全 文 ：园 艺 学 报 2003，30 (6)：687～689
Acta Horticulturae Sinica
马铃薯 X病毒的 RT．PCR检测
孙 琦 张春庆
(山东农业大学农学院，泰安 271018)
摘 要 -通过对 “一步法”RNA提取方法的改进 ，简化 了提取程序 ，并保证了 RNA的质量。根据马铃
薯 x病毒 (PVX)基 因序列设计合成 了一对特异性 引物，运 用反转 录 PCR (RT-PCR)对 PVX-RNA进行扩
增 ，成功得到了与预期大小相一致 的 308 bp片段 ，而对照未得到任何产物 ，同时对反转录酶 AMV用量做 了
不同的处理 ，得出 AMV仅用 1u仍能得到较好扩增 的效果。从而建立了经济简便的 PVX的 RT-PCR检测体
系 ，为 PVX的防治 、脱毒苗的检测提供有效手段。
关键词 ：马铃薯 x病毒 ；病毒；检测 ；反转录 PCR
中图分类号 ：S432．4 1；S 532 文献标识码 ：A 文章编号-0513—353X (2003)06-0687—03
马铃薯 x病毒 (potato vims X，PVX)严重危害马铃薯生产 ，其 自然传播主要依靠种薯和介体，
主要症状是轻型花叶 ，病叶稍有波纹，小叶片上有大小不等、形状不规则的黄绿色斑驳u J，可引起种
薯大量减产，品种严重退化。近年来，马铃薯脱毒苗的生产为病毒的控制起到 良好的作用。然而寻求
一 种好的病毒检测方法将对脱毒苗的检测和该病毒的控制起到重要作用。
植物病毒的检测除传统的免疫学方法l2-3]以外 ，近年来发展的反转录聚合酶链反应 (RT-PCR)方法
因其具有灵敏、快速、特异性强等优点，在植物病毒的检测上显示出强大的优势L4J。自 1990年起，国内
外已相 继 用 RT．PER方 法 检 测 了多 种 病 毒，如：马铃 薯 Y病 毒 (P、吖)【4．5 J、马 铃 薯 卷 叶病 毒
(PLRV)~6_7]、马铃薯纺锤块茎类病毒 (PSTVd)(8]等，但是对 PVX病毒的检测报道还很少。因此本试验设
计了一对特异性外壳蛋白 (CP)基因引物，建立了一个经济简便的 PVX的 RT．PER检测体系。
1 材料与方法
1．1 材料
PVX毒源 (山东分离物)由山东农业大学生命科学学院提供；其他分子生物学试剂购于大连宝生
物工程有限公司与上海生工生物工程技术有限公 司。用 PVX毒源接种感染寄主植物烟草 ，发病后用
于病毒 RNA的提取检测 ，同时以未接种的健康植株为对照。
1．2 方法 一
1．2．1 总 RNA的提取 采用异硫氰酸胍一酚氯仿一步法，并在此基础上进行改进。称取 0．15～0．2 g
材料放于预冷的研钵中，加人 500 vL冷冻的氯仿 ，少许石英砂迅速研磨。转移粉末至预冷的离心管中，
加入 500 vL变性溶液 (4 raol·L 异硫氰酸胍 ，25 mmol·L 柠檬酸钠 ，5 g·L 十二烷基肌氨酸钠，1％
巯基乙醇)，用力摇匀。按顺序依次加入 2 raol·L～NaAc 50 vL，酚一氯仿 (1：1)500 vL，混匀，冰浴 15
min。4~C，12000 r／min离心 30 min，转移上清 至一个新 的离 心管 中，加入 等体积 的异丙醇 ，混匀 ，
一 20~C放置 2～3 h或过夜。4~C 12000 r／min离心 25 min，去上清液 ，加人 2O0 变性溶液溶解沉淀，加
入 60 vL NaAe，2O0 vL异丙醇，置 一2o℃ 2～3 h。4~C，12000 r／rain离心 20 min，用 75％的乙醇冲洗沉
淀，然后离心去上清液 ，加入 50止 DEPc·H20溶解沉淀。用 1％非变性凝胶电泳检测 RNA质量 (图 1)。
1．2．2 特异性 引物的合成 对 Marianne等发表的 PVX核苷酸序列【9]与 Morozol等发表的 CP基因序
收稿日期 ：2002—12—23；修回日期 ：2003—03一lO
*通讯作者
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6期 孙 琦等 ：马铃薯 X病毒的 RT-PCR检测 689
节省了试验成本 ，并且能够保证提取质量，因此这个方法是可行的。
同一种病毒有不同的株系或分离物，其基因序列存在一定的差异。应用 RT．PCR方法对同一种病
毒的不同分离物的检测还很少报道。本试验就是由 PVX的几种不同分离物的 CP基因的同源序列设计
一 对特异性引物 ，并且成功检测了 PVX山东分离物。因此推测所设计的引物与扩增的核酸序列对
PVX不同分离物或株系的检测具有一定的广谱性 。但是否如此 ，还有待于进一步试验证明。
RT．PCR方法运用于生产的限制性 因素主要是 AMV比较昂贵，不利于生产应用。本试验所用 AMV
为原来的 1／10，大大降低了试验成本，对于 RT-PCR方法在生产上的推广应用具有重要价值。
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Detection of Potato Virus X by Reverse~ dnscription Polymerase Chain Reaction
Sun Qi and Zhang Chunqing
(／Ig阳nom， Colege，Stmnd~ngAgricuturcd Univershy， Taian 271018， Ch／na)
Abstract： T0tal RNA was extracted with an impmvod one．step method from tobacco leaves infected with potato
virus X (P、Ⅸ )．The mole quality of tested RNA was very good，which indieated that the impmvod method was
very efective and simple． A pair of specific primers were designed and synthesized based on the homologous
nueleotide sequence of diferent isolates of PVX by the reverse transcription an d polymerase chain reaction (RT．
PCR)，a 308 bp DNA fragment was amplified successfuly from PVX of Shandong isolate，and no fragment was
obtained from contro1．With only 1U Reverse Transefiptase XL (AMV)，the am plified resnlt were stil very good．
The resnlts showed that an economical and convenient RT．PCR detection system of Pvx was set up．
Key words：Pvx (Pomto vires X)；Vires；Detection；Reverse transcription and polymemse chain reaction
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