全 文 ：园 　艺 　学 　报 　2002 , 29 (2) : 100～104
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2001 - 07 - 16 ; 修回日期 : 2001 - 10 - 12
基金项目 : 山东省自然科学基金资助项目 ( Y97D13072)3 通讯地址 : 莱阳农学院园艺系 , 265200。
苹果柱型基因 Co 的一个 AFLP 标记的 SCAR转换
王彩虹1 ,2 3 　王　倩3 　戴洪义2 　田义轲2 　贾建航3 　束怀瑞1 　王　斌3
(1 山东农业大学园艺系 , 泰安 271018 ;　2 莱阳农学院园艺系 , 莱阳 265200 ;　3 中国科学院遗传研究所 , 北京 100101)
摘 　要 : 将苹果柱型基因的一个 AFLP标记成功地转换成了简单实用的 SCAR 标记。首先对 AFLP 标记
片段进行序列测定 , 然后根据序列特点设计了两对特异引物 CoA1/ CoA2 和 CoA1/ CoA3 , 每条引物长 20 bp。
PCR 结果表明 CoA1/ CoA2 可以扩增出 216 bp 和 148 bp 两条带 , 其中 216 bp 的为柱型性状的特征带 ; CoA1/
CoA3 可以扩增出 273 bp 和 205 bp 的两条带 , 其中 273 bp 的为柱型性状的特征带。两对引物在杂交后代中扩
增出的特征带与柱型性状的分离重组率都很低 ( CoA1/ CoA2 为 6. 3 % ±2. 5 % ; CoA1/ CoA3 为 7. 3 % ±
2. 6 %) , 所以它们都可以作为该 SCAR 标记的特异引物所用。
关键词 : 苹果 ; 柱型基因 ( Co) ; AFLP标记 ; SCAR 标记
中图分类号 : S 661. 1 　　文献标识码 : A 　　文章编号 : 05132353X (2002) 0220100205
苹果的柱型性状是与树型有关的一个优良性状 , 很适合矮化密植栽培。研究已表明 , 柱型性状是
受显性单基因 ( Co) 控制的质量性状〔1〕。所以 , 柱型苹果是进行苹果株型育种的一个重要的基因资
源。我们已经用BSA (bulk segregant analysis) 法筛选到了一个与 Co 基因连锁较为紧密的AFLP (ampli2
fied fragment length polymorphism) 标记 A〔2〕, 并获得了该标记片段的克隆〔3〕。但是 AFLP 标记程序复杂 ,
试剂价格昂贵 , 放射性同位素的使用往往会对人体和环境造成危害 , 所以很难在育种实践中加以应
用。因此 , 本研究试图对 Co 基因的AFLP 标记A 实施 SCAR (sequence characterized amplified regions) 转
换 , 以期获得简单、廉价、适合大量样品分析的有效标记。
1 　材料与方法
1. 1 　植物材料
苹果品种 : 舞姿 (柱型) 和短枝富士。杂交群体 : 1994 年以短枝富士为母本 , 舞姿为父本进行
杂交 , 1995 年春播种 , 1999 年从 F1 代中以目测法选择柱型和非柱型个体共 96 株 , 其中柱型、非柱型
各 48 株。评判标准 : 柱型 ———树体呈直立圆柱状 , 枝条粗壮 , 节间短缩 , 很少分枝。非柱型 ———枝
条细长 , 与主枝夹角大 , 节间长 , 分枝较多。所有材料均种植于山东省莱阳农学院果树实验站。
1. 2 　方法
基因组 DNA 的提取采用改良的 SDS 法 , 定量用溴化乙锭荧光强度法。
将含 AFLP 标记 A 片段克隆重组子的菌液送上海博雅公司进行测序 , 然后根据测序结果设计合适
的 SCAR 引物。引物的合成也由博雅公司完成。
SCAR2PCR 扩增体系为 : 总体积 25μL , 内含 DNA 模板 25 ng , 0. 5μmol/ L 引物 , 1U TaqE , 1. 8
mmol/ L MgCl2 , 100μmol/ L dNTPs , 10 ×PCR buffer 2. 5μL。TaqE和 dNTPs 均为上海生工产品。扩增程
序 : 94 ℃预变性 4 min , 然后 94 ℃45 s , 52 ℃1 min , 72 ℃1. 5 min , 28 个循环 , 最后在 72 ℃下延伸
5 min。PCR 仪为 MJ29600 型。
重组率和标准误差的计算参考 Yang 等〔4〕的方法。
2 　结果与分析
2. 1 　AFLP标记片段序列的测定
标记片段 A 的碱基序列如图 1 所示。该片段的长度为 346 bp , 内含一个 68 bp 长的重复序列 , 重
