全 文 ：园 艺 学 报 2004，31(4)：529—532
Acta Horticuhurae Sin／ca
ISSR．PCR技术在桂花品种分类研究中的应用
邱英雄 胡绍庆 陈跃磊 陈 晓 吴光洪。
( 浙江大学生命科学学院，杭州 310029； 杭州植物园，杭州 310013； 杭州桂花品种技术开发有限公司，杭州
310010)
摘 要：利用 ISSR．PCR方法对桂花的 19个品种进行了基因组多态性分析，从 74个 ISSR引物中筛选
出13个多态性引物用于正式扩增，共扩增出9o条DNA片段，其中多态性 DNA条带79条，占总扩增片段
的87．8％，平均每个引物扩增的DNA带的数目为6．92条。根据 ISSR扩增结果，应用RAPDistance软件进
行Nei相似性系数和遗传距离计算，利用 UPGMA法构建聚类树状图。聚类分析的结果把供试桂花的 l9个
品种分为8个大类，并对4个品种群的遗传关系和种下分类系统进行了探讨。
关键词：桂花；品种；ISSR；遗传关系
中图分类号：S 68 文献标识码：A 文章编号：0513．353X (2004)04-0529-04
Studies on Cultivar Classifcation of Osmanthus fragrans by ISSR·PCR Analysis
Qiu Yingxiong ，Hu Shaoqing ，Chen Yuelei ，Chen Xiao ，and Wu Guanghong
( College ofLife Sciences，Zhejiang University，Hangzhou 310029，China； Hangzhou Botanical Garden，Hangzhou 310013
China； Hangzhou Sweet Olive Technology Development Co．，Ltd，Hangzhou 310010，China)
Abstract：In this study，inter．simple sequence repeat(ISSR)was evaluated for its potential use in the
identifcation of 1 9 Osmanthus fragran,s cuhivars．1 3 out of 74(1 8．6％)ISSR primers could generate repro．
ducible polymorphic fragments．The ISSR．PCR assay revealed a total number of 90 DNA bands．of which 79
bands were polymorphic(the percentage of polymorphic bands，PPB=87．8％)．Optimized ISSR primers
amplified 4 to 1 0 bands ranging in size from 300 bp to 2000 bp，with an overall average of 6．92 amplified
bands per primer．RAPDistance software was used to calculate the Nei’S genetic distance and a dendrogram
was constructed based on UPGMA cluster analysis．These 1 9 Osmanthus fragrans cuhivars surveyed were clas．
sifted into eight major groups，and each cuhivar in this study could be distinguished from others．The genetic
relationship of four cuhivars group and classifcation of Osmanthus fragrans were also discussed．
Key words：Osmanthus fragrans；Cuhivars；ISSR；Genetic relationship
1 目的、材料与方法
桂花 (Osmanthusfragrans I_~ur．)原产我国。我国学者把桂花划分为4个品种群：即金桂 (Thun．
bergi)、银桂 (Odoratus)、丹桂 (Aurantiacus)和四季桂 (Semperflorens)¨ ]。本研究利用 ISSR分
析技术对桂花4个品种群的19个基本品种 (表 1)进行研究，以期为桂花种质资源鉴定和品种 (群)
间亲缘关系研究提供分子水平的证据。
19个品种取自杭州植物园和杭州满陇桂雨。采集幼嫩叶片，用硅胶充分干燥。取 0．1 g用 Fast．
prep(Biol01，USA)粉碎，采用改良CTAB法 提取总DNA，1．0％琼脂糖电泳检测 DNA质量，根
据紫外吸收法估计DNA的浓度和纯度。ISSR反应条件经过比较和优化确定为：25 L的PCR反应液
组分和终浓度分别为约 60 ng模板 DNA，1．2 U Taq酶，1．5 mmol·L～MgC1，．0．25 mmol·L
