全 文 ：© 1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net
园 　艺 　学 　报 　2005, 32 (6) : 1102～1104
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2005 - 03 - 21; 修回日期 : 2005 - 05 - 16
基金项目 : 国家 ‘863’项目 (2002AA212151) ; 四川 ‘十五’科技攻关项目3 通讯作者 Author for correspondence ( E2mail: lip ing@cngk1com)
黄瓜枯萎病新型抑制蛋白 L37的研究
郑爱萍　闫　敏　李　平 3 　谭芙蓉　郑秀丽　李　壮
(四川省农业生物技术工程研究中心 , 成都 611130)
摘 　要 : 从土壤中分离到对黄瓜枯萎病病原菌有抑制作用的枯草芽孢杆菌 (B acillus subtilis) , 发酵产
物经 DEAE - 纤维素、Sephadex G2100柱层析 , 分离到 15 kD抑菌蛋白 L37, SDS2PAGE显示纯度达到电泳
纯 , N -末端氨基酸序列同源性检测结果提示可能是一种新型的抑菌蛋白。蛋白质抑菌结果表明 , 对多种
病原真菌具有抑制效果 , 且对蛋白酶、温度和大部分有机物不敏感 , 是稳定的抑菌蛋白。对病原菌菌丝抑
制机理研究表明 , 抑菌蛋白具有严重扭曲、断裂、阻止生长等抗生效果。应用发酵蛋白产物进行两年大田
防效试验表明 , 对黄瓜枯萎病防效显著 , 最高达到 90% , 具有显著提高产量的作用。
关键词 : 黄瓜 ; 黄瓜枯萎病 ; 枯草芽孢杆菌 ; 抑菌蛋白 ; 防治
中图分类号 : S 64212　　文献标识码 : A　　文章编号 : 05132353X (2005) 0621102203
Research on New An tagon istic Prote in L37 aga in st F usa rium oxysporum
Zheng A ip ing, Yan M in, L i Ping3 , Tan Furong, Zheng Xiuli, and L i Zhuang
(S ichuan Provincial Center for A gri2B iotech Research, Chengdu 611130, China)
Abstract: B acillus subtilis inhibiting cucumberwither pathogen was screened from soil. After fermenting,
15 kD antagonistic p rotein named L37 was got through DEAE2fibrin, Sephadex G2100 chomatography, which
p roved purified comp letely through SDS2PAGE. It was p robably a new type of antagonistic p rotein against
pathogen by the sequence on the am ino N2term inal testing, which could make the normal hypha of pathogen
distort, sp lit and inhibit. The control effect could reach 90% against cucumber wither pathogen and imp roved
the yield in field controlling test by fermenting p roducts.
Key words: Cucumber; Cucumber wither; B acillus subtilis; Antagonistic p rotein; Controlling
1　目的、材料与方法
镰刀菌 ( Fusarium sp. ) 是许多植物的重要病原菌。以该菌引起的黄瓜枯萎病为例 , 一般年份发
病率为 20% , 严重时可达 80% ～90% , 引起严重减产〔1〕。黄瓜枯萎病生物防治始于 20世纪 80年代 ,
已有应用非致病尖孢镰刀菌、Paen ibacillrs sp. 、S treptom yces sp. 、假单胞菌对其进行防治研究的报
道〔2～4〕。本研究对芽孢杆菌产生的镰刀菌抑制蛋白质进行分离、拮抗性检测以及抑制机理的探讨 , 应
用其发酵生物学特性 , 进行黄瓜枯萎病防治。
应用筛选到的 L37拮抗菌株进行发酵和活性蛋白质的提取 , 在发酵滤液中加入 80%饱和硫酸铵
进行蛋白质沉淀 , 并进行透析、浓缩 , 制得粗提蛋白液 , 每处理重复 3次。应用 DEAE - 纤维素柱层
析、Sephadex G2100柱层析对菌株产生的蛋白质进行分步纯化 , SDS2PAGE电泳检测抑菌蛋白的纯度 ,
并进行电泳回收和蛋白质 N -末端氨基酸序列测定〔5〕。以筛选的拮抗菌株 A54、Y11为对照 , 采用平
板打孔法 , 28℃下培养 , 测定各菌株蛋白质的抑菌效果〔6〕, 并检测其对温度、酸碱度、有机溶剂、
蛋白酶的敏感性。采取病原菌丝受抑制的部位 , 置于普通光学显微镜和扫描电镜下观察其致畸的细胞
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　6期 郑爱萍等 : 黄瓜枯萎病新型抑制蛋白 L37的研究 　
学效果〔7〕。根据菌株发酵生物学特性 , 分别进行发酵培养 , 收集上清液 , 稀释 500倍 , 于大田黄瓜植
株开花期开始喷施 , 间隔 7 d再喷施 , 连喷施 3次。统计 1茬、2茬、3茬黄瓜发病率、结实数、结
实率和产量。每个处理 3个小区 (333 m2 /区 )。统计两年试验结果 , 采用 MSTATC软件进行多重比
较分析。
2　结果分析与讨论
211　拮抗蛋白的纯化
21111　DEAE -纤维素柱层析 　粗提蛋白液经 DEAE -纤维素柱层析后出现 3个蛋白峰。第 1个峰值
较小 , 蛋白质的含量较少 , 经过浓缩检测 , 不具拮抗活性。第 2个峰值较高 , 蛋白质含量高 , 但没有
拮抗活性。第 3个峰值较低 , 蛋白质含量不高 , 但具有活性。