复部分之间首尾相接 , 重复频率为 2。在两个重复部分内有一个碱基不同。
图 1 　Co 基因 AFLP标记片段 A的碱基序列
阴影部分为 AFLP 选择性扩增引物位置 , 下划线部分为重复片段
( 3 两个重复片段中的唯一碱基突变) , 黑体字部分为 SCAR 特异引物的设计位置。
Fig. 1 　Base sequence of the AFLP marker fragment A of Co gene
Locations of AFLP selective amplification primers are in the shadow. The repeat parts were underlined
( 3 Indicator of the only one base mutation in these two repeat parts) . The primer positions for SCAR are in bold.
2. 2 　SCAR引物的设计及 PCR特异扩增
根据片段 A 的测序结果设计一对各 20 bp 的
正向引物和反向引物。由于要考虑引物中 GC 碱
基的含量 , 设计引物的位置没有从片段的两个末
端开始 , 而是向片段的中间靠拢了一部分。引物
序列 , CoA1 : 5’ GATCCATCACGACTATCAGG 3’;
CoA2 : 5’TCAACCGGTGTTCACATTTC 3’。
用该对引物在亲本及分离群体中进行 PCR 扩
增 , 发现柱型亲本及柱型后代上出现了 216 bp 的
带 , 而非柱型亲本及非柱型后代却无此带的扩增 ,
说明 216 bp 的条带为柱型性状的特征带 , 可以用
来检测苹果的柱型基因。另外还发现 , 无论是柱
型还是非柱型 , 都有另一条较小的扩增带 , 该带
的大小为 148 bp (图 2) 。分析原因 , 可能有两
个 : 一是与原 AFLP 标记片段的特殊结构有关。
因为在 AFLP 标记片段 A 的碱基序列中包含一个
68 bp 的重复序列 , CoA2 的位置正好在重复片段
之内 , 那么它在标记片段上就有两个结合位点 ,
因而有可能扩增出两个大小不同的片段来。二是
SCAR 标记一般是共显性标记 , 而本研究中所用的
柱型个体又都为杂合体 , 所以也会出现这样的
SCAR2PCR 结果。但是扩增的两个片段大小相差
约一个重复部分的长度 , 那么柱型类型与非柱型
在基因组的该位点的差异极有可能就是这个重复
片段的有与无。为了验证这一猜想 , 在重复片段
外 , 又设计了另一反向引物 CoA3 : 5’TCAAACT2 图 2 　CoA1/ CoA2 在短枝富士×舞姿 F1 分离群体中的扩增图谱M. Marker (pUC Mix Marker) ; P1. 舞姿 ; P2. 短枝富士 ;1～5. 柱型个体 ; 6～9. 非柱型个体。(图中显示为分离群体中的部分个体 , 其它舍去。)Fig. 2 　Amplification of CoA1/ CoA2 in F1 progeny ofspur2type Fuji ×TelamonM. Marker ; P1. Telamon ; P2. Spur2type Fuji ;1 - 5. Columnar individuals ; 6 - 9. Non2columnar individuals.(Several individuals in the progeny were shown in this fig ,others were deleted. )表 1 　SCAR标记在短枝富士×舞姿 F1 分离群体中的共分离分析Table 1 　Co2segregation analysis of the SCAR marker in theF1 progeny of spur2type Fuji ×TelamonSCAR 个体数 Individual number总数Total 柱型Columnar 非柱型Non2columnar r SeCoA1/ CoA2 96 48 (3) 48 (3) 6. 3 % 2. 5 %CoA1/ CoA3 96 48 (4) 48 (3) 7. 3 % 2. 6 %注 : r. 重组率 ; Se. 标准误 ; 括弧内的数据为每一类型内标记与性状表现为重组的个体数。Note : r. recombination frequency ; Se. standard error ; Data in thebracket is the number of individuals with recombination between the markerand the phenotype in each group .
