全 文 ：园 艺 学 报 2003，30(4)：404 408
ABta Hort／cultume Si碰ca
转反义 扭豫 1基因番茄采后生理特性的研究
杨虎清 应铁进 向庆宁2 杜荣茂
( 浙江大学食品科学与营养系 ，杭州 3113029； 浙江大学园艺系，杭州 31~29)
摘 要 ：转反义 LeETR1乙烯受体基因番茄的采后生理性状与普通番茄不同。转基 因番茄的呼吸作用
受到抑制，呼吸高峰只有对照的52％，乙烯释放高峰的出现 比对照果实推迟 10 d。转基因番茄的叶绿素降
解和番茄红素的合成受到显著抑制 ，果实不能形成正常的红色。在成熟过程中，转基因番茄的纤维素酶、
多聚半乳糖醛酸酶活性显著低于对照，延缓 了果肉的软化。推测 LeETR1和番茄的成熟有着密切的关系。
关键词：番茄；转基因；乙烯 ；成熟 ；色素
中图分类号：S 641．2 文献标识码 ：A 文章编号 ：0513—353X (2003)04-1MO4-05
乙烯是植物调控自身生长发育、成熟衰老的激素，在水果蔬菜的成熟衰老过程中起着重要的作
用。乙烯的生理作用是通过它的感受和信号转导来实现的，其作用机理一直是采后生理学研究的热
点。20世纪 70年代末，杨祥发等阐明了植物体内乙烯的生物合成途径⋯1，其生物合成机理得到广泛
深人的研究 I3 J。90年代以来，乙烯信号转导研究取得了进展[4,53，在模式植物拟南芥建立了 C2H2一
ETR— CTR— EIN2一 EIN3一 ERF一 生化反应的模型 83。但在果实成熟衰老研究的模式材料番茄
中，乙烯信号转导的研究还不够深入，到目前为止只分离出了乙烯受体基因 LeETR(1-5)及负调节因
子 CTR 引，其生理功能还远远没有被人们所认识。我们在研究 LeETR1基因序列【93的基础上，克隆
LeETR 1基因部分特异序列，构建反义 LeETR 1植物表达载体 ，利用农杆菌介导法进行遗传转化并获得
了反义转基因植株。研究 LeETR1的表达受到抑制后番茄果实的采后生理表现，将有助于认识 LeETR1
在番茄果实成熟衰老过程及乙烯信号转导途径中的作用和生理功能，以便阐明果蔬成熟衰老机制和乙
烯作用机制
1 材料与方法
转反义番茄乙烯受体基因 LeETR1(GeneBank acces No．U41103)的番茄纯合体株系，由浙江大学
食品科学系采后生物技术实验室提供。所用植株均使用灭菌的商品腐殖质在标准人工气候室中盆栽。
呼吸速率测定：从花开放之13起挂牌标记，在果实绿熟时选花期相同、位置相同的果实采收，在
室温 (20qC)下后熟。采用 GXH一305型红外线 co2分析仪测定果实呼吸速率，结果以 co2 mL·h_1·
FM表示 ，重复 3次。
乙烯释放量测定：采果取样同上。果实在20012密闭 1 h后抽取 1 mL气样，用 SP6800气相色谱仪
(山东鲁南华工仪器厂)测定乙烯含量 ，重复 3次。气谱条件 ：氢焰离子化检测器，GDX502填充柱 ，
载气、燃气 、助燃气分别为 N2、H2和空气，柱温 100~C，检测温度 100~C，进样温度 120~C。
果实硬度测定：各个成熟期的番茄果实每次测定分别取 3个，用 TA—XT2i型质构仪测定果实赤道
线上相对 4个部位的硬度。探头直径 5 nlnl，测试深度 6 nlnl，贯人速度 1 mln／s，读取最大值。取平均
值，单位为牛 (N)。
果实色素测定：各个成熟期的果实每次测定分别取3个，将果壁切成豌豆大的小块，立即以液氮
收稿 日期：2002—09—02；修回日期 ：2003—01—13
基金项目：国家 自然科学基金资助项目 (39870512)
*通讯作者，E-mail：tjying@hzcnc．cola
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4期 杨虎清等：转反义 LeETR1基因番茄采后生理特性的研究
速冻，保存于 一70~(2冰箱。检测时取 5 g研磨，取 1 g匀浆。参照 Kirk~B]的方法，以己烷丙酮混合试
剂 (60：40)提取匀浆中的色素，以空白溶液做对照，用扫描分光光度计测定消光曲线，读取 OD45o、
OD5o2、OD645和 OD663，计算提取液中的有关色素含量。
纤维素酶 (Celulase)活性测定u J：取 5 g果壁组织研磨，以 1．3％羧甲基纤维素 (Sigma)为底
物，30~(2下保温 60 min，以煮沸的酶液做对照，一个酶活力单位为每克果肉每分钟内测试体系粘度下
降1％，以U·min ·g FIⅥ表示。多聚半乳糖醛酸酶 (PG)活性测定 ]：取 5 g果壁组织研磨。以
1％柑橘果胶 (Sigma)为底物，30~(2下保温 60 min，以煮沸的酶液做对照，一个酶活力单位为每克果
