幅度减少 , 但仍多于对照 , 主要分布在花粉的细胞核
中 (图版 , 7)。新泰密刺的花粉粒细胞核内仍有一些 Ca2 +沉淀颗粒 , 绒毡层及药室内壁细胞中 Ca2 +
沉淀物较多 (图版 , 8)。大量研究表明 , 在热胁迫过程中 , 植物细胞内的 Ca2 +浓度会显著升高 , 与
其结合蛋白相互作用 , 启动一系列的胞内生理生化
过程并最终导致基因表达的变化。但长时间的胞内
高钙浓度会对细胞的正常生理功能造成损害 , 当胞
内高钙浓度传达热激信号的任务已经实现后 , 及时
恢复胞内 Ca2 +至正常水平对植物较长时间地忍受逆
境胁迫是必须的。本试验结果表明 , 热敏品种新泰
密刺高温胁迫后 Ca2 +水平的升高较 JY24快 , 在温
度恢复后其钙稳态的恢复较慢 , 进一步证实了上述
观点。
213　花药中脱落酸 ( ABA) 的含量
如图 1所示 , 常温下新泰密刺和 JY24花药中
ABA含量的变化不大。高温胁迫后 , 两品系花药
ABA含量在 1 h时即显著上升 , 3～4 h后新泰密刺
513
园 　　艺 　　学 　　报 32卷
显著高于 JY24; 恢复常温后 , 新泰密刺花药 ABA含量逐步下降至与常温相似的水平 , 而 JY24仍能维
持较高水平。一些试验表明 , 高温胁迫能诱导植物内源 ABA水平的增加。本试验中高温胁迫后黄瓜
两品系花药中内源 ABA含量显著高于常温对照 , 表明 ABA信号系统确实参与了黄瓜花药对高温胁迫
的反应调节。其中新泰密刺花药内源 ABA含量增加的幅度比 JY24大 , 且恢复常温后下降速度也较
快 , 表现得对高温更为敏感。
214　花药中蛋白质的双向电泳图谱
图 2表明 , 大部分蛋白质的表达受温度影响很小或不受影响 , 这些蛋白质可能是维持基本代
谢的 “看家基因 ”的产物。45℃下 2h后 JY24花药蛋白质 (图 2, B ) 表达量明显高于对照 (图 2,
A ) , 其中蛋白点 5 〔MW 7010 kD , p I 517 ( p I表示等电点 , 下同 ) 〕、6 (MW 4515 kD , p I 516 )
的表达量增加最多。蛋白点 7 (MW 6810 kD , p I 516)、8 (MW 5710 kD , p I 514)、4 (MW 5710
kD , p I 610) 的增加量其次。而新泰密刺花药 45℃下 (图 2, D ) 只有少量蛋白质点 , 如 1 (MW
4515 kD , p I 513)、2 (MW 3910 kD , p I 516)、3 (MW 3110 kD , p I 515) 的表达量有所增加。高
温处理后 JY24的蛋白表达点和量均比新泰密刺多 , 如其中蛋白点 9 (MW 92 kD , p I 510) 和蛋白
点 10 (MW 53 kD , p I 510) 在新泰密刺中并未表达 , 而蛋白点 4、蛋白点 5及蛋白点 6的表达量
均明显高于新泰密刺。
图 2　JY 24 ( A, B)、新泰密刺 ( C, D ) 单核花粉期花药可溶性蛋白双向电泳图
F ig. 2　2D PAGE pa ttern s of JY 24 ( A, B) and X in ta im ic i ( C, D ) un inuclea te pollen stage an ther prote in s
A, C: 28℃　　B, D: 45℃ 2 h
Magnard等研究表明玉米 ( Zea m ays L. ) 小孢子在单核花粉期之后合成 HSPs能力逐步丧失 , 并
被认为是玉米成熟花粉对高温敏感的重要原因。根据本文结果 , 黄瓜单核期花药经高温胁迫后在双向
电泳图谱中鲜有新蛋白质点产生 , 这表明此阶段黄瓜花药中 HSPs的合成至少已被部分抑制 , 这一结
果可部分解释黄瓜花药发育为何在此期对高温最为敏感〔1〕。有研究表明 , 植物受到高温胁迫后 , 一
些钙信号系统相关蛋白的表达会上调 , 并被认为与植物耐热性的获得有关。在本试验中 , 黄瓜花药经
高温处理后一些蛋白质的表达量有所增加 , 且耐热品系 JY24花药中一些蛋白质点的表达量显著高于
热敏品种新泰密刺 (图 2) , 这些蛋白质点的分离纯化和归属鉴定将是本课题组下一阶段的研究任务。
参考文献 :
1　缪 珉 , 李式军. 黄瓜雄花与雌花发育过程中高温敏感期的初步研究. 南京农业大学学报 , 2001, 24 (1) : 120～122