1012 期 　　　　　　　　　　王彩虹等 : 苹果柱型基因 Co 的一个 AFLP标记的 SCAR 转换 　　　　　　　　　　　　
CAACAAATGTAGC 3’, 正向引物仍为 CoA1。CoA1/ CoA3 的扩增图谱与 CoA1/ CoA2 相似 , 但片段大小不
同 (图 3) 。柱型类型上扩出了 273 bp 的特异带 , 而柱型和非柱型也同时扩出了另一较小的片段 , 与
Marker 带的对比表明两个片段之间相差也为一个重复片段的长度。即引物 CoA1/ CoA3 扩出的较小的片
段为 205 bp。这一研究结果进一步证实了原 AFLP 标记片段内的重复部分是产生多态性的根源 , 同时
也确实显示了该 SCAR 标记是一个共显性的标记 , 即杂合体上应同时具有柱型及非柱型的特征带 , 而
纯合体上应只有自己的特征带。
无论是 CoA1/ CoA2 还是 CoA1/ CoA3 , 扩增图谱中较大片段的带只在柱型类型上出现 , 所以可以被
用来区分柱型个体与非柱型个体。可见 , 两种引物组合都可以作为 SCAR2PCR 的特异引物所用。群体
中的测验结果表明 , 它们在判断苹果的柱型生长习性上具有很高的准确性 , 正确率均在 90 %以上
(表 1) 。然而研究中观察到两对 SCAR 引物判断的结果在个体间并不完全吻合 , 这可能是 DNA 片段上
不同位点在减数分裂形成配子时的交换值不同的缘故。
图 3 　CoA1/ CoA3 与 CoA1/ CoA2 在短枝富士×舞姿 F1 分离群体中的扩增图谱比较
M. Marker (pUC Mix Marker) ; 1～8. 扩增引物为 CoA1/ CoA2 ; 9～16. 扩增引物为 CoA1/ CoA3 ;
1～4 , 9～12. 柱型个体 ; 5～8 , 13～16. 非柱型个体。(图中显示为分离群体中的部分个体 , 其它舍去。)
Fig. 3 　Comparison of amplified DNA band patterns between CoA1/ CoA3 and CoA1/ CoA2 on F1 individuanls of spur2type Fuji ×Telamon
M. Marker ; 1 - 8. Amplified by CoA1/ CoA2 ; 9 - 16. Amplified by CoA1/ CoA3 ; 1 - 4 , 9 - 12. Columnar individuals ;
5 - 8 , 13 - 16. Non2columnar individuals. (Several individuals in the progeny were shown in this fig , others were deleted. )
3 　讨论
SCAR 标记是一种十分稳定的分子标记 , 在应用上具有迅速、简便、低成本的特点 , 非常适合于
样品的大量分析 , 已开始在果树的性状筛选和资源研究上得到开发和利用〔5～7〕。SCAR 标记一般是由
RFLP、RAPD、AFLP 等标记转换而来〔8～12〕, 其基本原理是根据已获得的标记片段的序列信息 , 设计
一对长度为 20 bp 左右的特异引物 , 然后通过普通的 PCR 手段来揭示多态性。通常 SCAR 标记转换的
成功率很低〔13〕。RAPD 标记通常为 500～1500 bp , 相对容易转换成快速、稳定的 SCAR 标记〔14〕。但
AFLP 标记片段通常在 150～300 bp 范围 , 不容易设计合适的 SCAR2PCR 特异引物。一般来说 , AFLP
标记的 SCAR 转换中 , 引物的设计应包含酶切位点和选择性碱基。可根据这一原则设计的引物往往不
能揭示任何多态性 , 所以不能直接作 SCAR 标记所用。这种情况 , 有时可通过 PCR 步行的方法分离
AFLP 标记的相邻序列 , 然后根据相邻序列信息设计合适的 SCAR 引物〔15〕。另外 , 对于 PCR 多态性消
失的情况 , 也有借助于限制性酶切 PCR 产物的办法来重新揭示多态性的例子〔16～18〕, 这也是一种快速
简便的方法。分析本研究将AFLP 标记转换 SCAR 标记成功的原因 : 主要是该AFLP 标记片段内完整的
再现了多态性的来源 ———重复序列。对于这类标记 , 很容易将其转换成共显性的 SCAR 标记。但是 ,
在本研究中 , 根据该 AFLP 的序列特点 , 没有将 PCR 特异引物正好设计在片段的末端 , 而是向片段内
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移动了一段距离 , 从而保证了引物中一定的 GC 碱基含量 , 使得扩增时的退火温度不致于降得很低 ,
这就在很大程度上避免了非特异性的扩增。然而 , 当引物的设计不是从 AFLP 片段的两个末端位置开