21112　Sephadex G2100柱层析 　将经 DEAE -纤维素柱层析中的第 3活性峰的层析液收集、浓缩 , 上
Sephadex G2100层析柱洗脱后出现 3个峰。其中 , 第 1个峰值较低 , 蛋白质含量少 , 不具有拮抗活
性 ; 第 2个峰值较高 , 蛋白质含量高 , 同时具有拮抗活性 , 是拮抗作用的主要蛋白峰 ; 第 3个峰也较
高 , 但不具有活性 (图 1 )。第 2峰经过再次上
样 , 获得比较单一的洗脱峰 , 具有很强抑制活性。
21113　SDS2PAGE和氨基酸测序 　L37菌株的纯
化蛋白质样品经 SDS2PAGE电泳 , 在电泳中呈现
单带 15 kD , 达到电泳纯。经 SDS2PAGE后进行
电转和序列测定 , 结果显示 N - 末端序列为 GI2
PQGND, 经过 NCB I蛋白质 N - 末端数据库的搜
索 , 未发现与之同源的蛋白质 , 提示此蛋白质可
能为一新型 N -末端的抑菌蛋白。
212　功能蛋白活性的测定 图 1　Sephadex G2100洗脱曲线Fig. 1　Washing2down curves of Sephadex G2100 chromatography
　　用硫酸铵沉淀法获得粗蛋白 , 经过初步纯化的蛋白质进行活性检测 , 对指示菌水稻纹枯病病原菌
具有很强的抑制效果。经平板抑菌谱测定 L37菌株产生的蛋白质对黄瓜枯萎病、小麦赤霉病病原菌的
抑制效果最好 , 表明该蛋白质具有比较广的抑菌谱。
213　拮抗蛋白对黄瓜枯萎病病原菌菌丝的致畸效果
试验结果显示 , 用无菌水处理的对照菌丝生长正常、均匀、有分枝 (图 2)。用拮抗蛋白液进行
拮抗的病原菌菌丝生长受到严重抑制 , 停止生长 , 菌丝体严重扭曲 , 有断裂现象 , 中部和端部的细胞
开始明显膨胀呈球形 , 且球状细胞壁皱缩、干瘪 , 这可能是内含物外泄后所致 , 出现空壳现象 (图
2)。由此 , 可以推断此拮抗蛋白主要是通过对菌丝的这些抑制作用而导致其生长停滞直至死亡。
图 2　黄瓜枯萎病病原菌的正常菌丝 ( a, b) 与受抑制的菌丝 ( c, d)
F ig. 2　Norma l hyphae of F usa rium oxysporum ( a, b) and ma lforma tion of hyphae of F usa rium oxysporum ( c, d)
214　拮抗蛋白的理化性质
拮抗蛋白在 pH 6～8时活性最大 , 随着 pH减小 , 拮抗活性下降。在碱性条件下拮抗活性变化不
明显。表明拮抗蛋白对酸敏感 , 对碱不敏感。用蛋白酶 K和胰蛋白酶在正常酶反应条件下 , 以及用
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园 　　艺 　　学 　　报 32卷
常用有机溶剂处理 , 拮抗蛋白仍保持原有的活性。由此表明 , 该蛋白质是一类比较稳定的抑菌蛋白 ,
具有在生产上应用的潜在前景。
215　发酵产物对田间黄瓜枯萎病的防治效果
两年的试验结果表明 , L37发酵液对 3茬黄瓜的结实数没有影响 , 均与对照差异不明显 , 但发病
率均远远低于对照 , 防效最高可达到 90% (表 1) , 2茬、3茬黄瓜的产量均显著高于对照。从防效
特征上可以看出 L37与农用抗生素 ( S226) 的差别 , 抑菌蛋白在 2茬表现为较强的防效 , 3茬防治效
果减弱 , 说明了蛋白质类防治的瞬时性 , 速度比较快 , 但持续性较弱的特点。而抗生素类物质十分稳
定 , 且具有部分累积的特点 , S226在防治特点上表现出逐渐增加的趋势。所以在生产应用中 , 要考
虑不同有效物质的特点来确定喷施次数、喷施浓度 , 才能有效进行黄瓜枯萎病的防治。
表 1　发酵液对黄瓜枯萎病的田间防治
Table 1　Con trolling on cucum ber w ither away from the d isea se of ferm en ta tion products
处理
Treatment
年
Year
1茬 The first stubble
结实数
Number
of fruit
(Num.
/p lant)
结实质
量 Mass
( g)
发病率
Rate of
disease
( % )
防效
Contro2
lling
effect
( % )
2茬 The second stubble
结实数
Number
of fruit
(Num.
/p lant)
结实质
量 Mass
( g)
发病率
Rate of
disease
( % )
防效
Contro2
lling
effect
( % )
3茬 The third stubble
结实数
Number
of fruit
(Num.
/p lant)
结实质
量 Mass
( g)
发病率
Rate of
disease
( % )
防效
Contro2
lling
effect
( % )
L37抑菌肽发酵液 2003 1145a 40 500a 19111a 85120a 0176a 20 500a 9160a 90a 0176a 20 500a 9160a 90100a
Fermentation of L37 2004 1155a 50 029a 17130a 87131a 1150a 24 101a 10100a 8912a 0191a 20 145a 15100a 82150a
S226发酵液 2003 1139a 25 500b 22116b 78100b 1102b 12 000b 32110b 6815b 1124b 7 000b 10130b 90100b
Fermentation of S226 2004 1152a 30 700b 25100b 79140b 1131a 13 048b 21100b 7213b 1105a 14 100b 12110a 87190b
对照 Control 2003 1149a 40 400a 60125c - 0191a 9 000c 87110c - 0177a 9 000c 63140c -
2004 1150a 48 516a 70115c - 1144a 11 915c 85150c - 0187a 10 500c 61145b -
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