肉每分钟内测试体系粘度下降 1％，以U·min ·g FIⅥ表示。果胶甲酯酶 (PME)活性测定 6]：取5
g果壁组织研磨，以0．5％柑橘果胶 (Sigma)为底物，用 0．01 mol·L NaOH滴定 ，30 min内维持 pH
7．0，一个酶活力单位为每克果肉每分钟底物释放 H 1 txrnol，以 U·min ·g FM表示。
2 结果与分析
2．1 番茄果实呼吸速率和乙烯释放量的变化
从图 1可看出，对照番茄在破色 (指果实花萼端出现第 1丝红色)后 5 d出现呼吸高峰，此时的
呼吸速率高达8．59 n1L·h ·kg FM；转基因番茄在破色后 15 d达到呼吸高峰，峰值仅相当于对照的
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破色后天数Time after breaker(d)
图1 番茄果实呼吸速率、乙烯释放量和硬度的变化
MG：绿熟期；BK：破色期。
． 1 Change offruit respiratory rate。ethylene
production and firmness
MG： Mature green； BK： Breaker stage．
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破色后天数Time after breaker(d)
图2 番茄果实色素物质变化
MG：绿熟期 ；BK：破色期。
． 2 P~meat clmtent oftomato fruit
MG：Mature green；BK：Breaker stage．
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园 艺 学 报 30卷
52％。对照番茄的乙烯释放量在采后迅速上升，破色后 5 d达到最大，之后又迅速降低；转基因番茄
的乙烯释放变化较为缓慢，乙烯释放高峰在破色后 15 d出现 ，为 4．82 ·hI1· FIⅥ，相当于对照
果实的 77％。
2．2 番茄果实色素物质变化
从图 2可以看出，对照未成熟果实的叶绿素含量为 45．14 tg·g—FM，转基因未成熟果实的叶绿素
含量为 42．68 tg·g～FM，两者无显著差异。但在成熟过程中，对照果实的叶绿素含量在破色后迅速下
降，到破色后 5 d仅有 4．22 g·g FM；而转基因番茄的叶绿素降解十分缓慢 ，在破色后 21 d仍然有
4．12 tg·g— FM。对照番茄在破色后番茄红素和类胡萝 卜素的含量急剧上升，在破色后 15 d达到最大
值 ，外表呈现正常的红色；转基因果实在破色后
30 d，番茄红素的含量只相当于对照的27．2％， i
外表呈现桔黄色，番茄红素的合成受到显著抑制。
2．3 番茄果实硬度变化 懈trot·i
从图 1可见 ，对照果实在破色后果肉硬度均
迅速下降，到破色后 10 d，果肉硬度只有绿熟期 呈
的20．8％；转基因果实的硬度下降比对照缓慢， 趸
到破色后 30 d其硬度仍达 4．30 N，二者之间的差
异达显著水平 (P<0．05)。可见，转基因果实的 一
软化受到抑制。 潆
2．4 番茄果实纤维素酶、PME和PG活性的变化 蓄
纤维素和果胶等物质为植物细胞壁的主要成 蒹 争
分，它与果蔬质地有密切关系。通常在果蔬成熟 一
期间，纤维素酶、PME、PG等活性上升，从而导
致纤维素 、原果胶等物质逐步水解，水溶性果胶
增加 ，致使果蔬组织软化L¨J。从图 3可知，采后
番茄果实纤维素酶活性均呈先升后降的趋势，对
照果实在破色后 10 d时纤维素酶活性达最高值，
为46．14 U·min ·g FM；转基因果实纤维素酶 嚣
活性在破色后21 d才达到最高值，且高度低于对 垂
照，二者之间差异达显著水平 (P<0．05)。对照 _、
番茄和转基因番茄的 PG酶在采后都呈上升趋势，
转基因果实 PG酶活性低于对照，上升速度也较
对照慢，二者之间差异显著 (P<0．05)。对照番 一
茄和转基因番茄 PME活性一直在 1．5～3．0 U· 一
min ·g FIⅥ之间波动，二者酶活性之间无显著 ．
差异 。
3 讨论
破色后天数Time after breaker(d)
3 果实纤维素酶、PME和 PG活性的变化
MG：绿熟期；BK：破色期。
3 Change of celulase。PME and PG戤蛐
MG：Mature gieefl；BK：Breaker stage．
LeETR1是用拟南芥 ETR1的 cDNA为探针 ，从番茄叶片离层 cDNA文库 中筛选得到的一个 ETR1