始时 , 就会造成 SCAR 标记筛选结果与 AFLP 分析不完全吻合。本研究中在个别个体上确实观察到这
一现象。但是我们的主要目的是为了获得能用于育种群体辅助选择的简单标记 , 只要所开发的 SCAR
标记在性状的判断上能达到较高的正确率即可。由于本研究中发展的苹果 Co 基因的 SCAR 标记 , 在
后代群体中的分离重组率较低 (CoA1/ CoA2 : 6. 3 % ±2. 5 % ; CoA1/ CoA3 : 7. 3 % ±2. 6 %) , 所以可用
作苹果柱型性状早期筛选及鉴定的标记。但是对两种 SCAR 引物 CoA1/ CoA2 和 CoA1/ CoA3 来说 , 后者
比前者的扩增片段大 , 电泳条带在胶上也距离 RNA 较远 , 便于观察。因此建议在大量样品的快速筛
选时最好选 CoA1/ CoA3 作为 SCAR 标记的引物。
另外 , 本研究所用群体的非柱型亲本是一种短枝型品种 , 杂交后代有柱型、非柱型及二者之间的
过渡类型 , 为了保证分析结果的可靠性 , 柱型和非柱型材料一定要选取极端类型。祝军等〔19〕直接用
柱型芽变品种威赛克旭与原始品种旭为试材来进行 Co 基因分子标记的筛选 , 理应是一种很好的方
法 , 但是由于个体间的差异和地理上的演化 , 这样获得的多态性片段最终还需要经过群体上的验证才
能说明问题。从遗传特性来看 , 群体的构建 , 最好选用柱型品种和非柱型品种来杂交 , 以避免后代分
离复杂的状况。
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Development of a SCAR Marker Linked to Co Gene of Apple from an AFLP
Marker
Wang Caihong1 ,2 , Wang Qian3 , Dai Hongyi2 , Tian Yike2 , Jia Jianhang3 , Shu Huairui1 , and Wang Bin3
(1 Department of Horticulture , Shandong Agricultural University , Tai’an 271018 , China ;　2 Department of Horticulture , Laiyang Agri2
cultural College , Laiyang 265200 , China ;　3 Genetic Institute of Chinese Academy of Science , Beijing 100101 , China)
Abstract : In this study , an AFLP marker of Co gene of apple was converted into a SCAR marker successful2
ly. After sequencing of the AFLP marker fragment , two pairs of primers CoA1/ CoA2 and CoA1/ CoA3 were designed
according to the nucleotide sequence. PCR results from apple genomic DNA showed that CoA1/ CoA2 could amplify
two bands with the size of 216bp and 148bp respectively , and the one of 216bp was the character band of columnar
phenotype ; CoA1/ CoA3 could amplified two bands too , and the size was 273bp and 205bp respectively , the former
one was the character band of columnar phenotype. Both of the two pairs of primers have high correct rate in judg2
ment of columnar growth habit ( > 90 %) , so either of them can be served as special primers of this SCAR marker
for rapid selection.
Key words : Apple ; Columnar gene ( Co) ; AFLP marker ; SCAR marker
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