M iao M M, L i S J. A Primary study of the sensitive stage to high temperature in the development of male and female flower of cucumber. Jour2
nal of Nanjing Agriculture University, 2001, 24 (1) : 120～122 ( in Chinese)
2　Slocum R D, Roux S J. An imp roved method for the subcellular localization of calcium using a modification of the antimonite p recip itation tech2
nique. The Journal of H istochem istry and Cytochem istry, 1982, 30 (7) : 617～629
3　吴颂如 , 陈婉芬 , 周　燮. 酶联免疫测定植物内源激素. 植物生理学通讯 , 1998, (5) : 53～57
W u S R, Chen W F, Zhou X. Enzyme2linked immunosorbent assay for endogenous p lant hormones. Communication of Plant Physiology,
613
　2期 张玉华等 : 高温胁迫对黄瓜花药中 Ca2 +分布、ABA含量及蛋白质合成的影响 　
1988, (5) : 53～57 ( in Chinese)
4　OpiFarrel P H. H igh2resolution two2dinesional electrophoresis of p rotein. Journal of B iology Chem istry, 1975, 250: 4007～4021
图版说明 : 1, 2. 常温下 JY24花粉、新泰密刺药壁中 Ca2 +的分布 ; 3, 4. 高温胁迫 1 h, JY24药壁、新泰密刺花粉中 Ca2 +的分布 ; 5,
6. 高温胁迫 4 h, JY24、新泰密刺药壁中 Ca2 +的分布 ; 7, 8. 高温胁迫恢复 2 h, JY24花粉、新泰密刺药壁中 Ca2 +的分布 ; 9. 对照 ,
切片经 EGTA处理 , 示螯合 Ca2 +后的空洞。
EN. 药室内壁 ; GA. 萌发孔 ; L. 脂质体 ; M. 中层 ; m. 线粒体 ; N. 细胞核 ; Pla. 周原质团 ; T. 绒毡层 ; V. 液泡 ; VC. 营养细
胞 ; →示 Ca2 +沉淀颗粒。
Explana tion of pla tes: 1, 2. D istribution of calcium p recip itates in normal JY24 pollen and Xintaim ici anther wall; 3, 4. D istribution of calcium
p recip itates in JY24 antherwall and Xintaim ici pollen after 1 h heat2stress; 5, 6. D istribution of calcium p recip itates in JY24 and Xintaim ici anther
wall after 4 h heat2stress; 7, 8. After 2 h end of heat2stress, distribution of calcium p recip itates in JY24 pollen and Xintaim ici antherwall; 9. Cal2
cium2free control section incubated in a solution of EGTA.
EN. Endothecium cell; GA. Germ inal aperture; L. L ip id body; M. M iddle layer; m. M itochondrium; N. Nucleus; Pla. Plasmodium; T. Tape2
tum; V. Vacuole; VC. Vegetative cell; A rrows indicate calcium p recip itates.
713