的同源基因[引。LeETR1编码产物的氨基酸序列与 ETR1有 81％的同源性。它同 ETR1一样有 3个功能
结构域 ：乙烯结合／感受域 (sensor)、组氨酸激酶域 (histidine kinase)和反应调节域 (response rcgul~．
tor)。资料表明，LeETR1在番茄组织呈组成性表达[6l。
我们应用反义基因技术对 LeETR1实施 “基因封闭”，获得了 LeETR1表达受到抑制的转基因番茄
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材料 ，研究它们的采后生理表现，将有助于认识 LeETR1在果实成熟衰老过程及乙烯信号转导途径中
的作用和生理功能。本研究发现 LeETR1被封闭以后与对照番茄有明显的不同：(1)成熟推迟；(2)
番茄红素的合成受到显著抑制 ，果实没有表现出正常的红色果皮； (3)果实推迟软化。而 Catherine
等[18J报道，转入反义 LeETR1基因以后番茄的着色和软化未受影响。不一致的结果可能是因为转入反
义 LeETR1基因的片段不同或者外源片段插入的位点不同造成的。一般认为乙烯调节果实成熟是通过
协同成熟过程中相关基因的表达实现的，如提高呼吸速率与乙烯 自动催化产量 ，加快叶绿素分解 ，促
进类胡萝 卜素合成 ，增强细胞壁水解酶活性等 引¨。本研究中，转基因番茄的乙烯生物合成途径并没
有受到阻断，它的最高乙烯释放强度相当于对照番茄的77％，但乙烯释放高峰却比对照果实推迟了
10 d。因此，转基因果实推迟成熟可能是由于对乙烯信号的感知受到损害，降低了果实对乙烯的敏感
性，进而延缓了一系列与成熟有关基因的正常表达。据此，可以推测 LeETR1在番茄成熟过程中起着
重要的作用。
参考文献：
l Adams D0，YangSF．Methioninemetabolism in appletissue： implication ofS-adenosylmethioninefit8 anintermediatein the conversion of r 0n—
ine to ethylene．Plant Ph ysio1．． 1977．70：ll7～ 123
2 Olson D C，Wh J A，Edelman L， et a1．Diferential expression of two genes for 1-aminicycl~propane-1-carboxylate synthase in tomato fruits．
Proc ．Nail．Acad．Sci．UsA．．199l，88：534o～5344
3 Theolngis A．One rotten appte spoilsthe whole hushel：themle of ethyleneinfruit ripo~ng ．Cell， 1992，70：181～184
4 Cl1ang C，Kwork S F，Bleecker A B，et a1．Arobidopsis ethylene response gene ETR1：similarity of product to two—c0I 0nent re at0r．Sci—
ence，l993．262：539
5 Kieber J J，RothenbergM，Roman G，eta1．CTR1，a negative r~ torofthe ethylene response pathwayin Arab／dops／s，encodes a nleITlberof
the raffamilyof protein kinase．Cel1．1993．72：427
6 SchallerG E，BledckerA B．Ethylene—binding sites generatedin yeast expressingthe ArabidopsisETR1 gene．Science， 1995．270： 1809—181l
7 SakaiH，Hua J，ChenQG，eta1．ETR2isan ETR1一like geneinvolvedin ethylene si a】ingin Arab／dops／s．PNAS，1998，95(1O)：5812～
5817
8 Hua J，MeyerowitzEM．Ethylene responses ale negatively regulated by a receptor genefamilyin Arab／dops／sI]l~iana．Cel，1998，94(2)：261
～ 27l