收稿 日期：2003—09—11；修回日期：2004—02—23
基金项目：国家重点基础研究发展规划项目 (G2000046806)
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dNTPs，0．3 ino1．L 引物，2％甲酰胺。PCR扩增条件：94~C预变性 5 min，然后进行45个循环：
94~C变性 1 min，52~C～52~C复性45 s，72~C延伸2 min；循环结束后72~C延伸5 min。PCR产物在含
有 EB的1．5％琼脂糖凝胶中电泳，以100 bp Marker(GeneRulerlO0 ladder，Fermentas UAB，Inc．)
作为标准分子量对照，EPSON (Japan)紫外自动成像仪照相。扩增位点的命名由所用引物和条带分
子量来确定。电泳图谱的每条带 (DNA片段)均为一个分子标记 (Marker)，代表一个引物的结合位
点。根据各分子标记的迁移率及其有无统计所有的二元数据；有带 (显性)记作 1，无带 (隐性)
记为0，强带和弱带均赋值为1。对于多态位点，仅在重复试验中能稳定出现的差异带用于数据分析。
根据这个二元数据计算多态性位点百分数，采用RAPDistance软件计算品种间的Nei遗传距离，利用
NTSYSpc一1．80版软件的UPGMA分析品种间的遗传关系。
表1 供试的桂花品种
Table 1 Plant materials used for ISSR analysis in this study
2 结果与分析
2．1 引物筛选和 ISSR多态性分析
ISSR引物由上海生工公司合成。从 74个引
物中筛选出13个扩增条带较多、信号强、背景清
晰的引物用于 ISSR—PCR反应 (表 2)，变性温度
根据引物的Tm值变化 1～3 oC。表2结果表明，
所选用的13个引物对 19桂花品种进行正式扩增。
共计扩增出90条 DNA条带，其中多态性 DNA条
带79条，占87．8％。每个引物扩增的条带数
4—10，平均6．92条。扩增出的DNA条带大小在
300～2000 bp之间。引物 UBC814扩增的 ISSR产
物图谱如图 1。ISSR检测到较高的多态性条带比
率，说明了桂花品种间的遗传变异较大。但 13个
ISSR引物在 19个桂花品种中未检测到品种的特
异性条带。因此，目前 ISSR还不能实际用于桂花
品种的鉴定。我们正在对核基因组变异速率较快
的ITS基因片段进行测序，以期获得品种特异性
变异位点，用于实际生产中的桂花品种资源鉴
定。
表2 ISSR引物序列和特异性条带数
Table 2 List of 13 ISSR primers and polymorphic bands
obtained in the study
注：Y=C／G，R=A／G，D=A／G／T，V=A／C／G，H=A／C／T
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4期 丘fj煎雄等：l R—PCR托术 挂花一I "，煎 }究巾∞啦用
图l 用UBCSI4对 l9个桂花品种进子彳ISbiR-PCR扩增的带谱
～- 种f 鹋，Ⅵ丧小 ¨A 措{ 世
Fig-I ISSR—PCR profiles ol"19 Osmanthus frag~ns cultivars u UB(~14 primer
N¨ sll(I tl,r eulli ar lIle hsl {⋯ hle I M in,I1． J￡P 1) ^⋯d l-r
2．2 桂花品种间的ISSR聚类分析
l9个品种闯的遗传距离在O I67～0．423之
间，其中 银挂 (YD1]种白沾 l"／05j墙传距
离最近 (0．167)，而晚银杜 。i其他品种群的平均
遗传距离最远 【O 342) 从图2中可以行出，J9
个品种住 I．=0．257处口r分为8类 第一类包禽
银桂品种群的3个品种 (YO1 、05、Y041：第
二类包括金桂。 种群 2个品种 f．J03、J061和朱
砂丹桂 (DOI)；第三类含四季佳品科，群2个品种
(s0】、c-O2)和银挂品种群的苏州早黄 (Y02 J：
第四类 含锻桂 、金桂、J斗桂． 种群各 1个品种
("／03、J02和DO3)；第五粪包括丹桂品种群的2
个品种 (1)O2、DO4)和金佳 品种群 l ． 种
(JO1)；第六粪禽金桂 品种群 2个品种 (J04、
J05)；第 L类仪包括丹拄 (D05)；第八樊为晚银
梏 (Y06)
Nelj＆幢目I高 Nei’ genetic dislanc~
圈2 桂花19十品种的 [SSR聚类分析树状囤
Fig·2 I)endrogram for 19 Osmanth~f~gramcultiwrs
hy duster aⅡn s c UMGMA】ha．seal on l R markers
由此可见，除四季桂品种群的2 1、品种 (S01、S02)外，其他3个品种群的 -．种郝，寸散刊不同
的类巾一其中．秋季开花色质较涿的金桂品种群和月桂品利 群的多 品科·往在聚在一起 ida；]它们在
DNA水平的遗传分化程度较低，这两个品种群的某些I 种 叮能肯较近的亲缘关系 四李 品种群
的2个品种与银桂品种群的苏 I¨早黄亲缘关系较近 秋季开花色质为乳白色的银桂品科l1怍的品种常多
