全 文 ：园 艺 学 报 2003，30(6)：728～730
Aeta Hortieulmrae Siniea
黄瓜幼叶细胞 中钙调素的免疫胶体金定位
田景花 张 红 李 明 王 梅
(河北农业大学园艺学 院，保定 071001)
摘 要：采用免疫胶体金电镜技术对黄瓜幼叶叶 肉细胞中的钙调 素 (CaM)进行定位 。结果 表明：适
温下生长的黄瓜幼苗叶肉细胞 中的 CaM主要分布于细胞核和叶绿体内，细胞核 中 CaM主要存在于染色质和
核仁上，叶绿体中 CaM主要存在于类囊体膜上；线粒体中也有一定量的 CaM分布；细胞质、液泡、液泡膜
及质膜上只有少量 CaM存在 ；而细胞壁和细胞间隙却很难发现显示 CaM存在的金颗粒。
关键词 ：黄瓜 ；钙调素；免疫胶体金 ；透射电镜技术
中图分类号 ：S 642．2；Q 336 文献标识码 ：A 文章编号 ：0513+353X (2003)06-0728—03
l 目的、材料与方法
研究植物细胞中钙调素 (CaM)的分布对揭示 CaM的作用位点有重要意义。前人采用不同植物、
不同组织以及不同的研究方法得出的 CaM分布情况存在一定差异 ，而关于植物绿色组织 中 CaM的定
位研究更少。本研究采用免疫胶体金电镜技术对无土育苗法培育的黄瓜幼苗叶肉细胞中的 CaM进行
定位。免疫电镜技术参照张丰德等⋯的方法并改进 ：取第 3片真叶 (约 2 cm X 2 cm)中部的组织块
(0．5 InIl X l nln1)，迅速投入 0．05 mol／L的磷酸钠盐缓冲液 (PBS，pH 7．2)配制的 2．5％戊二醛与 2％
多聚甲醛组成的混合固定液中，抽气，室温 (22％)下固定 l h，再于 4c【二固定 4 h。漂洗，乙醇梯度
脱水后 ，用低温水溶性包埋剂 I．~wicryl K4M置换、渗透 、聚合。制备超薄切片，进行 CaM的免疫金染
色。阻断液为 0．02 mol／L PBS(pH 7．2)配制 的 4％BSA (德国 B．M．公司产)，室温下阻断 2 h。用
0．02 mol／L的 PBSB (0．02 mol／L PBS，0．5％ BSA)稀释 I抗 (兔抗小麦 CaM血清 ，河北师范大学生物
系细胞室制，工作浓度 l：60)，在 I抗液滴上室温孵育 1．5 h，对照切片用 0．02 mol／L的 PBSB代替 I
抗 ；Ⅱ抗为胶体金标记的羊抗兔 lgG (北京中山生物技术有限公司，粒径 l0 DATI，工作浓度 l：100)，
载网于 Ⅱ抗液滴上室温孵育 30 min。洗涤 ，醋酸双氧铀染色，JEM—IOOSX型透射电镜下观察。
2 结果与讨论
2．1 固定剂和包埋剂的选择
电镜观察结果表明：在未加 工抗的对照切片中，很难找到金颗粒 (图版，1)，而在 I抗处理过的切
片中看到有一定量的金颗粒分布 (图版 ，2～4)，这说明处理切片中的金颗粒是 CaM存在的真实反映。
利用免疫胶体金电镜技术的关键是能否使植物材料抗原性和超微结构保存 良好，其中抗原性的保
存最为重要 ，因此要选用合适的固定剂和包埋剂。一般选用较柔和的固定剂⋯，如本研究选用的戊二
醛和多聚甲醛。戊二醛对超微结构保存较好 ，而多聚甲醛对抗原性的保存优于戊二醛。避免使用四氧
化锇 ，防止抗原性的丧失。但是由于戊二醛和多聚甲醛只对碳水化合物和蛋白质保存较好，对脂类的
保存效果较差 J¨，在一定程度上影响了细胞内膜系统的清晰度。另外，常规树脂包埋由于高温聚合常
使一些组织抗原性部分或全部丧失 ，环氧树脂中的环氧基可能改变某些抗原的性质。因而选择采用低
温水溶性包埋剂 kowieryl K4M更有利于抗原活性的保存⋯，但 kowicryl K4M对超微结构保存不利。同
收稿 El期：2002～10—09；修回 El期：2002—12—06
基金项目：河北省 自然科学基金资助项 目 (397145)
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6期 田景花等：黄瓜幼叶细胞 中钙调素的免疫胶体金定位