9 21wu D，Kalaitzis P， Mgttoo A K，et al 111e mRNA for an ETR1 homologue in tomato is constitutionally expressed in vegetative and repreduetive
tissues ．Plant Mo1．Bio1．．1996．30：1331～1338
10 Zhou D，Mattoo A K，Tucker M L．Molecular cloning of a tomato cDNA encoding an ethylene receptor．Plant Physio1．， 1996， 110： 1435
ll Lashbrook C C，Tieman D M，Klee H J．Diferential re{ lati0n of the tomato ETR gene family throughout plant development．Plant J．， 1998，
15：243～252
12 Tieman DM，KleeH J．Diferential expression oftwo novell~mbel$of thetomato ethylene-receptorfamily．Plant Physio1．，1999，12o：165～
172
13 Davis BH． Chemistryand biochemistryof plant pigments．In：G00dwin TW ed ．London： Academic Press． 197 6．38～165
14 Elena D C，Alan B B．Pedicel break—s gt|l andcellulase gene expression during tomatoflower abscission．Plant Physio1．， 1996， 111：813～
82o
l5
l6
l7
l8
TaylorM A， Rabe E， DoddM C．Efect of storageof regimes on pectolyic enzyn3~s，pectic substances ，internalconductivity and gel breakdownin
cold stored Songold plume．J．Hort．Sci，1994，69(3)：527～534
Artes F，CdtnoA，FernT．Pectolytic elzylne activity duringintermitent warning storageof peac}les．J．FoodSci．，1996，61(2)：311—313
FuscgerR L，Bennett A B． Roleof cel wall hydrolasesinfruit repening ．Annu．Rev．Plant Physio1．PlantMo1．Bio1．，1991，42：675—703
Catherine A W， Nicholas N L， Ch en L W， et a1． Delayed abscission and shorter intemedes correlate with a reduction in the ethylene receptor
LeETR1 transcript in∞msgeIlic tomato．Plant physio1．，2002， 128：978—987
19 Ray J，Pieton S，Shabbery J．Molecular biologyof fruit riponing anditsmanip~ation with antisense genes．PlantMo1． Bio1．，1992．19：49—
87
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园 艺 学 报 30卷
Characters of Postharvest Physiology of Antisense LeETR 1 Transgenic Tomato
Fruits
Yang Huqing ，Ying Tiejin ，Xiang Qingning2，and Du Rongmao
( Department ofFood Science and Nutrition，Zhejiang Unirersity，Hom~hou 310029，
University，Hangzhou 310029，China)
Abstract： In this paper we studied the post—harvest physiology of antisense LeETR 1 transgenic tomato fruits．