个或单个独立聚为几类 银桂品种群的多个ruⅡ种不仅与其他花色的品种在DNA水平出现 r较大程岌
的舒化．而且镪桂 种群内的多1、品种之问的遗传变异程度也较高，因此银桂花色性状的人 选育时
很可能较早 lssR象类分析的结果可 看出 花邑只是人为舒类昕依据的特征
． 并 能匪映
种群间的亲缘关系，4个晶种群井不是自然的分类群．只是人为分类的品种群
， 但具有一定的实用
性 色质较深的金挂某些品种和坩桂某些品种阃存在很近的亲缘．荧系，也表明了朱K山等根据色质埘
品种进行划分具有一定的合理性 ‘ 陈建业等人根姑同功酶分析结果，认为银桂类币¨四季桂类的品
种l百I有鞍近的亲缘关系，并将二暂台J ：称 “银挂品种群”，下没银桂型和四季桂型 本试验结果仅
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表明四季桂的2个品种与银桂品种群的苏州早黄亲缘关系较近，而与银桂品种群的其他品种的遗传关
系较远，因此本研究不支持将两个品种群进行合并。根据试验结果，我们也认为Green等将金桂、银
桂、丹桂和四季桂定为变种或变型 均不妥。
参考文献：
1 朱长山，李瑞符，袁建都 ，等．河南桂花品种的分类研究．河南农业大学学报，1992，26(2)：194～201
2 刘玉莲．桂花品种分类及木犀属种质资源的利用．植物资源与环境，1993，2(2)：44～48
3 Doyle J J．DNA protocols for plants-CTAB total DNA isolation．In：Hewit G M，Johnston A．Molecular techniques in taxonomy．Springer—Ver-
lag，Berlin，Germany，1991．283～293
4 陈建业，宁玉霞，赵翠花，等．河南桂花品种过氧化物酶同功酶研究．园艺学报，1995，22(2)：176～180
5 Green P S．A monographic revision of Osmanthus in Asia and America．Notes Roy．Bot．Gard．Edinb．，1958．22(5)：435—542
间歇浸没式生物反应器在辰星草培养苗扩繁中的应用
廉美兰 朴炫春 王 颖 赵长新 金 花 (延边大学农学院园艺系，龙井133400)
Application of Ebb and Flood Bioreactor System in Multiplication of Statice
Lian Meilan，Piao Xuanchun，Wang Ying，Zhao Changxin，and Jin Hua
(Department of Horticulture，Agricultural Colege of Yanbian University，Longfing 1 33400，China)
关键词：辰星草；间歇浸没式反应器；组织培养
中图分类号：S 68 文献标识码：A 文章编号：0513-353X (2004)04-0532-01
以茎尖培养得到的辰星草 (Limonium hybrid‘Misty Blue’)培养苗 (带2叶片)为试材。培养基为 MS+BA 1．0
mg／L+蔗糖 30 g／L，pH调节为5．8。固体培养和振荡培养使用250 mL三角瓶，每瓶 100 mL培养基 生物反应器培
养使用5 L气球型反应器，2 L培养基。完全浸没式生物反应器培养时，无 “载桥”，培养苗在培养基中始终处于浸泡
状态；间歇浸没式生物反应器培养时，离反应器底部 15 cm处架有 “载桥”，培养基定时与 “载桥”上的苗接触，每
天4次 (每隔5 h供给1 h)、8次 (每隔2 h供给1 h)和l2次 (每隔1 h供给1 h)。生物反应器培养的空气注入量均
为0．1 vvm(air volume／culture volume／min)。温度 (24±2)℃、光照 1600 Ix，16 h／d，培养4周。每个处理重复3次。
试验结果表明，间歇浸没式生物反应器培养过程中，培养苗在培养基供给次数适宜时，分化大量的丛生苗，生长
旺盛，丛生苗叶色深绿。相比之下，同样是利用液态培养基培养的振荡培养和完全浸没式反应器培养的苗几乎不生
长，叶片黑绿，组织发脆，失去使用价值，且其生长及分化不及传统的固体培养。间歇浸没式反应器培养中，每天供
给培养基8次有利于培养苗生长和分化，其鲜样和干样质量明显优于每天供给培养基4次和 12次的处理，且分化的
丛生苗数最多 (表1)。间歇浸没式反应器培养和固体培养的苗干物率较其它两种完全浸没培养法高。生物反应器培
养中，培养苗在培养基中的浸泡时间非常重要，浸泡时间过短培养苗不能吸收充足的营养，且有失水现象；过长则由
于幼苗久处无氧状态，影响呼吸，同时组织发生膨胀、玻璃化等现象。
表1 不同培养条件下辰星草增殖及生长的比较
Table 1 Comparison of mul卸licatlon and growth of shoot in statice at diferent culture conditions
收稿日期：2004一O2—09；修回日期：2004—05—17
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