时 ，醋酸双氧铀对膜结构的染色效果较差，也影响了图像的反差和清晰度 ，但采用双染法易生成铅
沉淀污染切片而干扰金颗粒的观察。本研究着重采用了适宜保存抗原性的固定剂和包埋剂 ，结果表明
对抗原性保存 良好，用低浓度的 I抗 、Ⅱ抗和较短的反应时间就能观察到较多的金颗粒 ，结果的可信
度更高，而细胞中以脂类为主要成分的膜结构清晰度较差，反差较弱，但不影响各亚细胞结构的准确
辨认 。
2．2 黄瓜幼叶细胞中 CaM 的分布
适宜生长温度下的黄瓜幼叶叶肉细胞中，显示 CaM存在的金颗粒主要出现在细胞核和叶绿体中，
细胞核中 CaM 主要存在于染色质和核仁中 (图版 ，4)，叶绿体中的 CaM 主要存在于类囊体膜上 ；线
粒体中也有一定量的 CaM 存在；而细胞质 、液泡、液泡膜及质膜上金颗粒密度很小 (图版，2～4)；
细胞壁和细胞间隙却很难发现显示 CaM 存在的金颗粒 (图版，3)。此研究验证了前人用其他方法得
到的部分结果 ，但也存在一些差异 ，如 Dauwalder等 j采用免疫荧光法发现燕麦黄化苗中的 CaM 在胚
芽细胞的细胞质和核质以及根冠细胞的造粉质体上均有标记物荧光 ，但未能在细胞壁及核仁中观察到
阳性荧光。李家旭等 ]利用免疫胶体金电镜技术以锇酸后固定 ，Epon812做包埋剂定位了玉米根尖细
胞中的 CaM ，发现在根冠细胞的细胞核 、线粒体 、质膜内侧以及造粉质体的淀粉粒等部位均标记有金
颗粒 ，细胞壁上也标记有少量金颗粒。Muto j以生化方法测得小麦叶细胞中 CaM 大部分存在于细胞
溶质 ，只有小部分存在于线粒体 、叶绿体和微粒体中。笔者认为这些差异一方面可能是由于不同试验
方法的局限性造成的，另一方面可能是由于不同的植物材料或组织 中 CaM 分布的确存在差异。这也
意味着 CaM 可能与不同植物材料或组织特定的生命活动密切相关，如根尖细胞 的细胞核和线粒体中
有一定量的 CaM 分布 ，可能与根尖细胞的旺盛分裂及呼吸作用有关；而黄瓜幼叶细胞的主要功能是进
行细胞分裂和光合作用，在其细胞核及叶绿体中有较多的 CaM 分布，可能是 CaM 参与细胞分裂及光合
作用的直观证据；线粒体中的 CaM分布应该与幼叶旺盛的呼吸作用有关；细胞溶质中 CaM浓度很低，
其功能可能是通过直接影响其靶酶活性或通过对蛋白质磷酸化过程的控制来调节细胞生理过程；而质膜
及液泡膜上的 CaM 可能对维持细胞溶质内低 Ca2 水平有重要意义。
参考文献：
1 张丰德 、王秀玲 ．现代生物学技术 天津：南开大学出版社，2001 52—74，107 114
2 Dauwalder M， Roux S J， Hardison L．Distilbution of calmodulin in pea seedlings： immunocytcchemical lcw_alization in plumules and root apices
Planta、 1986． 168：46l～470
3 李家旭 、刘杰文，孙大业 ．玉米根尖细胞内钙调素的胶体金免疫电镜定位 ．植物生理学通讯 ，1989，(6)：44—45
4 Muto S．Distribution of calmodulin wit}1 wheat leaf cells．FEBS I七tt ． 1982．】47： 16】～】64
Immunity Coloidal Gold Localization of Calmodulin in Cucumber Young Leaf
Cells
Tian Jinghua，Zhang Hang，Li Ming， and W ang Mei
(Colege ofHorticulture，Hebei Agricultural University，Baoding 071001，China)
Abstract： Using glutaraldehyde an d parafonnaldehyde as fixative an d Lowicryl K4M as embedding medium，