Respiratory rate of transgenic fruits was signifcantly lower than contro1． Ethylene production peak of transgenic
fruits appeared 10 d after contro1． Chlorophyl degration an d lycopene biosynthesis Was inhibited in transgenic
fruits．After 30 days in normal room，transgenic tomatos eventually developed an orange colour but never turned
red．During the course of ripening，celulase and pely~acturonase activity of transgenie fruits welB signitieantly
lower than control and the firmness of transgenic fruits declined more slowly．These datas suggest that LeETR1 Was
closely correlated with the ripe ning of tomato fruits．
Key words：Toma to； Transgenic； Ethylene；Ripening；Pignent
五味子的净光合速率及其 日变化
李爱民 王玉兰 李昌禹 (中国农业科学院特产研究所，吉林132109)
Net Photosynthetic Rate and Its Diurnal Variation of Sch／sandra ch／nens／s Baill
Li Aimin，Wang Yulan ，and Li Changyu (The Institute of Special Economic Animal and Plant，Chinese Academy of
Agricuhural Sciences，Jilin 132109，China)
关键词： 味子 ；净光合速率
中图分类号：S 66 文献标识码：A 文章编号 ：0513—353X (2003)04-0408-01
五味子 (Schisandra chinensis BMl1)是天然分布于我国东北的野生木质藤本果树 ，现已引入栽培，其果实既可入药
又可加工成果酒和果汁。本试验于 2002年 8月 l9～20日在中国农业科学院特产研究所五味子人工栽培园进行。材料
为 4～5年生无性系结果树 ，株行距 l m×2 m，篱架栽培。在 1．5 m高度架面上选择 4个侧枝，利用美 国 LI-COR公司
产的LI一6400型便携式光合作用测定系统，从当日6时到 l8时每小时对 6～7节位叶片测定 1次光合速率 (Pn)；在同
一 时间内，对新梢不同节位 、不同类型枝蔓、不同种质叶片进行 Pn测定比较。
测定结果表明，从新梢基部起 l～l3节位叶片的 Pn由 4．35(C02 tanol·IlI2·S～，单位下同)依次递增到 6．50，
l5～l9节位由 5．90依次递减到 4．56。分析其原因是，l～l3节位叶片属于成龄叶片，叶龄由下至上依次减小 ，而生理
活性依次增强 ，所以 Pn呈递增趋势 ；l5～l9节位叶片尚处发育期，叶龄由下至上依次减小，而生理活性也依次减弱 ，
所以 Pn呈递减趋势。
五味子叶片 Pn的日变化呈双峰曲线。6～l1时随着气温和光照的增强，Pn由2．50增加到 8．25；l1～14时依次递
减到5．40，到 l5时出现次高峰 (6．52)，以后随气温和光照的减低，Pn呈下降趋势，18时为 2．60。
多年的栽培实践证明，五味子 1年生枝随长度的增加其结果性能也明显增强。测试结果表明。同一节位叶片的营
养枝 Pn(4．78)比结果枝 (3．84)高，长枝 (4．82)比短枝 (2．9r7)高。
五味子是耐阴喜光植物，大多数种质在高温和强光条件下叶片发黄 ，但有少数种质在高温和强光下叶片呈绿色至
浓绿色 ，Pn为 10．16～13．67。抗光性强弱与其 Pn密切相关，直接影响栽培产量的稳定性 ，在今后的育种工作中应注
重抗光性状的选择。
收稿 日期 ：2003—01—23；修回日期：2003—05—16
基金项 目：占林省科学研究计划项 目 (2000．12)
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