the immunity colloidal gold localization of calmodulin (CaM )in cucun~er young leaf cells Was investigated by
transmission electron mi croscope． The results were as follows： at the optimal growth temperature， CaM mainly dis—
tributed in nucleus an d chloroplast． In addition， there Was some CaM in mitoehondria， a little in cytoplasm， vac—
uole，tonoplast an d plasma membrane． However， it Was difficult to find CaM in cell wal an d intercelular space．
Key words： Cucumber； Calnlodulin； Immunity colloidal gold；Transmi ssion electron mi croscope
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730 园 艺 学 报 30卷
图版说明 黄瓜幼叶细胞 中钙调素的免疫胶体金定位 1．不加 I抗的对照切片 (15000×)；2．叶绿体 、线粒体及细胞质 中 CaM的
分布情况 (24000×)；3 叶绿体 、液泡 、细胞质 、细胞壁及细胞间隙中 CaM的分布情况 (21000×)；4．细胞核 、细胞质及液泡 中
CaM的分布情况 (13200×) v：液泡；Ch：叶绿体；N：细胞核；W：细胞壁：Is：细胞间隙；Mt：线粒体；cp：细胞。
Explanationofprates Theinmmnity colloidal鐾o localiTation ofCaM in cucunlber youngleaf cells 1．The sectiontreatedwithout antibody
l(15000×) 2．The distribution of CaM in Ch，Mt and Cp (24000×)．3．The distilbution of CaM in Ch．V，Cp，W and Is(21000×)．
4 The distilbution of CaM in N，Cp and V (13200×) v：vacuole；Ch：chloroplast；N：nucleus；W：wal；Is：intercelular s1)ace；Mt：
mitochondila； Cp：cytoplasm．
美国园艺学会 (ASHS)百年盛会情况简介
美国园艺学会百年盛会于 2003年 l0月 3～6}j在美国 Rodhe Island州首府 Providence举行。来 自世界 34个国家和地
区的近 2O00名注册代表赴会 ，其中中国大陆有 2名代表 ，中国农 业大学食 品科学 与营养工程学院生吉萍老师和南京
农业大学园艺学院在读博士生史公军参加了此次会议 。会议共交流论文 800余篇 ，其 中大会报告 293篇 ，墙报 507篇 ，
中国代表被录用的论文 l6篇，涉及园艺作物种质资源与遗传育种、生物技术 、采后及发育生理等领域 ，有些研 究成
果居国际领先地位。会议共分为 1个大会报告 、4个专题报告会 、26个专题研讨会 、27个工作组会议及 50场分专题
报告会 ?此次大会报告的主题是气候变化对园艺作物的影响及相应科研和教育策略的制定。大会还评选 出了 3名 2003
年度 ASHS基金获得者，5篇年度最佳论文，6名优秀教育及科研工作者 ，31名优 秀本科生。此外会议 还组织安排了
会前及会后 6个专业参观。
南京农业大学园艺学院
史 公军
2(x】3．】0．26
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